Name: 나의 기능적 특성 + / H + 선택을 양자가 살해 사용하여 세포 내 구획의 교환기는 플라즈마 막에서 그들을 표현하는 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: 학습하세요 세포 내 Na+/H+ 교환체를 프로톤 킬링 선택법으로 플라즈마 막에 발현시키는 방법을. 세포내 pH 회복 측정과 빠른 이온 흡수 분석을 통해 이온 선택성과 동역학적 특성을 평가할 수 있습니다.

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저자는 여기에 설명된 측정을 창안하고 개선한 pH 및 이온 수송에 대해 연구하는 과학계의 모든 구성원에게 깊은 빚을 지고 있습니다. 그들은 특히 여기에 사용된 H+-killing selection 기술을 창시한 Jacques Pouysségur 박사에게 감사를 표합니다. 그들은 니스 소피아 앙티폴리스 대학교, CNRS, ANR (JCJC SVSE1 NHEint) 및 ICST Labex의 지원을 인정합니다.

1. H + 죽이는 선택 <ol><li> 세포주 <ol><li> 안정적 NHE 결핍 세포를 형질 감염 (예, CCL39 유래 PS120 세포주 16) 섬유 모세포 세포주에서 효율적인 형질 전환 수율 및 선택을 생산할 예정 포유 동물 발현 벡터 및 형질 전환 방법의 조합을 사용. 참고 : 여러 해 동안 인산 칼슘 침전 (19)가 좋은 형질 전환 수율로 사용되었다. 여기에는 리포 펙 타민 같은 상용 시약에 의해 최근 대체되었습니다, 형질은 제조업체의 지침에 따라 수행된다. </li></ol></li><li> 솔루션 <ol><li> 아래 설명 세 멸균 솔루션을 준비합니다. 여과 (0.22 μm의) 이러한 솔루션을 소독. <ol><li> 50 mM의 CL NH 4, 70 mM의 염화 콜린, 5 mM의 KCl을, 1 ㎜의 MgCl 2, 2 mM의 CaCl2를 5 밀리미터 GL 구성된 NH 4 + 로딩 용액을 준비 (PH 7.4)ucose 및 pH가 7.4에서 15 mM의 MOPS. </li><li> 120 mM의 염화 콜린 5 mM의 KCl을, 1 ㎜의 MgCl 2, 2 mM의 CaCl2를, 5 mM의 포도당하여 pH 7.0에서 15 mM의 HEPES 이루어지는 세정액 (PH 7.0)을 준비한다. </li><li> pH가 7.4에서 120 mM의 염화나트륨, 5 mM의 KCl을, 1 ㎜의 MgCl 2, 2 mM의 CaCl2를, 5 mM의 글루코오스, 15 mM의 HEPES 구성된 복구 솔루션 (PH 7.4)을 준비한다. </li></ol></li></ol></li><li> CO 2가 훼손 될 수 해당 버퍼링 될 것이다 5 %로서, - 선택을 시작하기 전에 ( &quot;무료&quot;인큐베이터 CO 2 라) 외부 탱크로부터 추가 CO 2, 37 ℃에서 사용될 수있다 세포 배양기를 얻기 산성화. 약 2 × 108 세포 (전형적으로 약 20 합류 100mm 플레이트)에 관심 업 NHE 발현 세포주를 증폭. </li><li> H는 절차를 죽이는 + : <ol><li> (3)에 로딩 용액에 1 시간 동안 관심 NHE 세포를 발현 세포를 부화CO 2 - 무료 인큐베이터에서 7 ° C. </li><li> 로딩 솔루션을 대기음 후 상기-세정액에 두 번 씻어 내야합니다. 산성화를 생성하는 가파른 NH 4 + 구배의 생성을 저해 할 잔여 세포 외 NH 4 (CL)을 제거하기 위해 효율적으로이 단계를 수행합니다. </li><li> 흡인 린스 매질을 제거하고 프리 CO 2 인큐베이터에서 37 ° C로 다시 복구 솔루션에서 한 시간 동안 세포를 배양한다. </li><li> 일반 배양 배지 (7.5 % FCS 전형적 DMEM)와 복구 매체를 장착하고 (5 % CO 2 및 95 %의 공기가 공급되는 습한 공기 조건에서 37 ° C)를 표준 배양 조건에서 세포를 성장한다. </li></ol></li><li> 안정적인 클론이 등장 할 때까지 일주일에 두 번 선택의이주기를 반복합니다. 참고 : 세포 배양 및 선택 조건에 관한 특별한주의하십시오. 작품의 달은 오 더 경향이 오염에 의해 파괴 될 수있다문화와 반복 세포 조작의 긴 기간 후 ccur. <ol><li> 여기서, 클론을 증폭하고 상기와 같은 개별적 2-3 절에서 설명한 이들의 특성, 또는 특성화 전에 세포 집단을 생성하기 위해 이들을 함께 풀로 여부를 선택한다. </li></ol></li><li> 카운터 선택 부모의 산에 민감한 표현형 (그림 1B)에 복귀 한 수 사람들을하여 산성화 방지 세포를 유지하기 위해 가끔 선택 (약 2 주에 1 회)를 적용합니다. </li></ol> 2. 세포 내 pH 측정 2.1) 형광의 pH 이미징 <ol><li> 490 nm에서 흥분 할 때의 pH 민감하고 제조 업체의 프로토콜 다음 445 nm의 isosbestic 점을, 소유 비율 계량 pH 민감성 형광 염료 BCECF / AM을 사용합니다. <ol><li> 또한, 제조 업체의 프로토콜 다음 다른 pH 민감성 프로브를 사용합니다. </li></ol></li><li> 영상 설정 콘을 사용하여고감도 비디오 카메라에 결합 도립 현미경 sisting. 450 nm의 여기에 적합한 석영 중립 밀도 필터와 결합 490 nm의 협 대역 간섭 필터 세트를 착용. <ol><li> 가능하면 비도 모두 λ1 및 / 또는 λ2를 들면, 어느 포화 또는 너무 낮게 설정된 기저 형광 값을 피하기 1에 가까워 지도록, λ1과 λ2 위해 설치 필적 형광 값 필터 및 조명 조건의 적절한 세트를 사용. 이 세포 내 pH가 변화하고 있지만 비율이 검출되지 수 있습니다으로 다음 중요한 유물을 얻을 수 있습니다. 참고 :이 시스템에 적절한 발광 파장 (BCECF 535 ㎚)에서 빠른 관류, 시간 경과에 두 개의 상기 파장에서 여기 및 인수를 사용하도록 설정해야합니다. 소프트웨어는 자동 데이터 수집 및 저장을 가능하게하여 시스템을 장비. </li></ol></li></ol> NHE 앞으로 활동 2.2) 측정 (압출 성형세포질에서 양성자) <ol><li> NH 4 + 로딩 용액에 1 시간 배양 세포 산성화 CO 2의 부재 (단계 1.4 참조). </li><li> 마지막 5 분 동안 용액에 BCECF-AM (5 μM 최종 농도)를 첨가하고 세포 외 프로브를 제거 NH 4 + 로딩 용액을 헹군다. </li><li> 현미경 세포를 마운트하고 안정적​​인 바탕을 기록하는 여러 이미지를 가져 가라. 