Name: Myh6 발기인 - 선택과 함께 ES-세포 프로그래밍을 바탕으로 설치류 심장 페이스 메이커 세포 집합체의 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: 배우세요 항생제 선택을 이용한 ES세포 기반 심장 페이스메이커 세포 분화법을 통해 설치류에서 고순도의 정동결세포를 생성하는 방법을. 이 기술은 심장 조직 공학 및 약물 테스트 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. 권장 사항 시작하기 전에 <ol><li> 그들은 동방 결절 세포로 제대로 구분하지 않기 때문에 마이코 플라즈마 오염 PSC를 사용하지 마십시오. 프로토콜을 시작하기 전에 마이코 플라스마 오염에 대한 테스트합니다. 마이코 플라즈마 신속, 고감도 검출을위한 PCR 키트를 사용하여이 작업을 수행하고 제조자의 프로토콜을 따르십시오. </li><li> 각 페트리 접시 (단계 2.3.4), 코트 한 10cm 37 ° C에서 1 시간 동안 차가운 물에 물고기 피부에서 멸균 7 ml의 0.1 % 젤라틴 2 세포 배양 접시하십시오. 멸균 벤치에서 무균 조건에서 요리 건조 젤라틴을 제거 할 수 있습니다. </li><li> 포유 동물 발현 벡터를 사용하여 TBX3의 난) 구성 적 과발현 : 당신이 분화 프로토콜을 시작하기 전에 다음과 같은 기능을 포함하는 이중 형질 전환 안정된 마우스 ES 세포주 클론이 필요합니다. ⅱ) Myh6 촉진제 (5)의 제어하에 G418 내성 유전자. </li><li> PSC를 미분화 세포 공동 배양되어야설명 1 표준 조건에서 조사 피더 세포와 D. </li></ol> 2. 차별화 절차 <ol><li> 두 일 분화하기 전에 - 피더 세포에서 PSC를 제거합니다. <ol><li> 10 ml의 포스페이트 완충 식염수 PBS로 세포를 세척 매체 기음 7 ㎖의 콜라게나 제 IV의 용액을 첨가하고, 37 ° C에서 10 분 동안 세포를 배양한다. 50 ML 튜브에 멸균 40 μm의 필터를 놓습니다. </li><li> 조심스럽게 PSC 식민지를 씻어 위아래로 5 번 콜라겐 솔루션을 피펫 팅 (피더 세포를 제거하는 방지). </li><li> , 40 μm의 필터에 세포 현탁액을 전송 8 ml의 PBS로 세 번 필터를 헹군다. 필터 주변에 돌고 거꾸로 페트리 접시에 놓습니다. 필터의 바닥에 10 ml의 PBS를 피펫 팅하여 PSC 세포 식민지를 제거합니다. </li><li> 300 x g에서 5 분 동안 15 ml의 원심 분리 튜브에 세포 현탁액을 전송. </li><li> 1 ml의 Accutase 그리고 난에 세포를 일시 중지, PBS를 제거5 분 37 ° C에서 ncubate. </li><li> 10 ml의 PBS를 추가 X g 300에서 5 분 동안 아래로 5 회 원심 분리기를 그것을 피펫 팅에 의해 셀 솔루션을 섞는다. </li><li> 상기 PBS를 제거 10 ㎖ 배양 배지에서 세포를 중단하고 세포 수를 결정한다. </li><li> 종자 15,000 세포 / 75cm 2 필터 플라스크에 2 cm, 37 ° C, 5 % CO2에서 2 일간 배양 그들을. 이일 후 플라스크에 50-70 %의 합류해야합니다. </li></ol></li><li> 0 일 - 차별화의 시작 <ol><li> 매체를 제거하고 10 ml의 PBS로 세포를 씻어. </li><li> , PBS 대기음 2ml의 Accutase을 추가 5 분 동안 37 ℃에서 세포를 배양한다. 50 ML 튜브에 멸균 40 μm의 필터를 놓습니다. </li><li> , 40 μm의 필터에 세포 현탁액을 전송하고, 10 ㎖의 PBS를 추가 10 ㎖의 PBS를 첨가하고 원심 분리기를 통해 필터 린스 관류 300 x g에서 5 분간. </li><li> 10 ㎖ 분화 배지에서 세포를 일시 중단하고 세포 수를 결정한다. </li><li> t을 희석그는 20,000 세포 / ml의 최종 농도로 분화 배지 현탁액 전지. </li><li> 피펫 20 ml의 물과 HDS는 건조 아웃을 피하기 위해 차 배양 접시에서 드롭 (HD) 솔루션을 걸려 5 ml의. 참고 : 각 24 웰 플레이트 포함 iSABs 16 페트리 접시로 시작 (섹션 2.8.6.4/2.8.7 참조​​). </li><li> 트레이에 50 ml의 세포 현탁액까지 피펫. </li><li> 페트리 접시의 뚜껑 주위를 돌립니다. 12 채널 피펫을 사용하여 뚜껑에 180 HDS는 각각의 포함 20 μL (400 셀 / HD) 세포 현탁액을 놓습니다. </li><li> 조심스럽게 뚜껑 돌아서과 페트리 접시에 놓습니다. 주 : 덮개의 주위를 선회 속도가 매우 중요하다. 