Name: 원자 힘 분광학에 의해 단일 분자 접착 조사 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: 학습하세요 AFM 캔틸레버 팁에 단일 고분자를 결합하여 분광학적 표면 탈착 실험을 수행하는 방법을. 폴리에틸렌글리콜 링커를 사용하여 비특이적 상호작용을 줄이고 정확한 접착력 측정이 가능합니다.

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저자는 DFG(Hu 997/2-2)의 재정 지원에 감사를 표합니다. FS는 Hanns-Seidel-Stiftung(HSS)을 인정합니다. SKr은 Elitenetzwerk Bayern의 박사 과정 프로그램인 Material Science of Complex Interfaces의 프레임워크에서 지원을 받았습니다. SKi는 SFB 863의 재정 지원에 감사드립니다.

참고 제제, 데이터 수집 및 데이터 분석 단계를 포함하는 공정 흐름의 개요에 대해도 2 참조. 1. 시약 설치 참고 : 모든 화학 물질 취급시주의해야하며, 따라서 실험실 코트, 장갑과 눈 보호가 사용되어야한다. 모든 작업은 실험실 후드에서 수행해야합니다. 특히, 특수 장갑 클로로포름 사용의 경우 착용해야합니다. <ol><li> 드라이 빠르게 클로로포름 및 저장 건조하지만 일주일 이상 이상으로 낮은 수분 함량과 화학 물질을 사용합니다. APTES ((3- 아미노 프로필) triethoxysilan가) 및 PEG (폴리에틸렌 글리콜) (표 1 참조) 때문에 -20 ℃에서 질소 또는 아르곤 가스 양쪽에서 화학 물질을 저장 흡습성과 PEG는 공기에 산화 될 수 있습니다. </li><li> 이상적으로 질소 atmosphe와 글러브 박스 시스템 내에서, 작은 분량을 준비, 대기 중 산소와 수분에 주식의 빈번한 노출을 방지하기 위해다시. </li></ol> 2. 장비 설치 주 : 가능한 교차 오염을 방지하기 위해, 각 단계에 대한 신선하고 깨끗한 혈관을 사용합니다. <ol><li> 면도 유리 및 60 ° C에서 초음파 조에서 30 분 동안 세제 용액 핀셋. </li><li> 헹군 후 초순수로 2 회 철저 2.1 단계에서 초음파 처리 장비. </li><li> RCA 용액 중의 단계 2.1로부터의 열의 장비 (초순수, 과산화수소 및 암모니아 (5 : 1 : 1))로 75 분 동안 45 ° C의 오븐이어서 초순수로 헹구고. </li><li> 마지막으로, 건조 질소의 흐름에 따라 또는 오븐 (100 ℃, 3 시간)에 유리와 핀셋을 건조. </li></ol> 3. 팁 기능화 참고 : 핀셋, 선박 등은 스테인레스 스틸, PTFE, 유리 또는 해당되는 경우 유기 용액에서 화학적으로 안정되어 다른 물질로했다. 달리 명시되지 않는 한, R의 모든 단계를 수행배양 용액의 양이 필요 T. 캔틸레버 칩의 수에 의존한다. 캔틸레버는 모든 시간에 각각의 솔루션에 몰입되어 있는지 확인합니다. 참고 : 유기 증기의 흡입을 피하기 위해 후드를 사용합니다. <ol><li> 캔틸레버 표면 ( &#39;활성화&#39;) (약 0.5 시간)에 OH-그룹의 형성 : <ol><li> 깨끗한 유리 슬라이드와 플라즈마 챔버 (100 W)에 넣어 (10 ~ 100 PN / 나노 : 죄 스프링 상수 재) 신선한 캔틸레버 칩을 배치 핀셋을 사용합니다. </li><li> 챔버 (~ 0.1 밀리바)을 대피. </li><li> 산소 가스와 홍수 챔버와 다시 대피. </li><li> (20 %, 시험 시간 : 15 분, 프로세스 압력 : 0.25 밀리바 전력) 플라즈마 처리를 활성화. </li></ol></li><li> 캔틸레버의 아미노 실란 화 (약 1 시간) : <ol><li> 플라즈마 공정 동안 이상적 이렇게 - APTES의 용액 2.5 ml를 준비 유리 페트리 접시 (표 1 참조). </li><li> Immediatel플라즈마 처리 후 Y는 아세톤에 1 초 동안 각 캔틸레버를 찍어 APTES 용액에 직후에 배치합니다. </li><li> 실온에서 15 분 동안 품어. </li><li> 조심스럽게 10 ml의 아세톤 한 번에 10 ml의 클로로포름에 두 번 캔틸레버 칩을 씻어. </li><li> 옵션 마지막 단계 : 깨끗한 유리 슬라이드에 이전 단계에서 장소 캔틸레버 칩과는 70 ° C에서 30 분 동안을 굽는다. 표면 활성화, 예를 들어, UV 처리 (12)에 대한 대안 전략도있다합니다. </li></ol></li><li> PEG 화 (약 2 시간) 참고 : 아미노 실란 화 동안 단계를 3.3.1-3.3.4 수행합니다. NHS 및 말레이 미드 그룹은 수성 환경에서 가수 분해 될 수 있으며 PEG 자체가 공기에 산화 될 수 있습니다. 따라서 (특히 단계들 사이에서) 타이밍 중요한 파라미터이다. 자세한 내용은 13를 참조하십시오. <ol><li> 클로로포름 용액 (표 1 참조)를 준비한다. </li><li> 결로를 방지하려면따뜻한 PEG은 분취 량을 열고 적절한 양을 계량하기 전에 RT까지 분말. </li><li> 폴리머 또는 아미노 그룹과 지질의 결합의 경우, 별도가 완전히 해결 될 때까지 그들을 텍싱하여 클로로포름 용액에 NHS-PEG-NHS (6 kDa의) 및 메틸 PEG-NHS (5 kDa의)를 해결한다. 농도는 표 1을 참조하십시오. <ol><li> 또한. 