세정액 (위 참조) 관류. 이 산성화에 대응 형광의 드롭을 초래한다. </li><li> pH가 안정화되면, 리 + / H +, 나트륨 + / H의 + 또는 K + / H +로 교환하여 pH 매개 회복율을 측정하기 위해 아래에 주어진 임의의 솔루션을 관류. 각 솔루션은 잠재적 인 커플 링 양이온 H + 교환을 테스트 할 포함되어 있습니다. 그 중 하나가 이동하는 경우, 이는 corresp 것이다 495 nm에서의 형광 증가를 초래한다번째 세포 내 pH를 높이려면 : pH가 7.4에서 120 mM의 LiCl을, 5 mM의 KCl을, 1 ㎜의 MgCl 2, 2 mM의 CaCl2를, 5 mM의 글루코오스, 15 mM의 HEPES pH가 7.4에서 120 mM의 염화나트륨, 5 mM의 KCl을, 1 ㎜의 MgCl 2, 2 mM의 CaCl2를, 5 mM의 글루코오스, 15 mM의 HEPES pH가 7.4에서 125 mM의 KCl을, 1 ㎜의 MgCl 2, 2 mM의 CaCl2를, 5 mM의 글루코오스, 15 mM의 HEPES </li></ol> NHE 역 활동의 2.3) 측정 참고 : 여기 원리는 횡단 이온 그라디언트를 반전하는 것입니다. <ol><li> 측정에 앞서, 관심있는 세포 내 양이온과로드 셀 (아래 참조). </li><li> BCECF / AM (단계 참조 2.2.2)와 5 분 동안 그들을 품어; 그들을 씻어 비디오 현미경을 탑재합니다. </li><li> 로딩 솔루션을 관류하고 안정적​​인 바탕을 기록하는 여러 이미지를 가져 가라. </li><li> 베이스 라인 안정화, 이미지 세포가 세포 외 산성 매체가 120m를 포함 관류하는 pH를 변화 후M의 염화 콜린, 5 mM의 KCl을, 1 ㎜의 MgCl 2, 2 mM의 CaCl2를, 5 mM의 포도당하여 pH 6.5에서 15 mM의 MES에. </li><li> LiCl을 로딩, pH를 7.4에서 120 mM의 LiCl을, 5 mM의 KCl을, 1 ㎜의 MgCl 2, 2 mM의 CaCl2를, 5 mM의 글루코오스, 15 mM의 HEPES 이루어지는 용액에서 2 시간 동안 세포를 배양한다. 원자 흡광 법에 의해 측정 된 세포 내 리튬은 약 60 mm의 값을 산출한다. </li><li> 나트륨 + 로딩, 1 밀리미터의 흡수를의 존재 하에서 pH가 7.4에서 120 mM의 염화나트륨, 5 mM의 KCl을, 1 ㎜의 MgCl 2, 2 mM의 CaCl2를, 5 mM의 글루코오스, 15 mM의 HEPES 이루어진 용액에 2 시간 동안 세포를 배양한다 나 / K ATPase의 차단합니다. 이러한 조건에서, 세포 내 나트륨 + 농도는 40 mM의 범위이다. 주 : 세포질 K + 농도가 140 mM이 범위이고 외향 K + - 지향 구배 달성하는 것이 쉽기 때문에 K + 로딩이 필요하지 않다. </li></ol> 2.4) 데이터 처리 및 교정: 주 :이 단계는 순방향 및 역방향 측정 모두에 적용된다. <ol><li> 각 실험의 끝에, 6.5와 7.4 사이의 pH 값으로 조정 된 140 mM의 KCl을 20 mM의 HEPES 및 5 μM의 nigericin의 용액으로 세포를 관류. </li><li> 텍스트 형식으로 아래의 이미지에서 형광 측정과 같은 데이터 (회색 수준의 강도 수준을 나타냄) 및 수출을 수집하고 같은 스프레드 시트 프로그램을 사용하여 아래에 설명 취급합니다. </li><li> 각각의 개별 셀, 또는 다음의 식을 이용하여 관심 영역에 대한 세포 내 pH 값을 계산한다 : pH가의 pKa + (로그 (R이-Rmin을) / (R 최대 -R가)) × F의 분 (λ2) / F 최대 (λ2) </li><li> F의 분 (λ2) / F 엄마 X (λ2) 실험에 걸쳐 450 nm의 형광의 감소의 결과로, 프로브 표백 또는 누설이있는 경우 비율을 사용합니다. 그러나 이것은 매우 드문 데에 사용 된 조건에서 관찰 없습니다cribed 실험. </li><li> 교정 데이터는 각각 pH 측정의 끝에 존재하는 바와 같이 계산 된 값에 대응하는 캘리브레이션에 사용되는 pH 값에서 다른지를 확인한다. 이 경우라면, 다음과 같은 절차를 사용하여 교정에 모두 실험적으로 결정된 pH 값 조정 : <ol><li> 다음 몫 (Q, 보정 값의 측정 값 / 차이의 차이)를 계산. 계산 된 값이 대응하는 캘리브레이션 값을 같게되도록 Q.함으​​로써 전체 데이터 세트가 부가 또는 감산함으로써 최종 조정을 곱한다. </li></ol></li></ol> 빠른 리 + 통풍 관에 의해 NHE7의 초기 요금 3. 측정 <ol><li> 멀티 웰 플레이트 상에 종자 세포 (6- 웰-24) 또는 20 이상에서 설명한 교대 nigericin / 소 혈청 알부민 (BSA) 산성화 바와 NH 4 + 로딩 기술을 사용하여이를 산성화. </li><l난&gt; 린스 플레이트 배 빠르게 상술 세정액을 이용하고, 원하는 양 (약간 km 값 이하) 1-10 mM의 리튬을 함유하는 흡수 용액의 세포와 양이온의 목적하는 농도 및 / 또는 관심의 억제제를 부화 시간. </li><li> 해당 전송 초기 속도 조건에서 작동하기 위해 짧고 일관된 흡수 기간 (일반적으로 1 분 이하)를 유지한다. 또한 흡수에 사용되는 모든 솔루션이 등장 있는지 확인하십시오. </li><li> 흡수 시간의 끝에서, 신중하게 흡수 매질을 제거하고 얼음 - 냉각 된 인산 완충 생리 식염수 (PBS)으로 세포를 네 번 세척 하였다. (그 중 네 적합 미만 10 초) 리튬 유출을 막기 위해 가능한 한 빨리 이러한 세척을 수행한다. </li><li> 를 Lyse 25 % 질산에 세포. 25 % 질산 웰 당 250 μL를 적용하고 그 후, 피펫 팁의 단부와 각 웰 스크랩 새로운 미시간 전체 웰 현탁액을 전송하고, 적어도 1 시간 방치crocentrifuge 튜브. </li><li> 세포 파편을 제거하기 위해 15,000 XG (실온)에서 5 분간 원심 분리하여이를 1.5 ml의 마이크로 원심 분리 튜브에 이동 분해물. </li><li> 원자 흡수 분광법 (21)에 의해 상층 액의 리튬 함량을 측정. 참고 : 다른 기업들이 리튬 중공 음극 램프를 장착 할 필요가 원자 흡수 분광기를 제공합니다. 이 기계는 매우 정밀한뿐만 아니라 매우 섬세으로 제조업체의 지침을 따르십시오. </li></ol>