뚜껑이 너무 느리거나 너무 빠른 바꾸게되면, 세포 현탁액의 표면 장력이 걸려 뚜껑에 삭제 유지할만큼 충분히 높지 않다. 매체의 20 μl의 방울과 뚜껑 주위를 선회 처음 연습 HDS는 생산하기 전에. </li><li> (3)에 2 일 동안 세포 배양7 ° C, 5 % CO 2는 그들이 사채를 형성 할 수있다. 참고 : 5 페트리 접시의 스택의 상단에 물이 가득 배치 한 페트리 접시. 그렇지 않으면 상위 페트리 접시에 HD 건조합니다. </li></ol></li><li> 2 일 <ol><li> 조심스럽게 차 페트리 접시의 뚜껑 주위를 켜고 50 ㎖ 튜브에 두 개의 배양 접시 (360 사채)에서 파생 된 사채를 전송합니다. </li><li> 사채는 튜브의 아래쪽에 정착하자 10 분을 기다립니다 (EB를 원심 분리하지 마십시오). </li><li> 대기음 극력 매체로서, 10 ㎖ 분화 배지에서 EB를 중단하고 10cm 페트리 접시에 현탁액을 전송. </li></ol></li><li> 하루 2-6 서스펜션 문화 <ol><li> 37 ° C에서 4 일 동안 정학의 사채를 양성, 5 % CO 2는 2 일 후 매체를 변경합니다. 주 : EBS는 종종 표면에 부착 (세포 배양 접시는 대조적으로) 배양 접시에 도포되지 않더라도. EB를 부착 사채 매일 매일 필요한 경우 분리 배양 접시를 제어부드러운 피펫 팅에 의해 표면에서. 옵션 : 현탁 배양 기간 동안 지속적으로 배양 접시를 흔들어. 셰이커의 속도에주의하십시오. 사채는 어느 쪽도 중간에 축적되지도 배양 접시의 테두리에 떠 있어야합니다. </li></ol></li><li> 6 일 <ol><li> 한 젤라틴 코팅 10cm 2 세포 배양 접시에 하나의 배양 접시에서 사채를 전송합니다. </li></ol></li><li> 하루 7-12 <ol><li> 세포 8-12 일 후에 이길 시작해야합니다. 매일 현미경으로 세포의 초점을 치고 있는지 확인합니다. 세포는 층을 형성하기 시작한다. </li><li> 매체 매일을 변경합니다. 주 : 매체를 변경 한 후, 세포를 복구하고 다시 박동 3-4 시간을 필요로한다. </li></ol></li><li> 동 노드 세포의 날 12 ~ 15 선택. <ol><li> 세포 (12 ~ 15 일 정도) 꺾고 사흘 시작한 후, 세포에 400 ㎍ / ㎖의 G418을 함유하는 신선한 배지 분화 배지 10 ml의 피펫 대기음. </li></ol></li><l난&gt; 나흘 선택의 시작 후 전지 층을 해리. 주 : 세포층 이미 표면으로부터 분리되는 것이 가능하다. <ol><li> 셀 층을 흡입하지 않고 신중하게 매체를 제거합니다. </li><li> PBS의 10 ML을 추가하고 세포 층을 흡입하지 않고 조심스럽게 PBS를 제거합니다. </li><li> 50 ㎖ 튜브에 세포를 전송하고, 5 분 동안 37 ° C에서 배양 한 세포를 콜라게나 제 IV 용액 10 ㎖를 추가한다. </li><li> 격렬하게 피펫 팅하여 10 배의 아래 현탁액을 혼합하고, 5 분 동안 37 ℃에서 세포를 배양한다. 작은 클러스터의 정지가 발생한다. 여전히 남아 층의 큰 부분이 있으면, 단계 2.8.4을 두 번 더 반복한다. </li><li> 300 x g에서 10 분 동안 20 ㎖의 PBS와 원심 분리기를 추가합니다. </li><li> PBS를주의 깊게 기음. 참고 : iSABs 단계 2.8.7을 계속 생성 될 경우. ISAB 파생 동 마디 하나의 세포가 생성 될 경우 단계 2.9에 이동합니다. </li><li> 세포를 일시12 ㎖에 분화 배지는 400 ㎍ / ㎖의 G418을 함유하는 코팅 된 젤라틴과 6 웰 24 웰 (/ 웰 2 ㎖)에 그들을 시드. </li></ol></li><li> 단일 노드 세포의 생성. <ol><li> 5 ㎖ Accutase 단계 2.8.6에서 세포를 일시 중단하고, 5 분 동안 37 ℃에서 배양한다. </li><li> 격렬하게 피펫 팅하여 10 배의 아래 현탁액을 혼합하고, 5 분 동안 37 ℃에서 세포를 배양한다. </li><li> 300 x g에서 5 분 동안 20 ㎖의 PBS와 원심 분리기를 추가합니다. </li><li> 400 ㎍ / ㎖의 G418을 함유하는 12 ml의 분화 배지에서 세포를 일시 중단하고 24 웰 (2 ㎖ / 웰) 코팅 젤라틴 6 웰 그들을 시드. </li></ol></li><li> 분리 후 제 2 일, 매체를 대기음하고 PBS로 세포를 세 번 씻는다. 잘 / 1 ml의 차별화 매체를 추가합니다. </li><li> 하루 4-8 분리 후, 매 2 차 일 중간을 변경합니다. 해리 사용 iSABs 또는 ISAB 파생 동 후 10 일에 마디 하나의 세포는 추가 분석을 위해 사용할 수 있습니다. </li></ol>

