나의 기능적 특성 ⁺ / H ⁺ 선택을 양자가 살해 사용하여 세포 내 구획의 교환기는 플라즈마 막에서 그들을 표현하는

다음 실험의 전반적인 목표는 세포 내에서 발현된 나트륨 양성자 교환기의 활성을 측정하는 것입니다. 이는 먼저 양성자 사멸 선택에 의해 원형질막에서 세포 내 나트륨 양성자 교환기를 발현하는 세포를 선택함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 선택된 세포를 산성화한 다음 세포 내 pH 회수를 측정하여 세포의 나트륨 양성자 교환 활성을 확인합니다.

그런 다음 이온 수송의 빠른 역학을 측정하여 수송된 양이온 및 억제제에 대한 친화도 상수를 측정합니다. 궁극적으로, 세포 내 pH의 변화와 선택된 체세포의 빠른 동역학을 모니터링하면 세포 내 단백질 교환의 기능적 특성을 분석할 수 있습니다. 돌연변이 수송체를 발현하거나 세포별로 사용하는 것과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 원형질막에서 백색형 세포 내 수송체의 발현을 가능하게 하여 그 기능을 직접 측정할 수 있다는 것입니다.

내 연구실의 연구 과학자인 Dr.Mallory 시인이 양성자 사멸 절차를 시작할 것입니다. 먼저, 관심 있는 세포 내 나트륨 양성자 교환기를 발현하는 세포를 섭씨 37도의 로딩 용액과 무이산화탄소 인큐베이터를 1시간 동안 배양합니다. 다음으로, 로딩 용액을 흡인하고 새로운 배지로 세포를 두 번 세척합니다.

두 번째 세척 후, 배지를 흡인하고 이산화탄소가 없는 인큐베이터에서 회수 용액의 세포를 배양합니다. 한 시간 더 후 회수 배지를 일반 배양 배지로 교체하고 표준 배양 조건에서 세포를 성장시킵니다. 세포의 세포 내 형광 pH를 이미지화하기 위해 안정적인 클론이 나타날 때까지 일주일에 두 번씩 이 선택 주기를 반복합니다.

먼저 450나노미터 및 490나노미터 협대역 간섭 필터와 쌍을 이루는 고감도 비디오 카메라와 결합된 도립 현미경으로 구성된 이미징 세트를 여기에 적합한 석영 중성 밀도 필터와 페어링했습니다. 가능한 경우, 적절한 필터 및 조명 조건 세트를 사용하여 채널 1과 2에 대해 비교 가능한 형광 값을 설정하여 비율이 나트륨 양성자 교환기 순방향 활성을 측정하기 위해 1에 근접하도록 합니다. 다음으로, 암모늄 로딩 용액에서 1시간 배양으로 세포를 산성화합니다.

배양의 마지막 5분 동안 이산화탄소가 없는 경우, pH 민감성 형광 비율의 세포가 염색됩니다. 배양 기간이 끝나면 암모늄 로딩 용액으로 세포를 헹구어 세포 외 프로브를 제거하고 염색된 세포를 현미경에 장착합니다. 형광 값이 적절하게 측정될 관심 영역을 선택합니다.

그런 다음 여러 이미지를 기록하여 기준선을 설정하고 RIN 용액으로 세포를 관류하여 형광 저하를 시작합니다. pH가 안정화된 후 관심 용액으로 세포를 정독하여 리튬 수소, 수소 나트륨 또는 칼륨 수소 교환에 의해 매개되는 pH 회수율을 측정합니다. 이제 염화칼륨과 게린을 보충한 히피의 용액으로 세포를 정독하십시오.

그런 다음 이미지에서 형광 측정값을 수집하고 데이터를 텍스트 형식의 스프레드시트 프로그램으로 내보내 나트륨 양성자 교환기의 초기 속도를 측정합니다. 일곱째, 빠른 리튬 흡수에 의해, 방금 시연된 바와 같이 Imodium loading 기술에 의해 세포와 다중 웰 플레이트를 산성화합니다. 다음으로, 방금 시연한 것처럼 플레이트를 빠르게 두 번 헹굽니다.

그런 다음 흡수 기간이 끝날 때 약 1분 이하를 위해 1-10 마이크로몰 리튬과 관심의 양이온 또는 억제제의 원하는 농도를 포함하는 흡수 용액에서 세포를 배양하고, 조심스럽게 흡수 매체를 제거하고 리튬 유출을 방지하기 위해 총 10초 이내에 얼음 차가운 PBS로 세포를 4번 빠르게 세척한 다음 25% 질산 당 250 마이크로리터에 세포를 lys 적어도 한 시간 동안은 말이죠. 배양 종료 시 피펫 팁 끝으로 각 웰을 긁어내고 각 웰의 현탁액을 새로운 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 마지막으로, 15, 실온에 000 G에 5 분 동안 분리기의 표본은 세포질 파편을 제거하고 원자 흡수 분광법법에 의하여 snat의 리튬 내용을 측정하기 위하여 그 후에

제조업체의 지침에 따르면 양성자 사멸 선택은 암모늄 약한 염기의 확산을 기반으로 합니다. 예를 들어, 원형질막에서 기능적 나트륨 양성자 교환체를 발현하지 않는 세포는 중성 pH 값을 회복할 수 없으므로 반복적인 선택 주기 후에 이 대표 이미지에서 볼 수 있듯이 평평한 모양과 과립 세포질을 가진 전형적인 산성화된 양상을 나타내며, 세포는 완전하고 안정적으로 생존합니다. 그러나 산성화는 여기에서 볼 수 있듯이 개별 세포 클론을 형성하며, 원형질막에서 발현된 세포 내 나트륨 양성자 교환체의 활성과 이온 선택성은 이모듐 로딩 산성화 후 이러한 그래프에서 관찰된 바와 같이 다양한 실험 조건에서 유도된 세포 내 pH의 변화를 측정하여 특성화할 수 있음을 입증했습니다.

효소 반응속도에 관해서는, 초기 흡수율에 대한 용량 반응을 추가로 사용하여 기질에 대한 친화도 상수 값과 억제제의 억제 상수 값을 도출할 수 있습니다. 실제로, 수송체의 흥미로운 특징은 서로 다른 커플링 양이온이 수송을 위해 경쟁하여 이 그림에서 볼 수 있듯이 리튬 흡수와의 경쟁에 의해 나트륨에 대한 친화도 상수를 측정할 수 있다는 것입니다. RNA 침묵과 결합된 세포 표면 BioInnovation과 같은 다른 실험은 관심 수송체가 실제로 원형질막에서 발현되는지 확인하기 위해 수행할 수 있습니다.