티올기를 갖는 중합체의 커플 링에 대해 개별적 클로로포름 용액 중에 부주의 NHS- PEG 및 메틸 - PEG-NHS를 해결한다. </li></ol></li><li> NHS- 또는 말레이 미드 및 메틸 아민 말단 PEG 분자 (: 500 전형적 1) 사이의 일정 수의 비율을 조정하기 위해 필요에 따라 솔루션을 섞는다. 이상적인 비율은 준비 - 실험 일련의 사이클에 반복적으로 결정되어야합니다. </li><li> 클로로포름의 증발을 방지하기 위해 포화 클로로포름 분위기 내에서 1 시간 동안 PEG 용액에 캔틸레버 칩 부화. </li></ol></li><li> 분자 결합을 프로브(&gt; 1 시간) : 참고 : 다음 3.4.1-3.4.3에서, AFM 팁에 서로 다른 프로브 분자의 공유 결합을위한 세 가지 예를 설명한다. 각각의 분자에 대한 프로토콜을 조정해야한다. 예 1 및 3-NHS 화학에서 실시 예 2에 티올 관능 화 된 중합체 PI- g의 -PS은 말레이 미드를 통해 화학 PEG에 결합되는 반면, 사용하는 것이 또한 참고. 세부 사항은 14를 참조하십시오. <ol><li> 폴리 (아미노산),​​ 폴리 D 티로신 (40 내지 100 kDa의) 미국 <ol><li> 1 M의 NaOH의 polytyrosine 결합 프로브 분자를 녹인다. 1 ㎎ / ㎖의 농도를 조정합니다. </li><li> 기능화 직전 스핀 탈염 칼럼 (7 kDa의 MWCO)를 사용 붕산 나트륨 완충액 (pH 8.1)에 대해 NaOH를 교환 </li><li> 에탄올 5 ㎖와 마지막 붕산 버퍼 5 ml의 클로로포름 5 ㎖, 먼저 캔틸레버를 씻어. </li><li> polytyrosine 보레이트 완충액에 1 시간 동안 캔틸레버 칩 부화 후 보레이트 완충액으로 씻어초순수. 측정 할 때까지 초순수에 저장합니다. </li></ol></li><li> 선형 골격 (폴리 이소프렌, 119 kDa의)을 갖는 그래프트 측쇄 (폴리스티렌, 88 kDa의) 14 중합체 <ol><li> 건조 클로로포름에 PI- g -PS을 녹여. 4 ㎎ / ㎖로 접합 용액의 농도를 조정. </li><li> 클로로포름 5 ㎖와 캔틸레버를 헹구고 활용 솔루션에 적어도 1 시간 동안 배양한다. </li><li> 클로로포름 5 ㎖에 다시 린스 클로로포름 포화 환경에서 클로로포름에서 측정까지 저장 (클로로포름 증발을 방지하기 위해). </li></ol></li><li> 지질 교황 <ol><li> 건조 클로로포름에 교황을 녹이고. 20 mm로 농도를 조절합니다. </li><li> 에탄올 5 ㎖ 및 지질 용액에서 1 시간 동안 인큐베이션 캔틸레버 전에 초순수 5 mL를 캔틸레버 헹군다. </li><li> 배양 후, 클로로포름 5 ㎖, 5 ㎖ 에타와 캔틸레버 린스L (이 순서대로) 따뜻한, 초순수 5 ml의 언 바운드 프로브 분자를 제거하고 클로로포름 잔류 없애. 즉시 작용 팁을 사용합니다. 필요할 때까지 또는 클로로포름에 저장합니다. </li></ol></li></ol></li></ol><img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52456/52456fig1.jpg" /> 도 1. (A) 회로도 NHS 화학의 예를 사용하여 팁 기능화 과정을 도시. 아미노기를 통해 팁 프로브 분자를 부착하기 위해 사용 (B) 화학 결합이. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52456/52456fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 4. 표면 처리 <ol><li> 자기 조립 단분자막 (SAM) 주 : 제로서, 예를 들면면, 자기 조립 단분자막이 선택되었다. 문학 (15)을 참조하십시오 </s자세한 내용은&gt;입니다. <ol><li> 각 30 분간 초음파 조에서 초순수 회 후 세제와 함께 청소 유리 슬라이드. 그런 다음, 추가 세척 단계로, 15 분 동안 75 ° C에서 RCA 솔루션 (단계 2.3 참조)에 배치합니다. </li><li> 코트 10 nm의 니켈 및 크롬 진공 코팅기 100 nm의 금 슬라이드. 그리고 바로 다음 단계로 넘어 가기 전에 RCA 용액에 다시 냉장고 청소에 저장합니다. </li><li> 12 시간 동안 2 mM의 1- 도데 칸 티올 / 에탄올 용액을 이전 단계에서의 슬라이드를 배양한다. 티올 그룹은 금 표면에 결합하여 소수성 단층 자기 조립. 질소 가스 스트림에 의해 에탄올과 초순수로 건조한 후 슬라이드를 헹군다. CCD 카메라 (10)와 각도계 정적 접촉각 측정과 준비된 표면의 소수성을 확인한다. </li></ol></li><li> 수소 종료 다이아몬드 참고 : 예를 들어 두 번째 표면은, 수소 종단 된 다이아몬드 선정. 앞서 설명한 바와 같이 16 같은 표면 처리가 수행되었다. </li><li> 지원 지질 이중층 주 : 마지막 예에서,지지 표면 지질 이중층 (SLB)이 표면으로 사용 하였다. 이러한 표면을 얻기 위해 POPC 인지질로 이루어진 대형 단층 라멜라 소포 (LUVs)의 용액 (0.1 ㎎ / ㎖) 압출 법에 의해 형성 하였다. 이어서 LUV 용액 50 μL 갓 절단 운모 시트 (A = 1 cm² 이상)에 넣어 30 분 동안 인큐베이션 하였다. 최종적으로 용액을 초순수 20 ㎖로 세정 하였다. SLB 수의 준비에 대한 자세한 설명은 17, 18를 참조하십시오. </li></ol> 5. 데이터 수집 주 : 실험을 위해, 액체에서 측정 할 수있는 기능을 제공 AFM을 사용한다. 데이터 수집 및 데이터 분석 절차에 관계없이 사용 AFM 모델을 적용 할 수있다. 