<ol><li>Wobus, A. M., Wallukat, G., Hescheler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+mouse+embryonic+stem+cells+are+able+to+differentiate+into+cardiomyocytes+expressing+chronotropic+responses+to+adrenergic+and+cholinergic+agents+and+Ca2%2B+channel+blockers%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Pluripotent mouse embryonic stem cells are able to differentiate into cardiomyocytes expressing chronotropic responses to adrenergic and cholinergic agents and Ca2+ channel blockers.</a> Differentiation. 48 (3), 173-182 (1991).</li>
<li>David, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MesP1+drives+vertebrate+cardiovascular+differentiation+through+Dkk-1-mediated+blockade+of+Wnt-signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">MesP1 drives vertebrate cardiovascular differentiation through Dkk-1-mediated blockade of Wnt-signalling.</a> Nat Cell Biol. 10, 338-345 (2008).</li>
<li>David, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+programming+of+pluripotent+stem+cells+towards+distinct+cardiovascular+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Forward programming of pluripotent stem cells towards distinct cardiovascular cell types.</a> Cardiovasc Res. 84 (2), 263-272 (2009).</li>
<li>Hoogaars, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tbx3+controls+the+sinoatrial+node+gene+program+and+imposes+pacemaker+function+on+the+atria%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Tbx3 controls the sinoatrial node gene program and imposes pacemaker function on the atria.</a> Genes Dev. 21 (9), 1098-1112 (2007).</li>
<li>Klug, M. G., Soonpaa, M. H., Koh, G. Y., Field, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+selected+cardiomyocytes+from+differentiating+embronic+stem+cells+form+stable+intracardiac+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Genetically selected cardiomyocytes from differentiating embronic stem cells form stable intracardiac grafts.</a> J Clin Invest. 98 (1), 216-224 (1996).</li>
<li>Marger, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pacemaker+activity+and+ionic+currents+in+mouse+atrioventricular+node+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Channels+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">Pacemaker activity and ionic currents in mouse atrioventricular node cells.</a> Channels (Austin). 5 (3), 241-250 (2011).</li>
<li>Jung, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programming+and+isolation+of+highly+pure+physiologically+and+pharmacologically+functional+sinus-nodal+bodies+from+pluripotent+stem+cells%29%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cell+reports%22%5BJournal%5D)">Programming and isolation of highly pure physiologically and pharmacologically functional sinus-nodal bodies from pluripotent stem cells).</a> Stem cell reports. 2 (5), 592-605 (2014).</li>
<li>Maltsev, V. A., Wobus, A. M., Rohwedel, J., Bader, M., Hescheler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocytes+differentiated+in+vitro+from+embryonic+stem+cells+developmentally+express+cardiac-specific+genes+and+ionic+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocytes differentiated in vitro from embryonic stem cells developmentally express cardiac-specific genes and ionic currents.</a> Circulation research. 75 (2), 233-244 (1994).</li>
<li>He, J. Q., Ma, Y., Lee, Y., Thomson, J. A., Kamp, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cells+develop+into+multiple+types+of+cardiac+myocytes%3A+action+potential+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cells develop into multiple types of cardiac myocytes: action potential characterization.</a> Circ Res. 93 (1), 32-39 (2003).</li>
<li>Yanagi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperpolarization-activated+cyclic+nucleotide-gated+channels+and+T-type+calcium+channels+confer+automaticity+of+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells%22%5BJournal%5D)">Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels and T-type calcium channels confer automaticity of embryonic stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Stem cells. 25 (11), 2712-2719 (2007).</li>