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<li>Geyer, R. R., Musa-Aziz, R., Enkavi, G., Mahinthichaichan, P., Tajkhorshid, E., Boron, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movement+of+NH3+through+the+human+urea+transporter+B%3A+a+new+gas+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Movement of NH3 through the human urea transporter B: a new gas channel.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 304 (12), F1447-F1457 (2013).</li>
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이 프로토콜은 부위 특이 적 변이에 의해 자신의 기본 순서를 변경하지 않고 세포막에서 세포 나 + / H + 교환기를 발현하는 세포를 선택하는 방법에 대해 설명합니다. 이러한 교환기 이제 특성화 될 수있다. 이 방법은 세포막에 소포 나 + / H + 교환기를 표현한다 세포주를 선택하는 양성자 세포의 세포 독성에 기초한다. 여기에는 리튬 +, K +, 또는 고사 +로 전송할 수 의심 될 수있는 다른 양이온을 사용하는 것이 원칙적으로 할 수 있습니다. 그러나,이 불확실성의 수준이 향상됩니다. 선택은 임의의 양성 클론을 산출하지 않는 경우, 그 후 테스트가 반송되지 양이온 교환기 또는 세포막에 있지 있는지 여부를 평가하기 어렵다. 이 외 SUBSTR 그대로 이러한 이유로, 선택은 결합 + 양이온으로서 나트륨을</sup...