또한, 일부 실험에서 그것을 그리고 온도를 제어 할 수있을 것이 유리하다액체 셀 내의 전자. 캔틸레버 휨은 레이저 빔 (19)에있어서의 편향을 통해 검출 하였다. 스프링 상수는 열잡음 방법 (20)로 측정 하였다. <ol><li> 유체의 측정에 적합 AFM 캔틸레버 홀더에 작용 캔틸레버를 삽입합니다. </li><li> (준비 위 참조) 표면을 넣어 AFM으로 샘플링하고 액체로 커버. 모두, 캔틸레버 표면은 이제 캔틸레버 팁이 표면을 향해 가리키는 액체에 몰두해야한다. 많은 경우에 액체의 드롭이 충분합니다. 임의의 경우 유체의 증발에 유체 밀폐 셀을 사용하여, 예를 들면, 피해야한다. </li><li> 해당되는 경우, 컨트롤러에 원하는 온도를 조정합니다. </li><li> 시스템은 적어도 반 시간 동안 평형하자. </li><li> 제동 효과를 어떤 표면을 배제하기 위해 멀리 표면으로부터 캔틸레버와, 캔틸레버의 열 잡음 스펙트럼을 기록한다. 참고 일반적으로 1 그0 이상의 스펙트럼은 충분한 신호 대 잡음비를 얻기 위해 축적되어야한다. </li><li> 표면에 접근. 팁 선단 형상 및 작용을 절약하기 위해 접근 방법이 신중하게 수행되어야 함을 유념. 이 들뜨는 모드에 접근, 예를 들어,에 의해 달성 될 수있다. </li><li> 나노 / 볼트에서 측정 된 역 광 레버 감도 (InvOLS)를 결정합니다. 하드 표면에 캔틸레버 끝을 눌러이 작업을 수행합니다. <ol><li> 포토 다이오드 전압의 변화 대 피에조 이동량의 기울기를 측정함으로써 InvOLS를 결정한다. 캔틸레버 팁이 표면과 접촉하는 힘 - 거리 곡선의 부분에 줄을 장착한다. 지질 이중층 같은 부드러운 표면을 포함하는 실험에서, 지질 이중층 ( &#39;결함 반점&#39;)에 적용되지 않는 지역에서이 단계를 수행한다. </li></ol></li><li> 열 잡음 스펙트럼에 고조파 발진기를 끼워 맞춤으로써 스프링 정수 (PN / 나노 미터)를 결정. 용도스프링 정수 결정을위한 자동화 된 소프트웨어 기능; 그렇지 않으면 문학 (20)를 참조하십시오. </li><li> 실험을 시작합니다. <ol><li> 각 실험 조건에서 녹음 다수의 힘 - 거리 곡선. 1 ㎛의 거리를 철회, 5 kHz에서, 1 ㎛ / 초 팁 속도의 샘플링 속도 : 일반적으로, 실험 매개 변수에 대해 다음 값을 사용합니다. 주 : 때로는 실험 연구의 역학에 따라, ( &#39;드웰 시간&#39;) 표면과 접촉 팁과 일정 시간을 기다려야 할 필요가있을 수도있다. 참고 : 실험은 특정 매개 변수는 위의 값에서 실질적으로 벗어날 수 있습니다. </li><li> 장기 측정시, 포토 다이오드의 위치를​​ 바꾸 때때로 포토 다이오드상의 레이저 위치를 제로. </li><li> 선택 사항 : 모든 힘 곡선 후, 다른 XY 위치로 AFM 팁을 변경합니다. </li><li> 실험의 끝에, 감도 및 스프링을 결정 정전류 회로시스템의 일관성과 안정성을 확인하기 위해 다시 NT. 주 : 실험 전 및 후에 스프링 정수와 감도를 비교하는 것은 상기 시스템의 특성 및 팁의 특성이 실험에 걸쳐 변하지 않도록하는 수단이다. 스프링 상수의 차이 (&lt;= 15 %)가 너무 크지 않으면 스프링 정수 결정 극한 불확실성은 또한 약 15 %이기 때문에, 그것들은 평균화 될 수있다. 큰 차이를 먼저 발견하고 추가 실험을 계속하기 전에 변경 명백한 스프링 정수에 대한 원인을 제거하는 것이 좋습니다. </li></ol></li></ol> 6. 데이터 준비 참고 : 일반적으로 뉴턴과 나노 미터뿐만 아니라 데이터가 설명되어 있습니다 해결하기 위해 단위를 변환 실험의 특정 유형의 독립적 수행이 절 일반 데이터 준비 단계에서. 실험 특정 데이터 분석은 BR 있습니다iefly는 각각의 대표적인 예 절에서보다 상세히 설명했다. <ol><li> 통상적으로, 모든 데이터 준비를 수행하고 분석 소프트웨어 IGOR 프로 6에 기초하여, 예를 들면 홈 기록 알고리즘에 의해 자동 단계. </li><li> InvOLS [나노 / V]와 스프링 정수 [윈 / 나노]로 곱하여 발효 원료 편향 신호 (Defl를) [V]로 변환합니다. </li><li> 표면 (언로드 캔틸레버)로부터 충분한 거리에서 캔틸레버에 힘이 0이되는 윈하는 방식으로 힘을 상쇄. </li><li> 실제의 선단 위치 고려 캔틸레버의 휘어짐을 얻어의 Z *, (표면에 대해 측정라고도 분리)을 계산한다 : <img alt="식 (1)" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/52456/52456eq1.jpg" /></li><li> * Z = 0면의 Z 방향 위치에 대응하는 방식으로 * Z의 오프셋. 참고 : 여기에서, F는 팁 때문에 굽힘에 작용하는 힘이다캔틸레버 (단계 6.2에서 결정.), z는 (직접 악기에 의해 주어진) k는 스프링 상수 (단계 5.8에서 결정)을 나타내는 측정 된 Z-센서 위치입니다이야. </li></ol><img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52456/52456fig2.jpg" /> 샘플 준비, 데이터 수집 및 데이터 분석을 보여주는 그림 2. 공정 흐름도. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52456/52456fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

