Name: 전방 시상 핵의 깊은 뇌 자극 후 쥐 해마의 유전자 발현 변화 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: 배우세요 전방 시상 핵의 깊은 뇌 자극 후 쥐 해마에서 BDNF와 GABRD 유전자 발현 변화를 분석하는 방법을. 이 기술은 뇌전증 및 기타 신경 질환의 치료 메커니즘을 이해하는 데 도움이 됩니다.

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NREF 재단의 지원에 감사드립니다.

참고 : 윤리 문 :이 원고에서 설명하는 모든 절차는 (실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드) 동물 연구에 대한 NIH의 지침에 따라이며, 하버드 의과 대학 IACUC위원회에 의해 승인됩니다. 1. 수술 전 준비 <ol><li> 모든 수술 도구 중 하나를 고압 증기 멸균 또는 필요에 따라 소독액 및 / 또는 에탄올로 세정 소독되어 있는지 확인합니다. 가능하다면, 이러한 메스, 바늘과 주사기로 멸균 일회용 장비를 사용합니다. </li><li> 수술 용 드레이프와 워크 벤치를 커버 가능한 생물 학적 폐기물 처리가 있는지 확인합니다. </li><li> 쥐의 체중 및 마취 량을 계산한다. 쥐를 마취 케타민 / 크 실라 믹스 (케타민 75 ㎎ / ㎏과 크 실라 10 ㎎ / ㎏)를 사용합니다. 주 : 200-250g가 정위 프레임에서의 적절한 정착 동물뿐만 아니라 ATN의 정확한 표적화를위한 최적의 중량 사이이다. Isoflur메탄은 마취 제로서 사용할 수있다. </li><li> 마운트 및 보안 두 멸균 전극 전극 홀더 (고압 증기 멸균 또는 에틸렌 산화물 살균) 정위 수술 프레임 및 현미경 (10-40X 배율)의 도움으로 (그림 2), 적절한위한 전극의 끝을 검사 정렬. 두 개의 전극 간격 3.0 mm를 고정합니다. 참고 : 하드 표면에 접촉하여 전극의 끝 부분이 손상되지 않도록주의하십시오. </li></ol> 2. DBS 수술 <ol><li> 케타민 / 크 실라는 동물에게 복강 혼합 동물 (발가락 - 핀치 반사, 호흡 속도와 깊이와 호흡의 규칙 확인하여) 마취의 수술 비행기에 도달 한 것으로 확인 주입한다. 절개됩니다 두피의 영역에서 머리를 제거하고 각 베타 딘, 알코올 또는 멸균 식염수 중 3 교대 스크럽과 두피를 소독. 안전하고 정위 FRAM에 동물의 위치를전자. </li><li> 최적 상태에서 동물의 체온을 유지하기 위해 순환 온수 패드를 사용한다. 과잉 드라이로부터 보호하기 위해 동물의 눈에 눈 윤활제를 적용합니다. </li><li> anterioposterior -1.6 mm, mediolateral 1.5 mm 및 5.2 mm 1 dorsoventral 다음 정위 ATN (전방 시상 핵을) 대상에 대한 좌표를 사용합니다. 참고 : 정위 좌표 Paxinos 왓슨 (6 일 판) 쥐의 뇌지도 책 (36)를 기준으로합니다. </li><li> 두피의 절개 sagittally 두개골을 공개합니다. 견인기의 쌍 두피 절개를 사용하여 고정 두개골을 노출시킨다. 절개를 세척 멸균 식염수를 사용합니다. 절개가 너무 젖은 경우, 건조 멸균 면봉을 사용합니다. 브레 그마을 찾아 검은 색 마커 표시합니다. 코론에 시상 봉합 1.6 mm 후방에서 mediolaterally 양쪽에 약 1.5 mm에서 두 개 더 마르크을하기 위해선, 버 구멍의 위치를​​ 안내하는알 봉합. </li><li> 버 홀을 만들었다 휴대용 드릴을 사용한다. 버 구멍의 끝이 에탄올로 소독하여 멸균 있는지 확인합니다. 드릴 때 두개골 표면에 45 °에 대한 각도로 드릴을 잡고. 자주 버 어가 구멍의 위치에 과도한 열을 피하기 위해 두 버어 구멍 전환. </li><li> 경질이 노출 될 때까지 시추를 계속합니다. 그 팁을 구부리고가 &#39;L&#39;의 모양을 닮은와 바늘을 사용하여 전극의 삽입을 방해 할 뼈의 깨진 조각을 제거합니다. 구부러진 바늘을 사용하여 뼈 조각을 제거하는 동안 기본 경질 및 / 또는 뇌 조직 손상되지 않도록주의하십시오. 참고 : 무딘 바늘 또는 미세 무딘 집게를 사용하여도 옵션입니다. </li><li> 정위 프레임의 회전 핸들 이중 전극 조립체를 고정 및 90 ° 각도로 핸들을 고정한다. 정위 프레임의 조정을 사용하여 정확히 정수리 위의 왼쪽 전극을 배치합니다. </li><li> 스테레오를 사용하여전술 조정 mediolateral 포지셔닝 정확하게 지금 완벽 관상 봉합사 따라 정렬 개의 전극이 존재하지만 브레 그마로부터 mediolaterally 1.5 mm 이격되도록 브레 그마의 좌측의 좌측 전극 1.5 mm 이동. </li><li> anterioposterior 정위 조정을 사용하여 관상 봉합에 전극 1.6 mm 후방 이동합니다. </li><li> 버 구멍이 버 구멍의 거친 가장자리를 건드리지 않고, 전극이 쉽게 삽입 할 수 있도록 올바른 위치에서 수행 된 경우 먼저 확인 전극을 낮추기 위해 dorsoventral 조정을 사용합니다. 