멀티 플렉스 애플리케이션을위한 형광 단백질 유전자 바코드

다음 실험의 전반적인 목표는 포유류 세포를 형광 바코드 인쇄하여 뚜렷한 형광 판독에 의존하는 다중화된 고처리량 생물학적 분석을 향상시키는 것입니다. 이를 위해 레트로바이러스 입자를 사용하여 포유류 세포에서 형광 단백질을 안정적으로 발현시켜 바코드로 만듭니다. 다음으로, 클론 바코드 집단을 얻기 위해 형광 활성화 세포 분류를 수행합니다.

그런 다음 클론 집단을 유세포 분석으로 증폭, 결합 및 분석하여 서로 구별할 수 있으므로 동시에 사용할 수 있는지 확인합니다. 마지막으로, 바코드가 부착된 세포주는 태그가 지정된 분석법으로 형질주입됩니다. 단백질 및 생물학적 활성은 바코드 채널과 구별되는 형광 채널을 사용하여 모니터링됩니다.

이 결과는 고처리량 환경에서 다중화 응용 분야를 위한 포유류 세포의 형광 바 코팅의 유용성을 보여줍니다. 항체 또는 염료의 신중한 보정이 필요한 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 유전적으로 바코드화된 세포주가 확립되면 추가 조작이 필요하지 않으며 관심 단백질이 장기간 발현되기 때문에 생물학적 적응에 추가로 사용된다는 것입니다. 유전적으로 바코드화된 형광 세포주를 표면 분석과 결합하면 수력 처리량 형식에서 생물학적 기능이나 효과를 독립적으로 조사할 수 있습니다.

이 예에서는 형광 유전자 막대 코팅을 사용하여 다양한 바이러스 기질 다중화의 절단을 모니터링합니다. 이 분석은 절단과 관련된 기계를 조사하고 고처리량 약물 발견을 위해 추가로 활용될 수 있습니다. transfection 전날, 10cm 플레이트에 2.5 곱하기 10을 10% FBS가 있는 DMEM의 여섯 번째 Phoenix GP 세포에 파종합니다.

이 패키징 세포주는 트랜스에서 레트로바이러스 입자 형성을 위한 gag 및 pole 단백질을 안정적으로 발현합니다. transfection 당일에는 명시야 현미경을 사용하여 세포를 검사합니다. 세포는 건강해야 하며 transfection에 사용할 단층의 플레이트에 부착되어야 합니다.

다음으로, DNA 형질주입 혼합물을 125마이크로리터의 무혈청으로 준비합니다. DMEM입니다. 3마이크로그램의 수포성 구내염 바이러스 외피 당단백질 벡터, P-C-I-V-S-V-G 및 관심 형광 단백질 유전자를 운반하는 전달 벡터 3마이크로그램을 추가하고, 15마이크로리터의 폴리에테르아민 형질주입 시약을 첨가하고, 혼합하여 다양한 형광 단백질 마커를 운반하는 바이러스 입자를 얻습니다. 선택한 marker를 사용하여 각 transfection을 독립적으로 수행합니다.

각 혼합물을 세포에 첨가하여 배양 형질주입 후 15분 동안 실온에서 배양합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 플레이트를 적체로 배양합니다. 선택적으로 24시간 후에 배지를 7ml의 새 배지로 교체하십시오.

이렇게 하면 세포 건강이 개선될 수 있지만 상층액의 바이러스 부하를 줄일 수 있습니다. transfection 후 48시간이 지나면 피펫터를 사용하여 바이러스 입자가 포함된 상층액을 10ml 주사기로 옮깁니다. 0.20마이크로몰 폴리테트라플루오로에틸렌 필터가 장착되어 플런저를 눌러 여과액을 2밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 분배합니다.

즉시 사용할 수 있도록 2밀리리터의 분취액을 따로 보관하십시오. 남은 바이러스, 스내트 및 부분 표본을 얼음 위에 놓고 영하 80도의 온도로 옮긴 후 6개의 웰 플레이트 시드의 각 웰에서 2.0 - 3.0 곱하기 10 - 5번째 부착 세포에서 2, 9, 3 T 세포를 다음 날 사용합니다. 부착 세포를 transduction하려면 플레이트에서 기존 배지를 제거합니다.

이전에 수집된 바이러스 사인 2밀리리터에 폴리 브레인 밀리리터당 5마이크로그램을 첨가하고 혼합물을 세포에 조심스럽게 첨가합니다. 접시를 퍼포로 밀봉하십시오. 그런 다음 접시를 걸이 양동이에 넣으십시오.