지난 수십 년 동안, 단일 분자 실험은 분자 메커니즘에 새로운 통찰력을 제공하는 생명 과학 이후에 매우 중요한 접근 방법 드러났다. SMFS 실험 이상적으로 하나의 동일한 분자 실험의 전체 과정에 걸쳐 사용하고 의미에서 좋은 통계를 달성했다. 앙상블 분자의 실험과 대조적으로, 실험 SMFS 희귀 이벤트 및 숨겨진 분자 상태를 감지 할 수있다. 단일 분자 실험의 또 다른 장점은 분자 동력학 시뮬레이션 (24, 25)에 의해 모델링 될 수 있다는 것이다. (28) - 상기 캔틸레버 작용 프로토콜은 이전에 발행 절차 26의 수정 된 버전이다. 활성화 및 실란 화 후에 AFM 캔틸레버는 폴리에틸렌 글리콜의 두 가지 유형 (PEG) 분자 (링커 분자)의 혼합물로 작용 화된다. <p clasS = &quot;jove_content&quot;&gt; 제 링커-PEG는 불활성 메틸기 ( &quot;메틸 PEG&quot;) 및...

지난 30 년간, 원자력 현미경 (AFM)은 그것이 모든 입체적 분자 공간 해상도를 제공하고, 다양한 용매에서 동작 할 수 있기 때문에 생체 1,2- 합성 3 재료 및 표면을 연구하는 귀중한 영상 법 것으로 밝혀졌다 환경. 또한, AFM-단일 분자 힘 분광법 (SMFS)이 정권을 μN하기 위해 PN에 이르기까지 힘을 측정 할 수있게하고 4,5 단백질 층으로 예를 들어 전례없는 통찰력, 고분자 물리학 6 주신 - 8 및 단일 분자 표면의 상호 작용 (9) - 단일 분자보다는 분자의 앙상블을 공부 뒤에 12 국지적 인의 이론적 근거는 종종 드문 사건이나 숨겨진 분자 상태를 마스크 효과를 평균 방지하는 것입니다. 또한, 등 윤곽 길이, 쿤 길이, 접착 자유 에너지, 분자 매개 변수의 다수가 될 수 있습니다를 얻을. 이것은 아래의 예에서 자세히 설명되어 있습니다. 전형적인 AFM-SMFS 실험에서, 프로브 분자는 링커 분자를 통해 매우 날카로운 팁에 연결된다. 팁 자체가 굴곡 외팔보의 단부에 위치한다. 팁이 표면에 접촉되는 경우, 프로브 분자가이 표면과 상호 작용한다. 표면으로부터 분자를 분리하기 위해, 팁, 힘, 따라서 자유 에너지의 후퇴시에 캔틸레버의 편향을 관찰함으로써 결정될 수있다. 의미있는 통계를 가져, 소위 힘 - 거리 곡선 다수 획득되어야한다. 또한, 프로브 분자가 AFM 팁에 공유 적으로 결합되어야한다 (즉, 하나의 전체 실험 기간에 걸쳐 동일한 프로브를 사용하는 분자) 진정한 단일 분자 실험을 갖도록. 여기서, 공유 결합을 통해 단일 ​​분자로 기능화 캔틸레버 용 실험 프로토콜이 제시된다. 단일 분자가 하나 또는 아미노 티오 통해 연결될 수있다AFM 팁에 L 그룹. 접합 공정은 사용되는 중합체의 용 매화 특성에 대해 설명 할 (유기 및 수성) 용매의 광범위한 다양성으로 수행 될 수있다. 첫 번째 부분에서는 일반적인 프로토콜은 공유 설명 AFM 팁에 링커 분자를 통해 단일 ​​분자 ( &quot;프로브 분자&quot;)을 첨부합니다. 이를 위해, NHS- 유기 화학 또는 말레이 미드 13 사용된다. 세 개의 예시적인 분자 프로토콜과 함께, 데이터 수집 및 데이터 분석 프로세스를 설명하고 상기 판독 참조가 제공된다. 예 분자는 다음과 같습니다 (선형) 폴리머 티로신, 그라프 트 중합체 PI- g -PS 및 지질 교황. 예 공유 시스테인을 연결하는이 프로토콜의 약간의 변형을 포함한다. 또한, 섹션은 이러한 다이아몬드 표면, CH 3 - 자체 조립 단층 및 지질 이중층으로 다른 표면의 준비에 최선을 다하고 있습니다. 이러한 인터페이스는 잠을욕실은 좋은 참조 및 예제가 될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Materials</td></tr><tr><td>Hellmanex III 알칼리 액체 농축액(세제 용액)</td><td>Hellma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RCA(초순수, 과산화수소(35%), 암모니아(32%); 5:1:1(v/v/v))</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectabond 시약 / APTES(3-Aminopropyl)triethoxysilane</td><td>Vectorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>건조 아세톤(< 50ppm H2O)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>건조 클로로포름 (> 99.9%)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triethylamine</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>초순수</td><td>Biochrom, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Di-sodium tetraborate (>&nbsp; 99.5%)</td><td>, Biochrom, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>붕산</td><td>Biochrom, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monofunctional &alpha;-methoxy-&omega;-NHS PEG, 5 kDa, " 메틸 -PEG-NHS"</td><td>Rapp, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heterobifunctional &alpha;,&omega;-bis-NHS PEG, 6&nbsp; kDa, " NHS-페그-NHS"</td><td>Rapp, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heterobifunctional &alpha;-maleimidohexanoic- &omega;-NHS PEG, 5 kDa, " 말-페그-NHS"</td><td>Rapp, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>프로브 분자 (폴리머, 지질, etc.)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>주둥이가 있는 충분한 양의 유리 결정화 접시 (10&nbsp; ml), 유리 페트리 접시 (500 &micro; l) 및 유리 뚜껑</td><td>VWR International GmbH, Germany</td><td></td><td> &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>실험실 오븐 모델 UF30</td><td>Memmert, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>온도 제어 초음파 발생기</td><td>VWR International GmbH, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>플라즈마 시스템 "Femto", 100 W</td><td>Diener, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>각 유기 용제당 별도의 유리 주사기 1개</td><td>VWR International GmbH, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex 믹서</td><td>VWR International GmbH, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브 (0.5 ml 또는 1.5 ml)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettes: 10-100 &micro; l, 50-200 &마이크로; L 및 100-1,000&nbsp; &마이크로; l</td> 온도 제어 유체 셀이 있는 <td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AFM (예: BioHeater가 있는 MFP-3D)</td><td>Asylulm Research, Santa Barbara</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soft SiN 캔틸레버, 일반적으로 질화규소(SiN)로 만든 캔틸레버(스프링 상수는 100 pN/nm 미만, 예: MLCT)</td><td>Bruker AXS, Santa Barbara</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