대부분의 세포 내 구획 성숙, 인신 매매, 단백질이나 호르몬과로드 신경 전달 물질의 재활용을위한 핵심 매개 변수입니다 산성 내강의 pH를 표시합니다. 그것은 세포질 포성 내용 사이의 pH 구배 소포 CLC 클로라이드 컨베이어 (2)에 결합 된 액포 H + -ATPase를 (1)에 의해 생성되는 것으로 밝혀졌다. 두 녹아웃 (KO) 마우스 및 인간 환자에서, 이들 컨베이어의 중요성 3-6 유전자 돌연변이로 인한 무거운 표현형에 의해 강조되었다. 나트륨 수소 교환기 SLC9A 가족의 구성원, 또한 나트륨 + / H + 교환기 NHEs 불리는 세포 내 pH 및 세포 볼륨 조절 키 이펙터에서뿐만 아니라 상피 걸쳐 산 - 염기 당량의 vectorial 수송 것으로 나타났다 . 세포막 NHEs 외에도 세 고도로 + / H + 기, NHE 6, 7은 Na 보존9는 트랜스 - 골지 네트워크에서 초기 엔도 좀 (7)로 표현된다. 유전자의 돌연변이는 엔젤 형 또는 크리스찬 증후군 8-9, 가족 기반의 자폐증 (10)와 주의력 결핍 과잉 행동 장애 11-12로 연결되어있다. 이 교환기는 또한 알츠하이머 병의 감수성 (13)과 X-링크 된 정신 지체 연속 유전자와 같은 신경 퇴행성 문제 (14) 증후군에 참여했습니다. 함께 찍은, 이러한 연구는 두뇌 발달 및 / 또는 기능에서 이러한 세포 내 NHEs의 중요성을 강조 표시합니다. 이러한 기의 세포 내 현지화 정확한 자신의 이온 선택성 측정, 전송 방향, 운동 매개 변수 및 규제를 방지 할 수 있습니다. 세포 내 구획에서 발현 모든 컨베이어의 경우와 같이, 자신의 생화학 활동을 평가하기 때문에 완전히 생리적 역할과 mechan을 이해하는 것은 매우 어렵다ISMS는 병적 인 의미를 기본. 높은 세포질 K + 농도에 따라, 가장 일반적으로 받아 들여지는 가설은 K + 결합 된 양성자 유출 컨베이어로 작업하는 것이 었습니다. 이 정상 상태 포성 산도를 유지하기 위해 V--ATPase를 펌핑하여 양성자를 상쇄 할 수있다 등의 양자 누출의 존재가 가정되었다. 이 시각 문서의 목적은 세포막에서 이러한 소포 ​​수송차를 표현하고, (ⅱ) 이러한 수송의 기능을 측정하는 두 개의 독립적 인 방법을 보여 세포주의 유전을 선택할 수 있도록하는 방법을 설명하기 (I)이다. 세 년 전, Pouysségur과 프란은 NHE 가족 (15)의 구성원의 분자 클로닝 및 특성을 활성화 유전 적 접근 방식을 개척했다. 이 스크리닝 방법으로 세포 독성 양성자에 기초 하였다. 첫 번째 단계는 결핍 세포주를 수득 하였다어떤 나 + / H +의 교환이 전달체 가역성을 이용 세포막에서 발현. 섬유 아세포 (CCL39 세포주) 또는 리튬 나트륨 + + 미리로드 한 후 2 시간 동안 세포 외 산성 매질 (PH 6.5)에 넣었다. 이것은 기능적 나 + / H + 교환을 발현하는 세포의 죽음과 antiporter 결핍 세포 (PS120 세포주) (16)의 선택되었다. 중탄산없는 배지에서 배양하면, 이들 세포는 급성 세포 내 산성화에 매우 민감하다. 이러한 세포는 세포 급성 acidifications에 제출하는 경우 결과적으로, 세포막에서 기능적 양성자 유출기구의 발현 양 (도 17 참조)를 선택한다. 이러한 기술은 산성화 세포막에서 WT 세포 NHEs의 강제 발현을 활성화 결함 트래 피킹 세포주를 분리 할 수​​있다. 진핵 세포 나 + / H로교환기 electroneutral 있습니다 +, 그들은 채널을 측정하기 위해 큰 성공과 함께 사용 된 전기 생리 학적 방법에 의해 측정 할 수 없습니다. 이 원고 따라서 세포 내 pH 측정과 리튬의 빠른 흡수 동력학하여 교환기의 활성을 측정하는 방법을 설명한다. 기본 개념은 동일한하는, 그 선택 부 위해 개발 된 많은 프로세스는 또한 작용 성 측정에 사용되는 직접 통지 흥미 롭다. 흥미롭게도,이 논문에 설명 된 접근법을 사용하여 선택된 세포주에 존재 매매 결함은 소낭 칼륨 채널 TWIK1 18과 같이 세포막에 다른 소포의 단백질보다 발현에 이르게 것을 관찰했다. 이것은 소포 막 관통 단백질 일반적인 고정 결함기구의 선택을 향해 지적한다. 그러므로 이러한 선택 절차 및 5 월의 생성 세포세포 내 구획의 막 단백질에 근무하는 과학적인 지역 사회를위한 유망한 도구를 구성한다. 뿐만 아니라 여기에 제시된 측정 기술은 다른 비 electrogenic 운송을 연구 적용 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>카탈로그</td><td>번호가 다른 많은 장치로 구성된 H+ 살해 선택에 사용되는</td>인큐베이터 <td></td><td></td></tr><tr><td>CO2</td><td>Sanyo</td><td>MCO15A</td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터 CO2</td><td>Heraeus 기기</td><td>없는 BB6220</td><td></td></tr><tr><td>층류 후드 PSM1200NF</td><td>Fisher&nbsp;</td><td></td><td></td>52010120</tr><tr><td>DMEM 매체</td><td>시그마</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>FBS 골드</td><td>GE 헬스케어</td><td>A15-151</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>PAA</td><td>P11-010</td><td></td></tr><tr><td>트립신 10x</td><td>PAA</td><td>L11-003</td><td></td></tr><tr><td>원자 흡수 분광계(Zeeman 용광로 시스템</td><td>포함) Thermo Scientific</td><td>ICE 3500 GFZ</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>sigma</td><td>L4408</td><td></td></tr><tr><td>Nitric Acid</td><td>sigma</td><td>438073</td><td></td></tr><tr><td>형광 비디오 현미경 세트</td><td>Leica</td><td></td><td>카탈로그 번호가 다른 많은 장치로 구성</td></tr><tr><td>도립 자동 현미경</td><td>Leica</td><td>DMI6000B</td><td></td></tr><tr><td>현미경 스탠드</td><td>leica</td><td>11888906</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888911</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> 11505180 <td>11888377</td><td></td></tr><tr><td>입사 형광</td><td>라이카</td><td>11888901</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11504166</td><td></td></tr><tr><td>모터 브라켓</td><td>라이카</td><td>11888379</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11505234</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11521505</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11522106</td><td></td></tr><tr><td>LED 투과등&nbsp;</td><td>라이카</td><td>8097321</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>8102034</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11521580</td><td></td></tr><tr><td>전동 플레이트</td><td>라이카</td><td>11522068</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11531172</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11521734</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11521719</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888423</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>11888424 카메라 출력</td><td>라이카</td><td>11888373</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11507807</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888393</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888259</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888258</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11541510</td><td></td></tr><tr><td>이미지 획득/분석 소프트웨어</td><td>라이카</td><td>11888375</td><td></td></tr><tr><td>광학</td><td>라이카</td><td>11506507</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11506243</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11506203</td><td></td></tr><tr><td>형광 크세논 램프</td><td>라이카</td><td>DMI6000</td><td></td></tr><tr><td>카메라</td><td>하마마츠</td><td>8100601</td><td></td></tr><tr><td>메타 플루오르 / Mmfluor 소프트웨어</td><td></td><td>11640905</td><td></td></tr><tr><td>pH 민감 프로브, BCECF-AM</td><td>생명 기술</td><td>B1170</td><td></td></tr><tr><td>니제리신</td><td>시그마</td><td>N7143</td><td></td></tr></tbody></table>