<li>Barbuti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+composition+and+functional+properties+of+f-channels+in+murine+embryonic+stem+cell-derived+pacemaker+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Molecular composition and functional properties of f-channels in murine embryonic stem cell-derived pacemaker cells.</a> J Mol Cell Cardiol. 46 (3), 343-351 (2009).</li>
<li>Ma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+purity+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%3A+electrophysiological+properties+of+action+potentials+and+ionic+currents%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents.</a> American journal of physiology. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 301 (5), H2006-H2017 (2011).</li>
<li>David, R., Franz, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+pluripotency+to+distinct+cardiomyocyte+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">From pluripotency to distinct cardiomyocyte subtypes.</a> Physiology (Bethesda). 27 (3), 119-129 (2012).</li>
<li>Scavone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell-derived+CD166%2B+precursors+develop+into+fully+functional+sinoatrial-like+cells%29%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell-derived CD166+ precursors develop into fully functional sinoatrial-like cells).</a> Circ Res. 113 (4), 389-398 (2013).</li>
<li>Morikawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification%2C+isolation+and+characterization+of+HCN4-positive+pacemaking+cells+derived+from+murine+embryonic+stem+cells+during+cardiac+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Pacing+Clin+Electrophysiol%22%5BJournal%5D)">Identification, isolation and characterization of HCN4-positive pacemaking cells derived from murine embryonic stem cells during cardiac differentiation.</a> Pacing Clin Electrophysiol. 33 (33), 290-303 (2010).</li>
<li>Wiese, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+the+sinus+node+head+and+differentiation+of+sinus+node+myocardium+are+independently+regulated+by+Tbx18+and+Tbx3%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Formation of the sinus node head and differentiation of sinus node myocardium are independently regulated by Tbx18 and Tbx3.</a> Circ Res. 104 (3), 388-397 (2009).</li>
<li>Kleger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+calcium-activated+potassium+channels+induces+cardiogenesis+of+pluripotent+stem+cells+and+enrichment+of+pacemaker-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Modulation of calcium-activated potassium channels induces cardiogenesis of pluripotent stem cells and enrichment of pacemaker-like cells.</a> Circulation. 122 (18), 1823-1836 (2010).</li>
<li>Bakker, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-box+transcription+factor+TBX3+reprogrammes+mature+cardiac+myocytes+into+pacemaker-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">T-box transcription factor TBX3 reprogrammes mature cardiac myocytes into pacemaker-like cells.</a> Cardiovasc Res. 94 (3), 439-449 (2012).</li>
<li>Kapoor, N., Liang, W., Marban, E., Cho, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+quiescent+cardiomyocytes+to+pacemaker+cells+by+expression+of+Tbx18%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of quiescent cardiomyocytes to pacemaker cells by expression of Tbx18.</a> Nat Biotechnol. 31 (1), 54-62 (2013).</li>
<li>Johns, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+expression+of+a+voltage-gated+potassium+channel+in+vitro+%28rat+cardiac+myocytes%29+and+in+vivo+%28rat+liver%29.+A+novel+strategy+for+modifying+excitability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated expression of a voltage-gated potassium channel in vitro (rat cardiac myocytes) and in vivo (rat liver). A novel strategy for modifying excitability.</a> J Clin Invest. 96 (2), 1152-1158 (1995).</li>
<li>Nuss, H. B., Marban, E., Johns, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+a+human+potassium+channel+suppresses+cardiac+hyperexcitability+in+rabbit+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Overexpression of a human potassium channel suppresses cardiac hyperexcitability in rabbit ventricular myocytes.</a> J Clin Invest. 103 (6), 889-896 (1999).</li>
</ol>