그렇다면, 두개골의 표면으로부터 5.2 mm의 깊이로 전극을 삽입한다. </li><li> 130 Hz로 설정 자극기, 2.5 V, 90 마이크로 초 펄스 폭 1로 리드를 통해 전극을 연결합니다. </li><li> 시간 고주파 자극을 전달 (또는 실험 구성에 따라, 소망의 시간). 자극 과정 동안, (P)을 보장하는 기억정기적으로 발가락 핀치에 응답에 발 철수의 부재를 확인하여 로퍼 마취 깊이. 마취를 유도하기 위해 사용되는 대략 절반 초기 투여 량으로 마취를 보완. 마취 깊이를 검사 할 때 멸균 장갑의 오염을 방지하고 필요한 경우 변경합니다. 하나의 실험 요구에 따라 일방적 또는 양자 자극을 수행합니다. 이러한 저주파 자극 등의 컨트롤 (예를 들어합니다., 10 Hz에서)와 (후속 자극에 전극을 삽입) 비자극 동물을 포함합니다. </li><li> 자극이 완료되면, 조심스럽게 전극을 제거하고 3-0 봉합 또는 멸균 수술 스테이플 절개를 봉합. </li><li> 피하 통증으로 부 프레 노르 핀 (0.05 ㎎ / ㎏)을 관리합니다. 정상 활동으로 복귀 할 때까지 동물을 모니터링하고 주거 시설로 돌려줍니다. </li><li> 실험적인 디자인을 기반으로 시간의 집합 기간 후 (예 : 0, 3, 6 또는 12 시간 후 DBS 수술)마취 과다 복용으로 동물을 안락사. 활력 징후의 유무를 확인한 후, 동물을 목을 벨. </li><li> 제 가위를 사용하여 피부를 제거하여 뇌를 해부. 해부 가위를 사용하여 시상 ​​봉합을 따라 뼈를 잘라. 양쪽 측면에있는 뼈를 통해 두 개 더 절개 (인치에 대한 각)를 확인합니다. 집게를 사용하여, 뇌를 노출 두개골의 뼈의 상부로부터 부분적으로 절단 된 부분을 들어 올려. </li><li> 미세 가위 나 집게를 사용하여 두개골에서 뇌을 제거하고 얼음 차가운 PBS와 페트리 접시에 전송할 수 있습니다. 주 : 뼈를 통해 절개를하는 동안 뇌에 손상을 방지하기 위해주의하십시오. </li></ol> 3. 해마 분리 참고 : 얼음이 섹션의 모든 후속 단계를 수행합니다. <ol><li> 얼음에 미리 냉각 아크릴 뇌 매트릭스에 두뇌를 놓습니다. 면도날을 사용하여, 전방 가장 ED에서 coronally 약 7-8mm 뇌를 잘라뇌의 GE. 첫 번째 컷에 두 번째 coronally 컷과 후방을 확인하도록 약 5 mm 두께의 뇌 조각을 제거 할 수 있습니다. </li><li> 얼음처럼 차가운 PBS와 페트리 접시에 뇌 조각을 전송합니다. 면도날을 사용하여, 두 개의 반구형 부분을 절단하고, 각각 좌우에 대응하는 반구 유의 돌. 일방적 인 자극을 수행하는 동안이 특히 중요합니다. </li><li> 미세 집게와 가위를 사용하여 조심스럽게 해마를 제거합니다. </li><li> 플래시 후속 RNA 추출 단계에 대한 준비가 될 때까지 -20 ° C 냉장고에 드라이 아이스와 저장소의 해마 조직을 동결. 주 : 장기 저장을 위해, 그것 -80 ° C에 냉동 조직을 저장하는 것이 바람직하다. </li></ol> 4. RNA 추출 및 정량 PCR <ol><li> 조직을 균질화를 위해 준비 될 때까지 드라이 아이스에 냉동 상태를 유지해야합니다. </li><li> 주 : 후드에서이 단계를 수행합니다. <ol><li> HIPP에 트라이 시약 1 ML을 추가조직이 작은 조각으로 깨진 될 때까지 1.5 ML의 원심 분리기 튜브 ocampal 조직과 먼저 피펫 여러 번하여 균질화. 더 나아가 깨지지 보이는 조직이 없을 때까지 25 G 바늘 주사기를 통과함으로써 조직을 균질화. 얼음에 균질화 단계를 수행합니다. </li><li> 조직을 균질화 한 후, 세포 용해를 허용하는 세포 현탁액은 실온에서 5 분간 방치한다. 참고 :이 시점 후 세포 현탁액은 냉동 및 추가 처리 할 때까지 -70 ° C에서 저장 빠르게 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 0.2 ㎖의 클로로포름을 첨가하고, 20 초 동안 볼 텍싱하여 혼합하고 15 분 동안 실온에서 용액을 방치. </li><li> 4 ℃에서 15 분 동안 12,000 XG에서 샘플을 원심 분리기. 원심 분리 후, 볼 수 있습니다 세 가지 별도의 레이어를 방해하지 않고 신중하게 튜브를 제거합니다. 참고 : 아래 (빨간색) 단계는 단백질을 포함, 중간 흐린 단계는 DNA를 포함하고 톱 클리어 단계는 R을 포함NA. </li><li> 신선한 1.5 ml를 원심 분리 관으로 톱 클리어 위상 (RNA)를 전송 (일반적으로 위상을 함유하는 500 ㎕의 RNA가 얻어진다). 여기에 0.5 ml의 이소프로판올을 추가하고 와동에 의해 혼합. 여기에 RNA의 캐리어로 2 ~ 3 μL 글리코겐 (20 ㎎ / ㎖)를 추가합니다. 