나의 기능적 특성<sup&gt; +</sup&gt; / h<sup&gt; +</sup&gt; 선택을 양자가 살해 사용하여 세포 내 구획의 교환기는 플라즈마 막에서 그들을 표현하는

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

엔도 솜 산성화는 시냅스 소포의 단백질 분해 및 재활용, 둔감 수용체 및 신경 전달 물질의 로딩 등의 처리, 다양한 중요하다. 이 산성화는 CLC 염화 컨베이어에 결합 된 양성자 -ATPase를,에 의해 매개되는 기술되어있다. electroneutral 양성자 수송을 고도로 보존, ​​나 + / H + 교환기 (NHE) 6, 7, 9는 이러한 구획에서 표현된다. 유전자의 돌연변이는 인간의인지 적, 신경 퇴행성 질환과 연결되어있다. 자신의 세포 내 현지화 상세한 기능 특성을 방지 것처럼 역설적으로 자신의 역할은 애매 남아있다. 이 논문은이 문제를 해결하는 방법을 나타내고있다. 이것은 세포막에서 세포를 유지하여 NHEs 급성 세포질 산성화 생존 가능한 돌연변이 세포주의 선택으로 구성. 그러므로 이온 선택성 및 활성을 측정하기 위해 두 개의 상보적인 프로토콜을 도시(ⅰ) 하나의 비디오 형광 현미경을 사용하여 세포 내 pH 측정에 기초하고, (ⅱ) 하나의 리튬의 빠른 흡수 동력학에 기초한 이러한 교환기. 이러한 프로토콜은 다른 비 electrogenic 수송차를 측정하도록 외삽 될 수있다. 또한, 여기에 제시된 선택 절차는 세포 표현형으로 고정 불량 셀을 생성한다. 따라서, 이러한 세포는 세포막에서 다른 소포 막 단백질을 발현한다. 여기에 묘사 된 실험 전략은 따라서 다음 소낭 + / H + 선택에 사용 교환기 나트륨과 함께 ​​세포막에서 발현된다 다른 세포 내 단백질을 연구하기 위해 잠재적으로 강력한 도구를 구성 할 수있다.