원심분리기: 섭씨 32도에서 120분 동안 1500회 G로 원심분리기. 스핀 후 섭씨 37도와 이산화탄소 5%에서 세포를 배양합니다. 24시간 후 최소 72시간 동안 세포 배지를 교체하십시오.

변환 후. 형질도입 비율을 정량화하기 위해 유세포 분석법으로 형질도입된 세포를 분석할 준비를 합니다. 먼저, 유사한 nont transducted cell line을 negative control로 사용하여 게이트가 올바른 채널에 적절하게 설정되었는지 확인합니다.

파라미터 채널 전압을 설정하여 음의 모집단이 관심 있는 각 형광 축에서 10 값에서 세 번째 값 미만이 되도록 합니다. 다음으로, positive fluorescence에 대한 gate를 negative control의 범위를 넘어서는 이벤트로 설정합니다. 그런 다음 형질도입된 세포를 사용하여 특정 형광 채널에 대한 양성 백분율을 결정합니다.

세포를 100% FBS 1밀리리터를 포함하는 15밀리리터 원추형 튜브로 분류합니다. 그런 다음 행잉 버킷에서 정렬된 모집단을 스핀다운합니다. 로터 원심분리기를 섭씨 32도에서 5분 동안 524배 G로 가열합니다.

스핀 후, 1 밀리리터의 신선한 배지에 세포를 재현 탁 한 다음 6 센티미터 플레이트에 2 밀리리터의 DMEM에있는 6 개의 세포에 10 번 2 배를 파종합니다. 이 농도에서 합류점은 60% 미만이며 최소 2일 동안 성장과 분열을 허용합니다. 세포를 섭씨 37도의 인큐베이터에 며칠 동안 넣어 증폭할 시간을 허용합니다.

클론 집단은 원래 형질도입된 세포 또는 분류된 세포에서 생성될 수 있습니다. 이 단계에서 개별 클론이 아닌 선택한 형광을 기반으로 밀접한 집단을 분류하면 향후 선택을 위한 백업 집단을 보장할 수 있습니다. 필요한 경우, 관심 있는 모집단에 따라 분류하기 위한 게이트를 설정하고, 게이트가 하나 이상의 로그 스케일로 떨어져 설정되어 있는지 확인하십시오. 자동화된 세포 증착 장치를 사용하여 구별 가능한 집단을 얻으려면 단일 세포를 96개의 웰 플레이트로 분류하고, 웰당 평균 1개의 세포가 있다는 점에 유의하십시오.

일부 웰에는 세포가 없을 수 있고 다른 웰에는 둘 이상의 Following이 있을 수 있습니다. 분류, 최소 2주 동안 섭씨 37도에서 세포를 배양하여 개별 클론을 증폭합니다. 현미경으로 세포를 정기적으로 검사하여 증가하는 개체군이 둘 이상의 세포가 아닌 개별 세포에서 발생하는지 확인하십시오.

또한 2주가 지난 후 세포가 과도하게 자라지 않도록 합니다. 유세포 분석법으로 추정되는 클론 집단을 스크리닝하고 이를 음성 대조군 집단과 비교합니다. 진정한 클론 집단은 매우 촘촘한 형광 패턴을 가져야 합니다.

모집단의 평균 강도와 밀집도를 기준으로 가장 뚜렷하게 분리된 모집단을 선택합니다. 필요에 따라 증폭하거나 섭씨 영하 80도에서 10% DMSO가 있는 냉동 매체에 재고를 단기간 동안 보관하거나 액체 질소를 장기간 보관하십시오. 다음으로, 클론 집단이 멀티플렉스 고처리량 스크리닝 시스템에서 성공적으로 사용될 수 있는지 여부를 테스트합니다.

구별할 수 있는 흡수, 방출 스펙트럼 및 또는 다른 강렬을 가진 클론의 세트를 선택하고, 단 하나 관 씨에서 그(것)들을 결합하십시오.50, 분리되는 관에 있는 96의 좋은 판의 각 우물에 있는 보충된 DMEM의 200 마이크로리터에 있는 결합한 세포의 000. 유세포 분석기에서 매개 변수 및 보상 값을 설정하는 데 사용할 수 있는 네거티브 및 단일 색상 컨트롤을 준비합니다.