원자 힘 분광학에 의해 단일 ​​분자 접착 조사

Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy

원자 힘 분광법은 표면 및 계면의 분자를 연구하는 이상적인 도구입니다. 공유 AFM 팁 위에 몇 단일 분자의 큰 다양한 실험 프로토콜을 제시한다. 동시에 AFM 팁은 AFM 팁에 부착 된 단일 분자를 연구하기위한 필수 조건이다 팁과 기판 사이의 비특이적 인 상호 작용을 방지하기 위해 비활성화된다. 분석은 부착력, 접착 길이, 곧 발표되고 상기 판독을위한 외부 참조가 제공되는 고체 표면과 바이오 인터페이스에 대한 이들 분자의 자유 에너지를 결정한다. 예 분자는 폴리 (아미노산) polytyrosine이며, 그래프트 중합체 PI- g -PS 및 인지질 POPE (1- 팔미 토일 -2- oleoyl- SN -glycero -3- phosphoethanolamine). 이 분자는 CH 3 -SAMs 같은 다른 표면, 수소 종료 다이아몬드로부터 탈착 다양한 용매 조건에서 지질 이중층을 지원합니다. 마지막으로,힘 분광 단일 분자 실험의 장점은 진정한 단일 분자 실험에서 연구 된 경우 수단​​이 결정을 포함하여 논의된다.