선택 : 도 1a에 도시 된 바와 같이 H + 죽이는 선택은, 암모늄 약 염기의 확산에 기초한다. 약염기의 pH 및 세포 내에서 산의 확산 효과는 월터 붕소 및 공동 (22)에 의해 개척되었다. 우아한 아이디어는 긍정적 인 유전자 선택을위한 치명적인 산성화가 다음 자크 Pouysségur (17)에 의해 개발 된 생산하는이 현상을 사용할 수 있습니다. 이러한 프로토콜에서 세포 내 pH는 약 5.5 헹굼 단계 이후로 떨어진다. 세포막에서 기능적 NHE를 발현하지 않는 세포는 중성 pH 값을 복구하고 편평한 형상 및 세포질 과립 (도 1B)으로 산성화 전형적인 양태를 표시 할 수 없습니다. 선택을 반복주기는 약 10-7의 주파수에서 충분히 안정적이 산성화 (도 1C)을 등장 생존 세포 (약 2의 H +는...

이 글의 첫 번째 부분에서는 원형질막에서 소포성 Na+/H+ 교환체를 발현하는 돌연변이 세포주를 선택하는 방법을 보여줍니다. 두 번째 부분에서는 세포 내 pH 측정 및 빠른 이온 흡수를 기반으로 하는 프로토콜을 제공하며, 이는 이러한 교환기의 이온 선택성과 운동 파라미터를 결정하는 데 사용됩니다.

나의 기능적 특성<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; 선택을 양자가 살해 사용하여 세포 내 구획의 교환기는 플라즈마 막에서 그들을 표현하는

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and ...