샘플을 10 분 동안 실온에서 테이블 위에 올려 놓지. </li><li> 4 ℃에서 1 시간 동안 12,000 XG에 샘플을 원심 분리기. RNA 펠렛은 튜브의 바닥에서 볼 수 있는지 확인합니다. </li><li> 뜨는을 취소하고 75 % 에탄올 1 ㎖를 추가하여 RNA 펠렛을 씻어 (뉴 클레아 무료 물로 만든). 펠릿은 관의 바닥에서 상기 용액으로 제거 될 수레까지 시료를 여러 번 전환. 4 ℃에서 10 분 동안 12,000 XG에 솔루션을 원심 분리기. 참고 : 75 % 에탄올 펠릿을 상기 단계까지 -20 ℃에서 저장 될 수있다. </li><li> 실온에서 5 분 오픈 튜브를 남겨 건조 공기 RNA 펠렛을 허용합니다. 비켜을 방지하기 위해 예방 조치를 타고이것은 다음 단계에서의 물에의 용해에 영향을 미칠 수있는 바와 같이 펠릿을 건조 r에. </li></ol> 5. RNA 준비에서 DNA를 제거 <ol><li> RNA 펠렛에 뉴 클레아 무료 물 9 μl를 추가하고 펠렛 부드럽게 튜브를 텍싱에 의해 진행하기 전에 용해되어 있는지 확인합니다. 이 10 배의 DNase I 버퍼의 1 μL, 1 μL (의 DNase I 키트) 재조합의 DNase를 추가하려면, 간단하게, 부드럽게 튜브를 쓸어 넘겨 혼합 튜브를 회전하고 30 분 동안 물을 욕조에 37 ℃에서 배양한다. </li><li> 샘플 (DNase의 I 키트) 2 μL DNase의 불 활성화 시약을 추가하고 2 분 동안 실온에서 품어 부드럽게 튜브를 가볍게 치면 자주 섞는다. 신선한 1.5 ㎖의 원심 분리 관에 10 분 맑은 상층 액의 약 10 μl를 전송 12,000 XG에 원심 분리기. </li><li> nanodrop 또는 분광 광도계를 사용하여 RNA 농도를 측정한다. </li></ol> 6. RNA에서 cDNA를 만들기 <ol><li> 필요한 볼륨 번째 추가1 μg의 RNA를 포함하고 클레아없는 물을 첨가하여 8 μL로 전량에 가져다. 여기에 1 μL 된 10 mM의 dNTP 믹스와 첨자 첫 스트랜드 합성 키트 임의 헥사 1 μl를 추가합니다. 부드럽게 섞어 어느 수욕 또는 미리 프로그램 된 열 순환기에 5 분 동안 65 ° C에서 배양한다. </li><li> 10 배 RT 버퍼, 25 M의 MgCl 2, 0.1 M DTT의 2 μL와의 RNAse OUT 1 μL (40 U / μL)의 4 μL 2 μL 다음 시약을 포함하는 프리믹스를 확인합니다. 참고 : 주어진 볼륨이 반응 당 있으며, 사용자는 하나의 실험의 필요에 따라 확장 할 필요가있다. </li><li> 65 ° C에서 샘플을 포함하는 RNA를 분리 한 후, 분 동안 실온에서 튜브를 설정합니다. 9 μL 프리믹스 용액을 첨가하고, 2 분 동안 실온에서 배양한다. 슈퍼 스크립트 II 역전사 효소 1 μL (50 U / μL)를 첨가하고 10 분 동안 실온에서 배양한다. </li><li> 50 42 ° C에서 샘플을 품어분 역전사가 발생 할. </li><li> 15 분 반응을 정지하고 70 ° C에서 샘플을 인큐베이션. </li><li> 얼음에 샘플을 잠시 놓고 1 μL RNaseH를 (2 U / μL)를 추가하고 20 분 동안 37 ℃에서 배양한다. </li><li> 짧게 응축 액체를 스핀 다운 3,000 XG에서 튜브를 원심 분리기. 주 :이 정량적 PCR에 사용되는 cDNA를이다. cDNA를 PCR 설정 될 때까지 -20 ℃ 냉동고에 저장 될 수있다. 또한 cDNA를 PCR로 진행하기 전에 자유 클레아 물로 희석 될 수있다. </li></ol> 7. 정량 PCR <ol><li> 다음과 같은 시약을 포함하는 마스터 믹스 (주어진 볼륨은 반응 기준입니다) 확인 : 배 SYBR 녹색 믹스의 6.3 μL, 앞으로 프라이머 (10 μM)의 0.6 μL, 역방향 프라이머 (10 μM)의 0.6 μL 및 뉴 클레아 무료 물 0.5 μl의 . 주 : 프라이머 디자인을 사용하여 수행 하였다 관심 NCBI 유전자의 염기 서열 페이지 옵션 &#39;프라이머 선택&#39;을. </li><li> 96 잘 PCR 플레이트의 각 웰에 10 μL의 mastermix를 추가합니다. 이전에 잘 mastermix를 포함하는 제작 된 cDNA의 2.5 μl를 추가합니다. 각 샘플에 대해 세중 PCR 반응을 설정해야합니다. </li><li> mastermix 및 cDNA의 첨가를 완료 한 후, 웰을 밀봉하는 광 접착 시트를 사용하여 PCR 플레이트를 커버. 우물의 바닥에 모든 액체를 해결하기 탁상 원심 분리기 500 XG에서 5 분 동안 짧게 플레이트 스핀. </li><li> 미리 프로그램 된 RT-PCR 기계에 PCR 플레이트를 넣습니다. 표 1에 제공된 PCR 파라미터를 사용한다. </li><li> 데이터 분석 : 추가 계산에 대한 qPCR에 출력에서 C의 t 값을 사용합니다. 내부 통제 유전자 PCR 반응을 설정 테스트 유전자와 함께, 18S rRNA 유전자는과 β - 굴지 (음성 대조군) (동일한 입력을 보장하기 위해). ΔΔCt 방법 (37)에 따라 배의 변화를 계산합니다. </li></ol>