이하, 상술의 결과는, 예를 분자, 즉 중합체 폴리 (아미노산)을 설명 polytyrosine, 그래프트 중합체 PI- g -PS 및 인지질 POPE가 제시된다. 우선 각 실시 예에 대해, 제공되는 데이터 수집 및 데이터 준비에 대한 특정 세부 사항을 실험. 그런 다음, 이러한 분자가 다른 표면에서 탈착 된 실험 실시 결과 (CH 3 -SAMs, 수소 종료 다이아몬드 및 지질 이중층)가 표시됩니다. 접착력, 접착 길이 및 자유 에너지의 측정이 도입된다. 예 1 : 자기 조립 단분자막에서 polytyrosine의 탈착 에탄올의 함량이 변화하는 다른 솔루션 소수성 polytyrosine SAM에서의 탈착을 측정 하였다. 위에 적어도 300 구동력 D 바와 같이 각 용액 중의 캔틸레버 InvOLS 스프링 상수를 측정 하였다istance 흔적은 각 솔루션을 남겼습니다...

다양한 단일 분자를 AFM 팁에 공유 결합하는 프로토콜이 제시됩니다. 고체 지지체 및 생체 계면에서 이러한 분자의 접착력과 자유 에너지를 결정하기 위한 절차와 예가 제공됩니다.

Atomic force spectroscopy is an ideal tool to study molecules at surfaces and interfaces. An experimental protocol to couple a large variety of single ...