다음 실험의 전반적인 목표는 세포 내에서 발현된 나트륨-프로톤 교환체의 활성을 측정하는 것입니다. 이는 먼저 프로톤 킬링 선택법(proton killing selection)을 통해 세포막에서 세포 내 나트륨-프로톤 교환체를 발현하는 세포를 선별함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계로, 선별된 세포를 산성화시킨 후 세포 내 pH 회복 정도를 측정하여 해당 세포의 나트륨-프로톤 교환 활성을 확인합니다.그 후 이온 수송의 빠른 역학을 측정하여 수송되는 양이온과 억제제에 대한 친화도 상수를 결정합니다. 결과적으로, 선택된 체세포의 세포 내 pH 변화와 빠른 역학을 모니터링함으로써 세포 내 단백질 교환의 기능적 특성을 분석할 수 있습니다. 변이 수송체를 발현시키거나 per 세포를 사용하는 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 야생형 세포 내 수송체를 세포막에 발현시켜 그 기능을 직접 측정할 수 있게 한다는 점입니다.본 실험 과정은 저희 연구실의 연구원인 Dr.Mallory poet가 시연하겠습니다. 양성자 킬링(proton killing) 절차를 시작하려면, 먼저 관심 대상인 세포 내 나트륨-양성자 교환기를 발현하는 세포를 로딩 용액과 함께 37 °C의 이산화탄소가 없는 인큐베이터에서 1시간 동안 배양하십시오. 다음으로, 로딩 용액을 흡입하여 제거하고 신선한 배지로 세포를 두 번 세척하십시오.두 번째 세척 후, 배지를 흡입하여 제거하고 이산화탄소가 없는 인큐베이터에서 회복 용액과 함께 세포를 배양합니다. 1시간 후, 회복 배지를 일반 배양 배지로 교체하고 표준 배양 조건에서 세포를 성장시킵니다. 세포의 세포 내 형광 pH를 이미지화할 수 있는 안정적인 클론이 나타날 때까지 이 선택 주기를 일주일에 두 번 반복합니다.먼저 450 nm 및 490 nm 협대역 간섭 필터와 여기를 위해 적절한 석영 중성 밀도 필터가 결합된 고감도 비디오 카메라가 연결된 도립 현미경으로 구성된 이미징 세트를 준비합니다. 가능하다면, 나트륨-양성자 교환기의 정방향 활성을 측정하기 위해 채널 1과 2의 형광 값이 1에 가까운 비율이 되도록 적절한 필터 세트와 조명 조건을 설정하십시오. 다음으로, 암모늄 로딩 용액에서 1시간 동안 배양하여 세포를 산성화합니다.배양 마지막 5분 동안 이산화탄소를 제거한 상태에서, 비율 측정형 pH 민감성 형광 염료로 세포를 염색합니다. 배양 기간이 끝나면, 세포 외 프로브를 제거하기 위해 암모늄 로딩 용액으로 세포를 헹구고 염색된 세포를 현미경에 거치합니다. 형광 값을 측정할 관심 영역을 적절하게 선택합니다.그 다음, 기준선을 설정하기 위해 여러 장의 이미지를 기록하고 RIN 용액을 세포에 주입하여 형광 감소를 유도합니다. pH가 안정화되면, 리튬 수소, 나트륨 수소 또는 칼륨 수소 교환에 의해 매개되는 pH 회복 속도를 측정하기 위해 관심 용액을 세포에 주입합니다. 이제 염화칼륨과 게린이 첨가된 hippies 용액을 세포에 주입합니다.그 다음 이미지에서 형광 측정값을 수집하고, 나트륨-양성자 교환기의 초기 속도를 측정하기 위해 데이터를 텍스트 형식으로 스프레드시트 프로그램에 내보냅니다. 일곱 번째로, 방금 시연한 Imodium 로딩 기술을 사용하여 세포와 멀티웰 플레이트를 빠른 리튬 흡수를 통해 산성화합니다. 다음으로, 방금 시연한 것과 같이 플레이트를 빠르게 두 번 헹굽니다.그 후, 1~10 µM의 리튬과 원하는 농도의 양이온 또는 관심 억제제가 포함된 흡수 용액에서 세포를 배양합니다. 흡수 기간이 끝나면 약 1분 이내에 흡수 배지를 조심스럽게 제거하고, 리튬 유출을 방지하기 위해 총 10초 이내에 얼음처럼 차가운 PBS로 세포를 빠르게 4회 세척한 다음, 웰당 250 µL의 25% 질산에서 최소 1시간 동안 세포를 용해합니다. 배양이 끝나면 피펫 팁 끝으로 각 웰을 긁어 각 웰의 현탁액을 새로운 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 마지막으로, 상온에서 15,000 G로 5분 동안 샘플을 원심분리하여 세포 잔해를 제거한 후, 원자 흡수 분광법으로 상층액의 리튬 함량을 측정합니다.제조사의 지침에 따르면, 양성자 사멸 선택(proton killing selection)은 약염기인 암모늄의 확산을 기반으로 합니다. 예를 들어, 세포막에서 기능적인 나트륨-양성자 교환체(sodium proton exchanger)를 발현하지 않는 세포는 중성 pH 값으로 회복할 수 없으며, 따라서 반복적인 선택 주기 후에 본 대표 이미지에서 보이는 것과 같이 납작한 모양과 과립형 세포질을 가진 전형적인 산성화 양상을 나타내며, 완전히 그리고 안정적으로 생존하는 세포들과 대조를 이룹니다. 그러나 산성화된 세포들은 여기에서 보이는 것처럼 개별 세포 클론을 형성하며, 이는 Imodium 로딩 후 산성화 과정에 이어 이 그래프들에서 관찰되는 바와 같이 다양한 실험 조건 하에서 유도된 세포 내 pH 변화를 측정함으로써 세포막에 발현된 세포 내 나트륨-양성자 교환체의 활성과 이온 선택성을 특성화할 수 있음을 입증합니다.효소 역학의 경우, 초기 흡수 속도에 대한 용량 반응을 통해 기질의 친화도 상수 값과 억제제의 억제 상수 값을 추가로 도출할 수 있습니다. 실제로 운반체의 흥미로운 특징 중 하나는 서로 다른 결합 양이온이 운반을 위해 경쟁한다는 점이며, 이 그림에서 입증된 바와 같이 이러한 절차를 따르면 리튬 흡수와의 경쟁을 통해 나트륨의 친화도 상수를 측정할 수 있는 가능성이 생깁니다. 관심 운반체가 실제로 세포막에 발현되는지 확인하기 위해 RNA silencing과 결합된 세포 표면 BioInnovation과 같은 다른 실험을 수행할 수 있습니다.

functional-characterization-na-h-exchangers-intracellular

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 Xenopus 난모세포에서 효소의 이종 발현을 통해 K+-역수송 P형 ATPase의 활성을 정량화하고 원자 흡수 분광 광도법으로 개별 세포로의 Rb+ 또는 Li+ 흡수를 측정하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 방사성 동위원소 플럭스 실험에 대한 민감하고 안전한 대안으로 복잡한 동역학 연구를 용이하게 합니다.

오세영, K와 H, K-ATPase에 의해 양이온 교통 측정<em&gt; Xenopus</em원자 흡수 분광 광도법에 의한&gt; Oocytes : 방사성 동위 원소의 Assays에 대한 대안

Electroporation은 정제된 박테리아 독성 효과기 단백질을 살아있는 진핵 세포에 직접 삽입하는 데 사용되었습니다. 단백질 국소화는 컨포칼 면역형광 현미경으로 모니터링했습니다. 이 방법을 사용하면 활성 외인성 단백질을 사용하여 이동, 기능 및 단백질-단백질 상호 작용에 대한 연구를 수행할 수 있으므로 진핵 세포에서 이종 발현의 필요성을 피할 수 있습니다.