저자는 공개하지 않았습니다.

Benabid 등의 등으로 랜드 마크 작업에 따라. 파킨슨 병 및 태성 진전을 치료하는 뇌 심부 자극을 사용하여, DBS 수술 기법은 많은 신경 장애 6,10,43을 치료하기 위해 지난 10 년 동안 많은 관심을 가지고 연구되어왔다. 뇌 회로의 다양한 신경 해부학 지역을 대상으로 DBS 연구는 현재 주요 신경 질환을 해결하기 위해 많은 그룹에 의해 수행되는 임상 시험의 다양한 단계에있다. 시상 핵 (STN) 또는 글로 창백 (GPI)의 내부 세그먼트의 자극은 FDA 승인 및 파킨슨 병 (10)에 운동 장애의 치료에서 사용된다. SANTE 임상 시험은 전방 시상 핵 (31)의 고주파 자극을받는 간질 환자를위한 유망 추세를 보이고있다. 단계의 결과는 내가 양측 결막 자극의 임상 시험은인지 기능 저하와 다시 속도의 지연을 보여 주었다메모리 회로부 8,44의 활성화뿐만 아니라 알츠하이머 병에서 본 hypometabolic 글...

전기적으로 뇌 회로를 자극 할 가능성이 2 탐험 때 신경 외과 기술로 뇌 심부 자극의 발전 뒤에 역사는 1870 년대로 거슬러 올라간다. 신경 장애의 치료 만성 고주파 자극의 사용은 1960 년에 시작 3. 나중에 만성 이식 DBS 전극 4-6의 출현으로 1990 년, DBS로 처리 하였다 신경 질환의 수는 계속 증가. 뇌 심부 자극 태성 진전 제 6 치료제로 미국에서 사용 하였다. 오늘 수술은 현재 약물의 개입에 의해 치료할 수있는 신경 질환을 치료하는 데 널리 사용된다. DBS는 현재 파킨슨 병 및 근긴장 7-9의 운동 장애를 치료하는 데 사용된다. 알츠하이머 형 치매, 헌팅 톤병, 간질, 통증 및 신경 정신 질환 우울증, 강박 장애, 뚜렛7; 증후군 및 중독 DBS 10-12로 처리 의무 조건의 일부입니다. DBS 수술 FDA는 파킨슨 병, 및 근육 긴장 태성 진전을 치료하기위한 승인을하는 동안, 상기 언급 된 기타 상태의 치료를위한 DBS의 사용은 환자 (13, 14)에 많은 가능성을 제공하는 랩의 다양한 단계 및 임상 연구이다. 임상 적으로, DBS 수술은 두 단계로 수행된다. 첫 번째 단계는 방사선 수술 위치의 조합을 이용하여 해부학 적 위치에 타겟 DBS 전극을 위치시키는 것을 포함한다, CT, MRI뿐만 아니라 향상된 정밀도를 미세 판독. 두 번째 단계는 환자의 가슴 윗부분에 펄스 발생기를 주입하는 것을 포함하고 연장 설치는 펄스 발생기에 두피로부터 리드. 신경 학적 조건에 기초하여, 펄스 발생기의 프로그래밍을위한 여러 방식이 규격화되어​​ 있고 원하는 전압을 제공하기 위해 사용될 것이다. 최종 권최소 전압 15 가장 임상 적 응답을 수신하도록 다케는 단계적으로 진행한다. 그러나, 우리의 연구에서 만성 DBS 임플란트 달리 간략화를 위해 임상 적으로 사용 된, 우리는 동물 모델에서 (1 시간 동안) 한번 고주파 자극을 연구에 의존했다. 우리의 연구 그룹의 일부는 치료 - 간질 DBS 수술의 사용을 연구에 초점을 맞추고있다. 고주파 자극을 사용하여 정위 수술 방법은 간질 10,16,17의 모든 발생률의 약 30 %를 구성하는 의학적 내화물 간질을 치료하는 효과적인 옵션으로 많은 다른 사람에 의해 탐구하고있다. 깊은 소뇌 핵뿐 아니라 피질 표면 타겟팅 소뇌 자극 10,18,19 간질을 치료 표적으로 이전에 사용되어왔다. 또한, 해마 자극도 시도했지만 혼합 된 결과 (20, 21)와 함께하고있다. 다른 일부 조사간질에 대한 DBS 목표는 대뇌 피질, 시상, 시상 핵과 미주 신경 (8)를 포함한다. 그러나 지난 몇 년 동안 여러 연구에서 다음과 같은 결과는, 전방 시상 핵 (ATN)은 간질 치료 10,22에 대한 가장 일반적인 DBS 대상으로 떠오르고있다. 신경 해부학 회로, 및 동물 모델로부터의 결과에 대한 지식에 기초하여, 여러 연구 23-26 간질 치료에 ATN의 깊은 뇌 자극 치료 효과에 초점을 맞추었다. ATN은 변연계 회로의 일부이며 발작 빈도에 영향을 미치는 뇌의 영역에 위치하고 있습니다. 로 Hamani 등. 연구, 필로 카르 핀에 의한 간질 모델에서 ATN-DBS의 효능을 시험하고 양국 간 ATN 자극이 필로 카핀에 의한 발작과 간질 중첩증 (24)에 대한 대기 시간을 연장 것을 발견했다. 또한, ATN의 고주파 자극의 EP pentylenetetrazol (PTZ) 모델에서 발작 빈도수를 감소였다25,27-29 ilepsy. Lee 등 알., 내화물 부분 간질 (30)의 치료에 ATN의 만성 깊은 뇌 자극에 따라 약 75 %의 발작 빈도의 평균 감소를보고했다. 치료 불응 성 간질에 대한 최근의 임상 연구는 전방 시상 핵 (ATN) 22 대상 DBS 수술 후 유망한 결과를 보여 주었다. 치료 불응 성 간질 (SANTE 시험)에 대한 ATN의 양자 DBS를받은 110 명의 환자와 다기관 무작위 임상 시험은 약 40 % (31)에 의해 발작 빈도의 저하를 지적했다. 본 연구의 결과는 또한 2~3개월 포스트 수술에서 관찰 지연 최적 항 간질 효과를 시사. 토다 등의 등으로 추가적인 연구., 그들은 동물 모델 1 나중에 포스트 DBS (일 3-5)에서 일어나는 신경을 보여 곳 이러한 연구 결과로 뒷받침. 또한, Encinas 등., 해마 neurogene 신고되었습니다ATN (32)의 고주파 자극 후 성인 마우스 치아 이랑의 동생. 이전의 연구 33-35은 만성 측두엽 간질과 학습 적자와 관련, 기억 손상과 자연 재발 모터 발작 같은 특정 간질의 경우 해마의 신경 발생을 감소 신고되었습니다. 또한, 이러한 동물 모델 (33) 만성 간질 해마 FGF2 및 IGF-1과 신경 줄기 세포 전구 세포 인자의 감소가 있었다. 이 고려, 치아 이랑 (dentate gyrus)에서 신경의 증가를 보여 같은 DBS 등의 중재 전략 연구를위한 흥미로운 길이다. 이러한 연구 결과는 간질의 메커니즘 기본 신경 포스트 DBS 치료에 더 깊이 탐구하는 우리를 격려했다. 우리는 (대표 결과에) (데이터가보고되지 않음)뿐만 아니라 양측 모두 일방적으로 ATN을 목표로하고 쥐의 치아 이랑에서 볼 수 증가 뉴로 트로 (BDNF) 표현했다. 우리의 Current 가설은 BDNF 발현 DBS 수술의 항 간질 효과로 해석 신경 절정 유전자 발현 캐스케이드를 개시하는 것이다. 이 논문에서는 DBS의 장점을 기본 메커니즘을 연구하는 매력적인 방법으로 유전자 발현 분석 한 다음 쥐의 ATN을 대상으로 DBS 수술에 대한 우리의 방법을 제시한다.