저자가 공개하는 게 없다.

능력 &quot;생물학적 박동기&quot;의 의미로 적절한 심박동의 재구성을 허용 할 수있다 세포 유래 심장 페이스 메이커의 줄기 세포를 생성한다. 마찬가지로, 시험관 내에서 약물 검사는 가용성 도움이됩니다. PSC를 페이스 메이커의 셀 속성 8,9,10,11,12,13와 심근을 포함한 포유 동물의 신체의 세포 유형을 야기 할 수 있습니다. 그러나, 전형적으로 &quot;배양체&quot;내의 세포 집단은 필연적으로 안정적인 선택 및 분리 전략을 요구 이르게 매우 이질적이다 - 이것은 심장 세포의 노달 매우 드문 세포 유형에 특히 적용된다. 외인성 및 내인성 표면에 따라 다양한 접근 방법이 작은 분자 15,16,17의 약물 투여와 18, 19가 되어져있는 직접 리 프로그래밍 전략, 14 마커. 또한, 비 - 줄기 세포 - 기반 접근법은 생물학적 박동기 에뮬레이션 겨냥완전한 기능 마디 세포 (20, 21)를 대신 드 노보의 sarco...

용어 &quot;아픈 부비동 증후군은&quot;심장 맥박 조정기 시스템의 악화로 이어지는 여러 질병을 요약 한 것입니다. 그것은 병적 인 증상이 동 서맥, 동방 블록, 부비동 체포뿐만 아니라 빈맥 - 서맥 증후군을 포함한다. 이로써, &quot;아픈 부비동 증후군&quot;은 종종 심근 허혈, 심근 병증 심근염 또는 일반적으로 심장 질환을 수반한다. 현재 치료 방법은 전기 맥박 조정기의 주입을 기반으로합니다. 그러나,이 같은 감염과 배터리 고장 등의 위험 번호와 함께 간다. 전반적으로, 합병증의 발생률은 여전히​​ 환자가 인공 심장 박동기를 이식하는 데에 매우 높습니다. 내인성 박동기 반대로 더욱이, 이러한 장치는 호르몬 자극에 반응하지 않는다. 미래의 대안이되는 PSC를가 봉사 할 수 있었다 &quot;생물학적 페이스 메이커&quot;의 가용성에 의존 할 수있다적합한 셀룰러 소스와 어떤으로 또한 체외 약물 검사에 매우 유용 할 것입니다. 그러나, 큰 문제가 배아 체 (사채) 내에서 동 노드 세포의 매우 드문 모양에있다 - 이것은 일반적으로 ~ 0.5 % 1을 초과하지 않는다. 이전에는 특정 심근 서브 타입을 향해 &quot;앞으로 프로그래밍&quot;등 관련 중배엽 - 별 후방 1 (MesP1) 및 NK2 전사 인자 궤적 5 (Nkx2.5) 2와 별개의 조기 심장 혈관 전사 인자의 과발현을 통해 가능하다 것으로 나타났다, 3. 보통 크기와 동방 노드 (SAN)의 기능을 위해, T-박스 전사 인자 TBX3는 페이스 메이커 유전자 프로그램을 개시하고 SAN (4)의 분화를 제어하기 위해 도시 된, 결정적이다. 이는 기능상 박동기 세포의 모양을 개선하면서, 콘텐츠는 여전히 전체 cardiomyocytic 세포 집단 내에서 ~ 40 %를 초과하지 않았다. 따라서, 추가 Myh6 발기인 기반 항생제 선택 5 단계를 우리가 도입되었다. 체외 배양에 쥐 심장의 사람들과 비교를 근사 처음으로 체외에서 높은 증가 박동 주파수 (&gt; 400 BPM)를 전시; 이것은 궁극적으로 아직 관찰되지 심근 집계 (iSABs &quot;&quot;유도 된 중국 - 심방 기관 &quot;)에 리드 쥐의 심장 (6)에서 분리 된 동 결절 세포. 이소 프레 날린 관리에서 550 BPM 심지어 구타 주파수를 얻을 수있다. 특히, iSABs 7을 분석하여 광범위한 생리에서 명백한 바와 같이 80 % 이상 기능 림프절 세포로 구성되어 있습니다. 최근, 다양한 접근이 직접 리 프로그래밍 (19)을 이용하여 상악동에게 결절 세포를 생성하기 위해, 표면 (16, 17)에 대하여 설명 하였다 소분자 약물 치료 14 또는 마커. 그러나, 이러한 방법 중 어느 것도 페이스 메이커 세포의 이러한 높은 순도 주도하지 않고 쥐에 가까운 주파수를 치고 그예술 iSABs에서 관찰. 또한, 자신의 자율 박동 활동을 잃었다 재배 성인 마우스 심실 조각의 생체 모델, iSABs는 슬라이스 조직으로 통합하여 자발적으로 활성 남아있는 견고하게 수축 7 심장 조각을 페이싱 할 수있다. 이 iSABs의 생성에 대한 자세한 프로토콜은이 문서에 설명되어 있습니다.