포유 동물 세포에 기능 세균 이펙터의 전기

Proteoliposomes는 잘 정의된 생화학적 환경에서 재구성된 정제된 채널과 수송체를 연구하는 데 사용됩니다. 이러한 단백질에 의해 매개되는 유출을 측정하기 위한 실험적 절차가 설명됩니다. 프로테오리포좀을 준비하고, 기록을 수행하고, 데이터를 분석하여 재구성된 단백질의 기능적 특성을 정량적으로 결정하는 단계가 설명됩니다.

Proteoliposome 기반 유출 분석은 CL의 단일 분자의 속성을 확인하는<sup&gt; -</sup&gt; 채널 및 전송기

속됨 부정맥은 종종 하나 이상의 이온 채널의 표면에 전달 변경 돌연변이에 의해 야기된다. 여기서는 TSA-201 세포에서 발현 된 재조합 이온 채널의 상대적 총 세포 표면 단백질 발현의 정량 분석을 제공하기 위해 유세포 적응.

유동 세포 계측법을 사용하여 재조합 이온 채널의 상대 셀 표면 및 전체 식의 결정

이 원고는 양성자 교통 시스템의 활동을 측정 하 양성자-선택적 전극 및 패치 방법 클램핑의 응용 프로그램을 설명 합니다. 이러한 메서드는 일반적으로 양성자 수송 활동, 적당 한 감도, 시간 해상도 및 부족 한 세포내 환경 제어 등을 연구 하는 데 사용 하는 기술의 몇 가지 제한 사항이 극복.

전기 중립 전송기의 활동을 연구 전기 생리학 측정의 응용

여기 우리가 제시 익스프레스, solubilize, 누 룩을 사용 하 여 SLC4 운송업 자 가족에 상 동으로 여러 진 핵 borate 전송기를 정화 하는 프로토콜. 우리는 또한 multimeric 어셈블리에 대 한 정화 homomeric 단백질을 평가 하기 위해 화학 가교 분석 결과 설명 합니다. 이러한 프로토콜은 다른 도전 막 단백질에 대 한 적용할 수 있습니다.

표현, 가용 화, 그리고 진 핵 Borate 전송기의 정화

우리는 프랑스 프레스를 사용하여 대장균 및 세포의 용해에서 이종 발현에 의해 생성된 막 소포 제제에서 양성자 구동 막 수송기의 특성화 방법을 설명합니다.

대장균의 이종 식에 의한 멤브레인 수송기의 특성화 및 멤브레인 소포 생산

이 프로토콜은 세포 환경에서 실시간으로 수용체에 대한 아데닌 뉴클레오티드 결합을 측정하는 방법을 제시합니다. 결합은 트리니트로페닐 뉴클레오티드 유도체와 비표준 형광 아미노산으로 표지된 단백질 사이의 Förster 공명 에너지 전달(FRET)로 측정됩니다.

온전한 기능성 막 단백질에 대한 뉴클레오티드 결합을 실시간으로 측정

나노 바디는 구조 생물학에 있는 중요한 공구이고 치료의 발달을 위한 중대한 잠재력을 포즈. 그러나 억제 특성을 가진 나노 체의 선택은 어려울 수 있습니다. 여기서 우리는 전기막 수송기를 표적으로 하는 억제 및 비 억제 나노체의 분류를 위한 고체 지원 멤브레인(SSM) 기반 전기생리학의 사용을 입증합니다.

고체 지원 멤브레인(SSM) 기반 전기생리학에 의한 수송기 표적 억제 나노체 선택

이 문서는 칸디다 알비칸스 ABC (ATP 결합 카세트) 단백질 Cdr1의 특성화를위한 소규모 플라즈마 막 격리 프로토콜을 제시, 사카로미세스 cerevisiae에서 과발현. 프로테아제-클레이블 C-단말 mGFPCdr1과 태그 사이에 16잔류 링커를 장착한 이중 태그는 Cdr1의 정제 및 세제 스크리닝을 용이하게 하도록 설계되었습니다.

칸디다 알비칸스 Cdr1-mGFPHis 분석을 위한 소규모 플라즈마 멤브레인 준비

이 프로토콜은 막 전위의 변화를 측정하여 전기적 막 단백질을 연구하는 방법을 설명합니다. 이 분석은 상피 세포주에서 내인성으로 발현되는 여러 이온 채널의 기능적 판독을 위한 플랫폼을 제공합니다.

두 개의 상피 세포주에서 두 개의 내인성 이온 채널에 대한 고처리량 기능 연구를 위한 막 전위의 형광 기반 분석

학습하세요 세포 내 Na+/H+ 교환체를 프로톤 킬링 선택법으로 플라즈마 막에 발현시키는 방법을. 세포내 pH 회복 측정과 빠른 이온 흡수 분석을 통해 이온 선택성과 동역학적 특성을 평가할 수 있습니다.

나의 기능적 특성

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