본 절차의 전반적인 목적은 단일 고분자를 AFM 캔틸레버 팁에 결합하여, 동일한 분자를 대상으로 표면 탈착 분광 실험을 여러 번 반복 수행하는 것입니다. 이를 위해 먼저 팁 표면을 플라스마 활성화하여 하이드록실기를 형성하고, 두 번째 단계로 아미노 실란화 테스트 용액을 사용하여 팁 표면에 아미노기를 형성합니다.세 번째 단계는 아미노기에 폴리에틸렌 글리콜 분자를 결합하는 것입니다. 이는 팁과 기판 사이의 비특이적 상호작용을 방지하며, 폴리머를 위한 링커 분자 역할을 합니다. 마지막으로, 폴리머를 폴리에틸렌 글리콜 분자에 접합하여 프로브를 형성합니다.측정 결과, 이 절차를 통해 하나의 폴리머 힘 프로브로 전체 실험 세트 또는 수백 개의 힘-거리 곡선을 측정하는 것이 실제로 가능하다는 점이 시사되었습니다. 앙상블 방법과 비교하여 단일 분자 실험이 갖는 주요 장점은 앙상블 평균화 과정에서 가려질 수 있는 희귀한 형태와 드문 상태를 연구할 수 있다는 것입니다. 또한 이러한 실험은 규모가 작기 때문에 분자 동역학 시뮬레이션과 직접적으로 비교할 수 있습니다.첫 번째 단계는 캔틸레버 팁에 프로브 분자를 공유 결합으로 부착하는 것입니다. 신선한 silicon nitride 캔틸레버 칩으로 시작하되, 스프링 상수가 10~100 pN/nm인 칩을 사용하십시오.핀셋을 사용하여 이를 깨끗한 유리 슬라이드나 페트리 접시에 놓습니다. 다음으로, 챔버를 진공 상태로 만든 후 0.25 millibar의 산소로 퍼징하며 20 watts에서 15분 동안 작동시킨 100 watt 플라스마 챔버에 칩이 놓인 슬라이드를 넣습니다. 다음 단계에서는 플라스마 공정 중 유기 증기를 흡입하지 않도록 후드를 사용하십시오.유리 페트리 접시에 2.5 milliliters의 테스트 용액을 넣어 캔틸레버의 아미노 실릴화(amino silanization)를 준비합니다. 또한, 아세톤이 담긴 용기를 준비합니다. 플라스마 처리가 완료된 직후에 캔틸레버를 회수합니다.각 캔틸레버를 아세톤에 1초 동안 담근 후, Optus 용액에 넣으십시오. 다음 단계로 넘어가기 전, 실온에서 캔틸레버를 15분 동안 배양합니다. 캔틸레버가 배양되는 동안, 구성 요소에 물과 공기가 미치는 영향을 최소화하기 위해 페길화(pegylation) 준비를 시작하십시오.m PEG, NHS가 포함된 튜브 하나와 염료가 포함된 다른 하나로 미리 준비된 eph 튜브를 준비합니다. NHS Peg. 각 튜브 내용물의 무게를 측정합니다.다음으로, EG NHS가 들어 있는 튜브를 사용하여 클로로포름을 첨가할 준비를 합니다. 최종 농도가 25 millimolar가 되고, 이후 단계에서 캔틸레버를 충분히 덮을 수 있는 양의 클로로포름을 붓습니다. 튜브를 볼텍스 믹서에 올려 분말이 완전히 녹도록 합니다.EG NHS가 들어 있는 튜브를 따로 두고 식이 성분을 준비합니다. NHS peg에 최종 농도가 0.25 millimolar가 되도록 chloroform을 첨가합니다.분말이 완전히 용해되도록 볼텍스 믹서를 사용하십시오. 다음으로, 용액들을 혼합하여 diet NHS peg와 methyl peg NHS 분자 사이의 비율을 조정합니다. 이 비율은 일반적으로 1:500입니다.증발을 제한하기 위해 뚜껑이 있는 작은 유리 페트리 접시를 준비하고, 캔틸레버가 될 혼합물을 채웁니다. 배양을 마칩니다. APT 테스트 용액 내에서, 세척을 위해 아세톤 약 10 milliliters가 담긴 용기 두 개와 클로로포름이 담긴 용기 하나를 준비합니다.각각의 캔틸레버를 아세톤에 두 번, 클로로포름에 한 번 담근 후 폴리에틸렌 글리콜 용액에 넣습니다. 디쉬의 뚜껑을 덮고 캔틸레버를 용액 속에 유지합니다. 1시간 동안, 이번 실험에서 사용할 프로브 분자인 폴리 아미노산 poly de tyrosine의 공유 결합을 준비합니다.1 M 수산화나트륨 용액에 프로브 분자를 1 mg/mL 농도가 되도록 녹여 준비합니다. poly D tyrosine의 경우, 기능화 직전에 수산화나트륨을 pH 8.0~8.5의 붕산나트륨 완충액으로 교체하십시오.캔틸레버의 폴리에틸렌 글리콜 용액 내 배양이 완료되면, 세척을 위한 세 개의 용기와 폴리티로신 보어 용액 용기를 준비합니다. 세척용 완충 용액은 클로로포름 5 mL, 에탄올 5 mL, 보어 완충액 5 mL입니다. 폴리티로신 보어 완충 용액은 약 300 µL를 사용합니다.캔틸레버를 회수하여 각각 클로로포름, 에탄올, 그리고 Borate 완충액 순으로 침지합니다. 폴리티로신 Borate 완충액 용액에 넣기 전, 캔틸레버 칩을 1시간 동안 배양하십시오. 1시간 후, 캔틸레버 세척을 위해 한 용기에 Borate 완충액 5 mL를, 다른 용기에 초순수 5 mL를 준비하고, 보관용 초순수 20 mL도 함께 준비하십시오.캔틸레버를 준비하여 각각 Boite 버퍼에 담근 후, 초순수로 헹굽니다. 그런 다음 보관을 위해 초순수에 담가 둡니다. 이제 캔틸레버를 데이터 수집에 사용할 수 있습니다.AFM 팁의 기능화와 표면 준비 및 장착이 완료되면, FM 데이터 수집 단계를 시작하십시오. 먼저 기능화된 캔틸레버를 액체 내 측정에 적합한 AFM 캔틸레버 홀더에 장착하십시오. 그다음, 캔틸레버 홀더를 AFM 헤드에 연결하십시오.유체 셀에 물을 부어 캔틸레버와 표면을 침전시킵니다. 그런 다음 AFM 헤드를 액체 셀 위로 내립니다. 시스템이 최소 30분 동안 평형 상태에 도달하도록 둡니다.평형 도달 후, 캔틸레버를 표면에서 멀리 배치한 다음 열 잡음 스펙트럼을 기록하십시오. 표면 감쇠 효과를 배제하기 위해 충분한 신호 대 잡음비를 얻으려면 10개 이상의 스펙트럼이 필요합니다. 그 다음, 표면에 조심스럽게 접근하여 역 광학 레버 감도를 측정하십시오.이는 캔틸레버 팁을 딱딱한 표면에 밀어 넣어 피조 이동 거리에 따른 힘을 기록하는 과정을 포함합니다. 접촉 동안의 기울기를 측정하고 이를 역전시켜 역광학 레버 민감도를 결정합니다. 다음으로, 역광학 레버 민감도와 열 잡음 스펙트럼을 이용하여, 열 잡음 스펙트럼에 조화 진동자를 피팅함으로써 캔틸레버의 용수철 상수를 결정합니다.이제 데이터 수집을 위한 적절한 파라미터를 설정하십시오. 데이터 수집 마지막 단계에서 각 실험 조건에 대해 다수의 강제 거리 곡선을 기록하십시오. 시스템의 일관성과 안정성을 확인하기 위해 민감도와 용수철 상수를 다시 측정하십시오.빨간색으로 표시된 이 강제 거리 트레이스(forced distance trace) 예시는 메틸 자기조립 단분자층(methyl self-assembled monolayer) 내의 불순한 물로부터 폴리티로신(poly tyrosine)을 수축시킨 결과입니다. 힘이 0으로 급격히 떨어지는 단일 단계는 단일 분자의 분리를 나타냅니다. 검은색으로 표시된 것은 시그모이드 피팅(sigmoidal fit) 결과입니다.추출된 플래토 길이(plateau length)와 플래토 힘(plateau force)이 화살표로 표시되어 있습니다. 캔틸레버의 신장 및 수축 속도는 0.5 microns per second였으며, 표면 체류 시간은 1 second였습니다. 측정 시 액체 환경의 차이로 인해 추출된 플래토 힘에 변화가 발생했습니다.이 히스토그램들은 순수 물과 물-에탄올 혼합물에서의 측정에서 추출된 플래토 힘(plateau force)을 나타냅니다. 각 용액당 동일한 단일 폴리머에서 최소 300회의 힘-거리 추적(force distance traces)이 기록되었습니다. 여기서는 순수 물과 물-에탄올 혼합물에서 추출된 플래토 길이(plateau length)에 대한 유사한 히스토그램이 제시되어 있습니다.에탄올을 첨가하면 폴리티로신과 표면 사이의 소수성 상호작용이 약화되어 고원력(plateau force)이 낮아지고 고원 길이(plateau length)가 감소합니다. 이러한 내용은 피크 고원 길이 대 피크 고원력을 나타낸 이 도표에 요약되어 있습니다. 숙련되면 기능화 프로토콜은 개발 후 약 4시간 만에 완료할 수 있습니다.이 기술은 물리학 및 화학 분야의 연구자들이 계면에서의 폴리머 접착 및 파괴를 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.