<table><tbody><tr><td>안정적인 글루타민을 함유한 Iscove의 액상 매체</td><td>Biochrom AG</td><td>FG 0465</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Na-피루브산이 없는 액체 매체, 안정적인 글루타민</td><td>Biochrom AG</td><td>FG 0435</td><td></td></tr><tr><td>CLS type IV, CLS IV</td><td>Biochrom AG</td><td>C4-22</td><td></td></tr><tr><td>비필수 아미노산</td><td>Biochrom AG</td><td>K 0293</td><td></td></tr><tr><td>FBS Superior</td><td>Biochrom AG</td><td>S 0615</td><td></td></tr><tr><td>피루브산 나트륨 (100 mM)</td><td>Biochrom AG</td><td>L 0473</td><td></td></tr><tr><td>G 418-BC 액체 (즉시 사용 가능한 용액), 멸균</td><td>Biochrom AG</td><td>A 2912</td><td></td></tr><tr><td>시약 저장 용액 PP f.multichannel pip. 60ml, 멸균</td><td>브랜드</td><td>703409</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>eBioscience, Inc.</td><td>00-4555-56</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Xplorer/Xplorer plus, 전동 피펫</td><td>Eppendorf</td><td>4861000155</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Cell Strainer 40 &micro; m</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>P11-010</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>Greiner BioOne</td><td>663102</td><td></td></tr><tr><td>Ca 및 Mg가 없는 DPBS</td><td>PAN-Biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>PAN-Biotech</td><td>P30-3302</td><td></td></tr><tr><td>백혈병 억제 인자</td><td>Phoenix Europe GmbH</td><td>LIF-250</td><td></td></tr><tr><td>2차 페트리 접시</td><td>Roth</td><td>PX67.1</td><td></td></tr><tr><td>냉수 물고기 피부에서 추출한 젤라틴</td><td>SigmaAldrich</td><td>G7765</td><td></td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올</td><td>SigmaAldrich</td><td>M3148&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>1-Thioglycerol</td><td>SigmaAldrich</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 접시</td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 플라스크</td><td>TPP</td><td>90076</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 테스트 플레이트(24웰)</td><td>TPP</td><td>92424</td><td></td></tr></tbody></table>