<table><tbody><tr><td>딥 브레인 스티뮬레이션 수술</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>스테레오택틱 프레임</td><td>Kopf Instruments</td><td>모델 900</td><td></td></tr><tr><td>드릴&nbsp;</td><td>Dremmel</td><td>7700, 7.2 V</td><td></td></tr><tr><td>메스</td><td>BD</td><td>372610</td><td></td></tr><tr><td>케타민</td><td>Patterson 수의학</td><td>07-803-6637</td><td>Schedule III 제도적 규칙에 따른 규제 물질, 조달, 사용 및 보관</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Patterson 수의학</td><td>07-808-1947</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td>Patterson 수의학</td><td>07-850-2280</td><td>Schedule III 기관 규칙에 따른 규제 물질, 조달, 사용 및 보관</td></tr><tr><td>수술용 스테이플</td><td>ConMed Corporation</td><td>8035</td><td></td></tr><tr><td>봉합사 (3-0)&nbsp;</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-3333</td><td></td></tr><tr><td>주사기 (1 ml, 29 1/2 G)</td> <td>BD</td><td>329464</td><td>멸균, 마취 투여에 사용 복강 내</td></tr><tr><td>주사기 (3 ml, 25 G)</td> <td>BD</td><td>309570</td><td>멸균, 진통 투여에 사용</td></tr><tr><td>피하 바늘</td><td>BD</td><td>305761</td><td>멸균, 버 구멍에서 부러진 뼈 조각을 제거하는 데 사용</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>피셔 과학적인</td><td>S25309B</td><td>일반 살균에 사용&nbsp;</td></tr><tr><td>눈 윤활제</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-898-350</td><td></td></tr><tr><td>자극기</td><td>Medtronic</td><td>모델 3628</td><td></td></tr><tr><td>DBS 전극</td><td>Rhodes Medical Instruments, CA</td><td>SNEX100x-100 mm</td><td>전극은 백금, 동심원 및 양극성</td></tr><tr><td>베타딘 (Povidone-Iodine)입니다.</td><td>PDI</td><td>S23125</td><td>일회용 스왑스틱, 절개 전에 두피 살균에 사용&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp; 뇌 해부 및 해마 조직 격리</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>아크릴 설치류 뇌 매트릭스</td><td>전자 현미경 과학</td><td>175-300</td><td>www.emsdiasum.com</td></tr><tr><td>면도날</td><td>V W R</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>단두대 가위</td><td>클로스</td><td>18039</td><td>참수를 위해 이 가위가 깨끗하고 작동하는 상태로 유지되는지 확인하십시오</td></tr>. 가<tr><td>위</td><td>코드맨 클래식</td><td>34-4098</td><td>두개골에서 뇌를 제거하는 데 사용</td></tr><tr><td>전자</td><td>현미경 과학</td><td>72957-06</td><td>두개골에서 뇌를 제거하고 해부 중 취급에 사용</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수&nbsp;</td><td>보스턴 바이오 제품</td><td>BM-220</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; RNA 추출 및 cDNA 준비</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tri 시약</td><td>Sigma</td><td>T9424</td><td>항상 연기 후드에서 사용하고 취급 중에는 보호 고글을 착용하십시오; 피부와의 접촉을 피하십시오</td></tr>. <tr><td>주사기 (3 ml, 25 G)</td><td>BD</td><td>309570</td><td>조직 균질화를 위한 사용</td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1145-1</td><td>항상 연기 후드에서 사용하고 취급 중에는 보호 고글을 착용하십시오; 접촉을 피하십시오. 피부</td></tr><tr><td>이소프로판올</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>A416-1</td><td></td></tr><tr><td>글리코겐</td><td>써모 사이언티픽</td><td>R0561</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I 키트</td><td>Ambion</td><td>AM1906</td><td></td></tr><tr><td>Superscript First Strand Synthesis Kit</td><td>Invitrogen</td><td>11904-018</td><td></td></tr><tr><td>테이블탑 마이크로센트리퓨지</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 정량적 PCR</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green PCR Kit</td><td>Qiagen</td><td>204143</td><td></td></tr><tr><td>Custom Oligos</td><td>Invitrogen</td><td>10668051</td><td></td></tr><tr><td>PCR 플레이트(96웰)</td><td>Denville Scientific</td><td>C18080-10</td><td></td></tr><tr><td>광학 접착 시트</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB1170</td><td></td></tr><tr><td>뉴클레아제 무함유 물</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30538-02</td><td></td></tr><tr><td>Real Time PCR 기계</td><td>응용 Biosystems</td><td>7500</td><td></td></tr></tbody></table>