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Research

연구

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Engineering

공학

두 분자가 상호 작용하는 세포의 표면에 고정하는 경우 수용체 - 리간드 상호 작용 속도론을 측정하는 접착 주파수 분석이 설명되어 있습니다. 이 기계 기반의 분석은 수용체와 리간드를 상호 작용으로 micropipette - 압력 인간의 붉은 부착 센서와 같은 혈액 세포와 인테 αLβ2과 세포 유착 분자 - 1을 사용하여 exemplified입니다.

에 대한 접착 주파수 분석 현장에서</em셀 - 셀 인터페이스에서 교차 Junctional 분자의 상호 작용> 속도론 해석

셀룰로솜은 셀룰로오스를 소화하도록 설계된 다효소 복합체입니다. AFM 기반 SMFS는 셀룰로솜 관련 단백질 어셈블리의 기계적 특성과 접힘 구성을 연구하는 데 사용되었습니다. 우리는 셀룰로솜 조립에 관여하는 개별 수용체-리간드 복합체의 상호 작용을 연구하기 위해 단백질 고정화, 데이터 수집 및 데이터 분석을 위한 완전한 워크플로우를 제시합니다.

AFM 기반 Single-molecule Force Spectroscopy를 사용한 셀룰로솜의 수용체-리간드 시스템 조사

콜로이드 프로브 나노스코피는 다양한 분야에서 사용하여 콜로이드 시스템의 물리적 안정성과 응고 역학에 대한 통찰력을 얻고 생물학적 시스템을 사용하여 약물 발견 및 제형 과학을 지원할 수 있습니다. 에 설명된 방법은 이러한 시스템을 연구하기 위한 양적 및 질적 수단을 제공합니다.

콜로이드 프로브 Nanoscopy을 사용하여 입자 간 상호 작용의 양적 및 질적 시험

여기서 우리는 원 자간 력 현미경 (AFM)을 사용하여 단일 분자 힘 분광법 측정에 의해 잘 정의 된 무기 표면 중 펩티드 또는 아미노산의 상호 작용의 힘을 측정하기위한 프로토콜을 제시한다. 측정으로부터 얻어진 정보는 더 펩타이드 무기물 계면을 이해하는 것이 중요하다.

단일 분자 힘 분광학을 사용하여 무기 재료와 아미노산 및 펩타이드의 상호 작용에 대한 통찰력

우리는 상세한 절차 및 전략 기계적 특성 및 기계적 전개 경로 원자 힘 현미경을 사용 하 여 단일 단백질 분자의 측정을 설명 합니다. 우리는 또한 선택과 좋은 단일 단백질 분자 기록의 정당성에 대 한 참조로 대표적인 결과 보여줍니다.

원자 힘 현미경을 사용 하 여 단일 단백질 분자 힘 분광학

이 프로토콜에 설명 합니다 heterobifunctional 실 란 커플링 에이전트와 원자 힘 현미경 검사 법 기반 단일 분자 힘 분광학을 위한 실리콘 산화물 표면에 의해 궁 행 되는 단백질의 화학식 동원 정지는 RrgA의 상호 작용 (pilus-1 팁 adhesin의 S. 균) fibronectin 함께.

단일 분자 힘 분광학에 대 한 단백질의 화학식 동원 정지

여기에서, 우리는 통제된 순서로 단백질 중합체를 형성하는 효소에 의해 단백질 단량체를 융합하고 단 분자 힘 분광법 연구를 위한 표면에 그것을 고정화하는 프로토콜을 제시합니다.

단일 분자 힘 분광학을 위한 OaAEP1 중재된 효소 합성 및 중합단백질의 고정화

원자력 현미경 검사법 (AFM) 캔틸레버 팁에 프로브 분자의 공유 부착은 물리적 특성의 조사를위한 필수적인 기술입니다. 이를 통해 높은 재현성을 가진 AFM 기반 단일 분자 힘 분광학을 통해 연신력, 탈착력 및 폴리머 길이를 결정할 수 있습니다.

AFM 기반 힘 분광학을 위한 단일 분자의 공유 부착

앙상블 힘 분광법(EFS)은 생물물리학 및 생물감지 분야에서 생체 분자 구조의 앙상블 세트의 기계적 풀림 및 실시간 감지를 위한 강력한 기술입니다.

전단력에 의한 앙상블 힘 분광법

우리는 단일 분자 형광 이미징을위한 최소화 유체 역학적 크기 콜로이드 양자 점의 준비에 대해 설명합니다. 기존의 양자 점에 비해,이 나노 입자는 구형 단백질의 크기와 비슷합니다 및 단일 분자 밝기, photodegradation에 대한 안정성 및 단백질과 세포에 특이 현상 바인딩에 대한 저항에 최적화되어 있습니다.

단일 분자 이미징을위한 소형 양자 점

학습하세요 AFM 캔틸레버 팁에 단일 고분자를 결합하여 분광학적 표면 탈착 실험을 수행하는 방법을. 폴리에틸렌글리콜 링커를 사용하여 비특이적 상호작용을 줄이고 정확한 접착력 측정이 가능합니다.

원자 힘 분광학에 의해 단일 ​​분자 접착 조사

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