보정 값을 설정합니다. 그런 다음 샘플을 분석하여 독립적으로 확립된 각 형광 세포주를 구별할 수 있는지 확인합니다. 바코드가 부착된 세포주를 생물학적 응용 분야에 적용하려면 먼저 융합체로 태그 또는 형광 단백질에 결합되거나 내부 리보솜 진입 부위를 통해 결합되도록 설계된 분석 요소를 선택합니다.

Ires는 western blotting 유세포 분석 또는 현미경을 통해 간단하게 검출할 수 있습니다. 여기서 사용되는 시스템은 HIV envelope 단백질을 세포 표면에 발현하여 HA 및 플래그 태그를 노출하는 생물학적 분석으로 구성됩니다. 분석 단백질은 TD 토마토를 발현하는 바코드 세포에서 발현됩니다.

단백질의 절단은 Anti-Flag 항체로 표시된 FSE로 염색하여 모니터링할 수 있습니다. 단백질이 절단되지 않으면 염색이 보이지만 단백질이 절단되면 녹색 형광 표지가 더 이상 뚜렷하지 않습니다. 바코드가 찍힌 세포에서 생물학적 분석을 확립하려면 선택한 분석 원소를 포함하는 바이러스 입자로 형질주입합니다.

선택한 세포에 바이러스성 SUP natin을 추가하고 원심분리로 회전시킵니다. 다음으로, 형광 표지된 anti HA 항체로 세포를 배양합니다. 그런 다음 바코드가 붙은 세포를 분류하여 ha에 대해 양성인 분석 원소가 포함된 세포를 분리합니다.

마지막으로, 별개의 바코드 세포주를 결합했습니다. 각각은 다른 기질을 지닌 분석을 포함합니다. 세포 혼합물을 Anti-Flag 및 ZI 접합 항체와 배양하고 유세포 분석으로 분석하여 단백질의 절단이 발생했는지 여부를 확인하고 분석을 추적하거나 여기에서 유전적으로 바코드화된 뚜렷한 세포주를 구별할 수 있는 적절한 채널에서 집단을 분석 또는 디코딩합니다.

그런 다음 TD 토마토의 PE 채널은 fite 채널에서 분석하여 기질의 특성을 디코딩하여 분비 경로에서 표면 발현 단백질의 절단을 분석할 양성 모집단을 밝힙니다. Sub T 1 세포는 TD 토마토를 발현하기 위해 형광 바코드로 바코드화되고 서로 다른 강도로 3개의 모집단으로 분류됩니다. 그런 다음 각 집단에 다른 레트로바이러스를 형질도입하여 야생형 HIV 외피 단백질, 돌연변이 HIV 외피 단백질 또는 뎅기열 바이러스의 발현을 유도했습니다.

PRM 경계 단백질, 각 측면에는 플래그와 HA 태그가 있습니다. 형질도입된 세포는 anti HA 및 Anti-Flag 항체와 함께 배양하였다. Anti HA staining은 엔지니어링된 분석 단백질의 존재를 확인하기 위해 수행되었으며, Anti-Flag staining은 절단 여부를 확인하기 위해 수행되었습니다.

염색되지 않은 결합 집단을 유세포 분석법으로 분석했을 때, 클론 집단은 TD 토마토 바코드를 기반으로 구별할 수 있었지만 fite 채널은 구별할 수 없었습니다. 대조적으로, 동일한 집단이 flag fite 항체로 염색되었을 때, 한 집단은 flagg에 대해 양성이었습니다. 바코드를 기반으로 이 집단은 돌연변이 HIV 외피 기질을 가진 집단으로 쉽게 식별할 수 있습니다.

이제 유세포 분석과 함께 retro valve 기술을 활용하는 방법에 대해 잘 이해하게 되었습니다. 형광 유전적으로 바코드화된 세포주를 확립하기 위해 멀티플렉스 형식의 4가지 생물학적 응용 분야, 형광 유전자 바코드 세포를 멀티플렉스 형식의 세포 기반 분석과 결합하는 기능은 높은 처리량 기능을 크게 향상시킵니다. 세포주가 생성된 후에는 동결하는 것이 중요합니다.

그런 다음 주기적으로 해동하고 다시 분석한 다음 다시 풀어줍니다. 유전적으로 바코드화된 형광 세포주를 생성하는 것은 처음에는 시간이 많이 소요될 수 있지만, 일단 확립되면 향후 응용 분야의 반복성과 견고성을 크게 향상시킵니다.