전방 시상 핵의 깊은 뇌 자극 후 쥐 해마의 유전자 발현 변화 분석

Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus

깊은 뇌 자극 (DBS) 수술 등 기저핵, 시상 및 시상 영역으로 뇌의 다양한 지역을 대상으로, 약물 치료에 반응하지 못한 여러 가지 운동 장애에 대한 효과적인 치료입니다. DBS 수술 분야의 최근 발전은 비만, 우울증과 강박 장애 등 다양한 다른 조건이 수술 기법의 응용 프로그램을 확장하기 시작했다. 이러한 확대 표시에도 불구하고, 거의 DBS 수술의 유익한 효과를 촉진 기본 생리 학적 메커니즘에 대한 알려져있다. 이 질문에 대한 하나의 접근은 전기 자극을 수신 뉴런 유전자 발현 분석을 수행하는 것이다. 이전의 연구는 쥐의 치아 이랑에서 그 신경은 시상 (1)의 전방 핵의 대상 DBS에 유도되어 보여 주었다. ATN을 대상으로 DBS 수술은 치료 불응 성 간질을 위해 널리 사용됩니다. 따라서 그것은 많은 가출 중 하나입니다우리 t 전기적으로 ATN을 자극에 의​​해 유도되는 전사 변화를 탐구한다. 이 논문에서 우리는 성인 남성의 Wistar 쥐에서 ATN을 대상으로 정위 유도 DBS 수술에 대한 우리의 방법을 설명합니다. 우리는 또한 유전자 발현 변화를 측정하기위한 조직 박리, RNA 분리, cDNA를 준비하고 정량적 RT-PCR을위한 다음 단계에 대해 설명합니다. 이 방법은 적용 일반적으로 임상 적 대상 기저핵과 뇌의 다른 영역을 자극 수정할 수 있습니다. 여기에 설명 된 유전자 발현 연구는 DBS위한 메커니즘을 지시 할 수있는 분자 플레이어를 발견하기위한 후보 타겟 유전자 접근법을 가정한다.

도 1a 및도 1b는 제어 유전자 β 액틴에 BDNF와 GABRD의 상대적 표현을 나타낸다. BDNF는, 뉴로 트로는 종종 많은 신경 질환의 38 ~ 41의 신경 보호 효과와 관련이있다. 이것은 간질 환자에게 치료 적 이점을 수득 ATN의 자극에 응답하여 BDNF의 발현 프로파일을 분석하는 것이 흥미 롭다. 표시된 시간 - 점 걸쳐 BDNF의 유전자 발현 프로파일을 도시도 1a에 DBS 자극을 게시, BDNF는 상향 조절 (up-regulation)을 3 시간에 (비자극 배인 3) 피크 식 따라 DBS 수술 직후 (0 시간) 관찰 포스트 자극. 이러한 관찰을 향상 BDNF의 발현과 그 결과 신경이 DBS의 치료 효과에 기여할 수 있음을 시사한다. 또 다른 유전자 GABRD (도 1b)도 qPCR의 방법을 이용하여 조사 하였다. GABRD은 GABA 수용체이다 WHICH는 항 간질 약물 (42)을 설...

뇌심부자극술(DBS) 수술의 치료 효과의 기저에 있는 메커니즘에 대한 조사가 필요합니다. 본 원고에 제시된 방법은 DBS 수술 후 신경발생을 촉진할 수 있는 후보 유전자의 유전자 발현 프로파일을 분석하여 DBS에 의해 유발되는 세포 이벤트를 조사하는 실험적 접근 방식을 설명합니다.

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective ...