myh6 발기인 - 선택과 함께 es-세포 프로그래밍을 바탕으로 설치류 심장 페이스 메이커 세포 집합체의 생성

Generation of Murine Cardiac Pacemaker Cell Aggregates Based on ES-Cell-Programming in Combination with Myh6-Promoter-Selection

&quot;아픈 부비동 증후군 &#39;의 치료는 인공 심장 박동기를 기반으로합니다. 여기에는 배터리 오류 및 감염 등의 위험을 부담. 또한, 그들은 호르몬 응답이 부족하고 전반적인 절차는 비용 집약적이다. PSC를에서 생성 된 &quot;생물 페이스 메이커&quot;는 대안이 될 수있다, 아직 배아의 몸에서 심장 박동 조절 세포의 일반적인 내용 (사채)는 매우 낮다. 설명 프로토콜은 Myh6 발기인 기반 항생제 선택과 부비동 노드 유도의 TBX3을 통해 쥐의 PSC를의 &quot;앞으로 프로그래밍&quot;을 결합합니다. 이&gt; 80 % 생리 학적 기능성 페이스 메이커 세포의 일관된 심근 집계를 산출한다. 이러한 &quot;유도 동방-몸은&quot;( &quot;iSABs&quot;) 자발적으로 마우스 마음에서 고립 마디 세포에 해당 아직 미전도 주파수 (400 ~ 500 BPM)에서 계약과 쥐의 심근 생체 조절이 할 수 있습니다. 설명 프로토콜 고순도의 동을 사용하여절점 단셀 약물은 시험 관내 시험을 위해 사용될 수있는 예를 생성 할 수있다. 또한,이 프로토콜에 따라 생성 된 iSABs 심장 조직 공학을 향한 중요한 단계가 될 수 있습니다.

설명 프로토콜은 마우스의 심장 박동 주파수에 가까운 (동영상 참조) PSC를에서 약 450 BPM의 구타 주파수 iSABs의 생성을 할 수 있습니다. 도 1에 도시 된 바와 같이 iSABs 해리 (단계 2.8.8) 후에 관찰 된 단일 세포는 동방 결절 (주축 및 거미 세포)의 세포의 일반적인 형태를 나타낸다. 이들 세포를 알려진 고도로 익스프레스 단백질 기능에 필수적인 것으로 과분극 활성화 주기적 뉴클레오티드 문이 양이온 채널 4 (Hcn4), Connexin45 (Cx45), Connexin30.2 (Cx30.2)과 Myh6 (- C 그림 2A)와 같은 동방 결절의. 파마 ISAB 유래 세포의 처리 후, 세포는 예상되는 동작을 보여 동방 결절 에서처럼 재미 채널 차단제 ZD7288 (도 3a)뿐만 아니라, 무스 카린 수용체 작용제 카바 콜 (도 3B)가 모두 상당히 감소 매질을 일으킬 ISAB deriv의...

이 프로토콜은 쥐의 다 능성 줄기 세포 (PSC)에서 기능 동 노드 조직을 생성하는 방법에 대해 설명합니다. T-Box3 (TBX3) 과발현 플러스 심장 미오신 헤비 체인 (My​​h6) 발기인 항생제 선택은 고순도의 페이스 메이커 세포 집합체로 연결됩니다. 이러한 &quot;유도 - 동방 - 몸&quot;( &quot;iSABs&quot;)는, 고도의 박동 속도를 증가 보여 80 %의 심장 박동 세포를 포함하고 심근 생체 조절이 할 수 있습니다.