이 실험 절차의 전반적인 목적은 시상 전핵에 뇌심부 자극술을 시행하고 쥐의 해마에서 유전자 발현 변화를 연구하는 것입니다. 이를 위해 먼저 동물을 마취한 후, 수술을 위한 준비 과정을 거칩니다.두피를 절개하여 두개골을 노출시킵니다. 그 다음 bgma를 기준으로 정확한 위치에 천공을 합니다. DBS 전극을 삽입하고 자극을 실시합니다.마지막으로, 동물을 안락사시키고 뇌를 적출합니다. 해마를 제거한 후, RNA 추출 및 cDNA 준비를 위해 조직을 처리하고 qPCR을 수행합니다. 최종적으로, 결과는 심부 뇌 자극이 쥐 해마의 유전자 발현에 영향을 미친다는 것을 보여줍니다.이 방법은 뇌심부 자극술의 치료 효과의 기저에 있는 분자적 메커니즘은 무엇인가와 같은 뇌심부 자극 수술의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 함의는 뇌전증뿐만 아니라 파킨슨병, 알츠하이머병, 근긴장이상증과 같은 다른 신경계 질환의 치료로까지 확장됩니다. DPS는 많은 신경 질환을 치료하기 위한 수술적 접근법으로 부상하고 있기 때문에, 수술 준비를 위해 수술용 패드로 작업대를 덮고 생물학적 위험 폐기물 처리함이 구비되어 있는지 확인하십시오.쥐의 체중을 측정하고 텍스트 프로토콜에 따라 마취 용량을 계산합니다. 입체정위 수술 프레임의 전극 홀더에 두 개의 전극을 장착 및 고정하고, 현미경을 사용하여 전극 팁의 정렬 상태가 적절한지 확인합니다. 전극 팁이 단단한 표면에 닿지 않도록 주의하며 전극을 3 mm 간격으로 고정합니다. 케타민-자일라진을 주입합니다.동물에게 복강 내로 투여하고, 발가락 꼬집기 반사, 호흡수, 호흡의 깊이 및 규칙성을 확인하여 동물이 수술 가능 수준의 마취 상태에 도달했는지 확인합니다. 동물을 정위 고정 틀에 고정하고 위치를 잡습니다. 안구 건조를 방지하기 위해 동물의 눈에 안구 윤활제를 도포하고, Betadine과 알코올 또는 멸균 식염수를 교대로 사용하여 두피를 세 번 세척 소독합니다.동물을 순환식 온수 패드 위에 놓거나 가열 램프를 사용하여 동물의 체온을 최적의 수준으로 유지하십시오. Paxos 및 Watson 쥐 뇌 지도(rat brain atlas)를 기준으로, 전시상핵(anterior thalamic nucleus)을 표적하기 위해 다음과 같은 정위 좌표를 사용하십시오: 전후(anterior posterior) -1.6 mm, 내외(media lateral) 1.5 mm, 배측-복측(dorso ventral) 5.2 mm.다음으로, 두개골이 드러나도록 두피를 시상면으로 절개하십시오. 리트랙터 한 쌍을 사용하여 절개된 두피를 고정함으로써 두개골을 노출시킵니다. 그런 다음 에탄올을 적신 멸균 면봉으로 절개 부위를 닦아 봉합선이 명확히 보이도록 합니다. bgma 위치를 찾고, 검은색 마커를 사용하여 천공 위치를 안내하는 표시를 하십시오.시상봉합(sagittal suture) 양측으로 약 1.5 mm 외측, 관상봉합(coronal suture)에서 후방으로 1.6 mm 지점에 두 개의 표시를 더 합니다. 이제 두 개의 천공공(bur hole)을 만들기 위해, 에탄올을 사용하여 드릴 팁을 소독합니다.드릴을 45도 각도로 잡고, 각 천공 부위의 중심에 과도한 열이 발생하는 것을 방지하기 위해 두 구멍을 번갈아 가며 드릴링합니다. 경막이 드러날 때까지 드릴링을 계속합니다. 끝부분이 L자 모양으로 구부러진 바늘을 사용하여 전극 삽입을 방해할 수 있는 부러진 뼈 조각들을 제거합니다.골편을 제거하는 동안 하부의 경막 또는 뇌 조직이 손상되지 않도록 주의하십시오. 이중 전극 어셈블리를 정위 고정틀의 회전 핸들에 고정하고 핸들을 90도 각도로 고정합니다. 정위 고정틀의 조정 장치를 사용하여 왼쪽 전극을 bgma 바로 위에 정확히 위치시키십시오.배지 조절을 위한 정위 조절법을 사용합니다. 외측 위치 조정을 통해 왼쪽 전극을 bgma의 왼쪽으로 1.5 밀리미터 정밀하게 이동시켜, 이제 두 전극이 관상봉합을 따라 완벽하게 정렬되되 서로 떨어져 있게 합니다. bgma에서 외측으로 1.5 밀리미터 거리입니다.그 후 전후방 정위 조정을 통해 전극을 관상봉합(coronal suture)에서 후방으로 1.6 millimeters 이동시킵니다. 그런 다음 등쪽-배쪽 조정을 통해 전극을 내려, 전극이 천공(bur hole)의 거친 가장자리에 닿지 않고 쉽게 삽입될 수 있도록 천공이 정확한 위치에 만들어졌는지 먼저 확인합니다. 확인이 되면 전극을 두개골 표면으로부터 5.2 millimeters 깊이까지 삽입합니다.전극을 리드선을 통해 130 hertz, 2.5 volts, 90 microsecond 펄스 폭으로 설정된 자극기에 연결합니다. 원하는 시간 동안 고주파 자극을 가합니다. 단측 또는 양측 자극을 수행합니다.자극이 완료되면 전극을 조심스럽게 제거하고, 3-0 봉합사 또는 멸균 외과용 스테이플러를 사용하여 절개 부위를 봉합합니다. 부프레노르핀을 피하 투여하고 동물이 정상적인 활동을 회복할 때까지 관찰한 후 사육 시설로 복귀시킵니다. 면도날을 사용하여 뇌를 얼음 위에 놓인 사전 냉각된 아크릴 뇌 매트릭스에 올립니다. 뇌의 가장 앞쪽 끝단에서 약 7~8mm 떨어진 지점에서 뇌를 관상면으로 절단합니다.첫 번째 절개선과 평행하게 후방으로 두 번째 절개를 가하여 약 5mm 두께의 뇌 슬라이스를 제거합니다. 면도날을 사용하여 뇌 슬라이스를 얼음처럼 차가운 PBS가 담긴 페트리 접시에 옮기고, 두 개의 반구 섹션을 분리한 후 각각 어느 쪽이 좌측과 우측에 해당하는지 주의 깊게 기록합니다. 미세 핀셋과 가위를 사용하여 해마를 조심스럽게 제거하고, 조직을 드라이아이스로 급속 냉동시킨 후, 여기에 제시된 텍스트 프로토콜에 따라 이후의 RNA 단계를 수행할 때까지 -20°C에서 보관합니다. 이는 표시된 시점별로 대조군 유전자인 beta actin과 비교한 BDNF의 상대적 발현 수준을 나타냅니다.DBS 자극 후 결과입니다. BDNF 상향 조절은 DBS 수술 직후에 관찰되며, 자극 후 3시간째에 최대 발현량을 보입니다. 이러한 관찰 결과는 BDNF 발현의 증가와 그로 인한 신경 보호 효과가 뇌전증 환자에 대한 DBS의 치료적 이점에 기여할 수 있음을 시사합니다.이 패널은 GABA 수용체인 G-A-B-R-D의 발현을 보여주며, DBS 시술 3시간 후 자극을 받은 동물에서 자극을 받지 않은 대조군에 비해 발현이 증가했음을 나타냅니다. GABA 작용제가 효과적인 발작 억제제로 사용된다는 점을 고려할 때, DBS 이후 G-A-B-R-D의 발현 증가가 관찰된 것은 GABA의 잠재적 역할과 DBS의 항경련 효과와의 연관성을 시사한다는 점에서 흥미롭습니다. 이 절차에 따라.웨스턴 블롯, 염색질 면역침전법 및 기타 여러 표준 분자 생물학적 분석법과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이를 통해 단백질 발현의 변화, 번역 후 수정, 특정 유전자 프로모터 영역의 전사 인자 점유율 등에 관한 질문에 답하는 데 도움이 됩니다. 이 영상을 시청한 후에는 쥐를 대상으로 뇌 심부 자극술 수술을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.해마 조직을 분리하고 유전자 발현 변화를 분석합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

출처: Casquero-Veiga, M. et al. 쥐의 심부 뇌 자극에 의해 유도된 활동 패턴을 밝히기 위한 생체 내 양전자 방출 단층 촬영. J. Vis. 경험. (2022).이 비디오는 쥐 모델에서 FDG-PET 이미징을 사용하여 심부 뇌 자극(DBS)의 대사 효과를 보여줍니다. 대사 활동이 증가하거나 억제된 뇌 영역을 매핑하기 위해 FDG 투여, DBS 적용 및 PET/CT 이미징과 관련된 단계를 간략하게 설명합니다.

In Vivo FDG-PET를 사용하여 쥐의 급성 심부 뇌 자극에 의해 유도된 대사 신경조절 평가

출처: Selvakumar, T., et al., 전시상핵의 심부 뇌 자극 후 쥐 해마의 유전자 발현 변화 분석. J. vis. 경험. (2015년)이 비디오는 쥐의 뇌에 전극을 이식하여 신경 활동을 조절하고 해마와의 의사소통을 강화하여 신경 생존 및 신경 발생을 지원하는 심부 뇌 자극(DBS)을 적용하는 절차를 보여줍니다.

쥐 모델에서 해마 신경 활동에 대한 심부 뇌 자극의 효과

이 비디오는 세로토닌 증후군의 영향을 받는 쥐의 뇌 조직에서 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 세로토닌 수용체 RNA 합성을 감지하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜에는 조직 전처리, 프로브 혼성화 및 효소 검출이 포함되어 현미경으로 세로토닌 수용체 RNA 발현을 시각화하고 정량화합니다.

쥐 뇌 절편에서 RNA 발현을 연구하기 위해 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용한 현장 혼성화

우리는 정량 실시간 PCR 및 / 또는 전체를 게놈 microarrays를 사용하여 후속 유전자 발현 분석을위한 부상을 쥐의 뇌의 냉동 섹션에서 hippocampal 뉴런 또는 단일 뉴런의 풍부한 인구를 얻기 위해 레이저 캡처 microdissection (LCM)를 사용하는 방법에 대해 설명합니다.

외상성 뇌 손상 후 뉴런 또는 유전자 발현 분석을위한 단일 뉴런의 강화 인구의 레이저 캡처 Microdissection

이 프로토콜은 설치류에서 동시에 기능성 자기 공명 영상과 깊은 두뇌 자극을위한 표준 방법을 설명합니다. 이러한 실험 도구를 함께 사용은 거의 모든 뇌 대상에 전기 자극에 대한 응답으로 글로벌 다운 스트림 활동의 탐사 할 수 있습니다.

설치류에 동시 fMRI를 깊은 뇌 자극

쥐의 시상하핵(STN)에 전극을 이식하는 방법을 설명합니다. STN의 더 나은 위치 파악은 마이크로 기록 시스템을 사용하여 달성되었습니다. 또한, 동물의 머리와 자극기 사이의 오래 지속되는 연결을 특징으로 하는 자극 설정이 제공됩니다.

미세 전극은 장기 깊은 뇌 자극 쥐의 Subthalamic 핵에 전극의 주입을 가이드

뇌심부 자극술(DBS)은 파킨슨병에 효과적인 치료 옵션입니다. 우리는 쥐에서 새로운 자극 패러다임을 스크리닝하기 위한 연구 설계를 수립했습니다. 이 프로토콜은 DBS 처리된 헤미파킨슨병 쥐의 운동 결과 평가를 위해 계단 테스트 및 실린더 테스트를 사용하는 방법을 설명합니다.

계단 및 실린더 테스트 : 소설 접근은 Hemiparkinsonian 쥐에 깊은 뇌 자극 효과의 모터 결과를 평가하는

우리는 쥐의 뇌의 편측성 반구에 반복적인 경두개 자기 자극(rTMS)을 적용하여, 양귁 선의 꼭짓점에서 1cm 측면으로 25mm 8자형 코일을 배치하고 코일을 45° 각도화하여 적용했습니다. rTMS를 위해 사내 수냉식 시스템이 20분 이상 사용되었습니다.

쥐 뇌의 일방적 인 북반구에 반복 경 두개 자기 자극

이 프로토콜에는 생쥐에서 신뢰할 수 있는 HFS 메서드를 설정 하는 방법을 보여 줍니다. Hippocampal가 뇌 전체 신경 전기 HFS 직접 및 간접적으로 비보에 의해 자극 된다. 신경 활동 및 분자 신호 검사 c-fos 와 Notch1 immunofluorescent 얼룩, 각각; 성체는 bromodeoxyuridine 분석 결과 라벨에 의해 정량 이다.

고주파 자극에 의해 마우스가 뇌의 활성화에 대 한 침략 적 방법

Transcranial 직류 자극 (tDCS) 정신 질환 치료를 제안 하는 치료 기술 이다. 동물 모델 tDCS에 의해 갖는 특정 생물 학적 변경 이해 하기 위한 필수적입니다. 이 프로토콜 사용 하 여 만성 이식된 전극 tDCS 마우스 모델을 설명 합니다.

Transcranial 직류 자극 (tDCS) 마우스

우리는 생체 내 FDG-PET를 이용한 급성 심부 뇌 자극에 의해 유도 된 대사 신경 조절을 평가하는 전임상 실험 방법을 설명합니다. 이 원고에는 정위 수술에서 자극 치료의 적용, PET 이미지의 획득, 처리 및 분석에 이르기까지 모든 실험 단계가 포함되어 있습니다.

생체 내 쥐의 심부 뇌 자극에 의해 유도 된 활동 패턴을 밝히기위한 양전자 방출 단층 촬영

배우세요 전방 시상 핵의 깊은 뇌 자극 후 쥐 해마에서 BDNF와 GABRD 유전자 발현 변화를 분석하는 방법을. 이 기술은 뇌전증 및 기타 신경 질환의 치료 메커니즘을 이해하는 데 도움이 됩니다.

전방 시상 핵의 깊은 뇌 자극 후 쥐 해마의 유전자 발현 변화 분석

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