Myh6 발기인 - 선택과 함께 ES-세포 프로그래밍을 바탕으로 설치류 심장 페이스 메이커 세포 집합체의 생성

Treatment of the &#8220;sick sinus syndrome&#8221; is based on artificial pacemakers. These bear hazards such as battery failure and infections. Moreover, ...

이 절차의 전반적인 목표는 고순도의 동방결절 세포를 생성하는 것입니다. 이는 먼저 배지를 수정하여 세포 분화를 유도하고, 정해진 크기의 배아체 형성을 위해 행잉 드롭(hanging drops)을 제작함으로써 달성됩니다. 다음으로, 배아체를 젤라틴 코팅된 디시에 안착시켜 세포층을 형성하게 합니다.그다음 항생제 선택 과정을 시작하여 심근세포만 생존하도록 합니다. 마지막으로, 세포층을 해리하여 빠르게 박동하는 단일 동방결절 세포 또는 작은 동방결절체들을 얻습니다. 최종적으로, 살아있는 세포 이미징을 통해 동방결절 세포의 높은 박동 빈도를 보여줍니다.이 방법의 주요 장점은 약물 테스트 등을 위해 매우 순도가 높은 동방결절 세포를 생성할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 세포를 통해 기저 메커니즘에 대한 통찰력을 얻을 수 있으므로 동방결절 질환의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 해당 기술은 이 방법을 개발한 박사 과정 학생인 Julia Yung이 실험실에서 선보일 예정입니다. 텍스트 프로토콜에 기술된 대로, 분화 과정 2일 전에 방사선 조사된 피더 세포와 함께 공배양된 ES 세포주 및 다능성 줄기세포로 시작하여, 먼저 배지를 흡입함으로써 피더 세포로부터 PSC를 제거했습니다.10 mL의 PBS를 사용하여 세포를 세척합니다. 그런 다음 7 mL의 collagenase four 용액을 첨가하고 37 °C에서 10분 동안 세포를 배양합니다. 이어서 50 mL 튜브에 멸균된 40 µm 필터를 배치합니다.그 다음 콜라게나제 용액을 다섯 번 파이펫팅하여 PSC 콜로니를 조심스럽게 헹굽니다. 세포 현탁액을 필터로 옮기고 8 mL의 PBS를 사용하여 필터를 세 번 헹굽니다. 그다음 필터를 뒤집어 페트리 접시에 엎어 놓고 필터 바닥에 10 mL의 PBS를 파이펫팅합니다.PSC 콜로니를 제거하기 위해, 이제 세포 현탁액을 15 mL 튜브로 옮기고 300 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. PBS를 제거하고, 세포를 1 mL의 Accutane에 현탁시킨 후 37 °C에서 5분 동안 배양합니다. 배양 후, 10 mL의 PBS를 추가합니다.피펫팅으로 다섯 번 상하 혼합하여 세포 용액을 섞은 후 300 ×g에서 5분 동안 원심 분리합니다. PBS를 제거한 후, 10 mL의 세포 배양 배지를 사용하여 세포를 재현탁하고 세포 수를 측정합니다. 75 cm² 필터 플라스크에 cm²당 15,000개의 세포를 분주하고 37 °C, 5% CO

generation-murine-cardiac-pacemaker-cell-aggregates-based-on-es-cell

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

우리는 심혈관 수리를 위해 인간의 심장 progenitors 및 기능 cardiomyocytes의 큰 공급 파생을 가능하게 작은 분자와 함께 정의된 조건 하에서 유지 pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 직접 cardioblasts의 유도를위한 프로토콜을 설립했습니다.

작은 분자와 유도 Pluripotent 인간 배아 줄기 세포로부터 인간 심장 엽 성의 전구 물질과 Cardiomyocytes의 효율 유도

정렬 심근 조직의 생성 임상 유용한 목적에 줄기 세포 생물학의 최근 발전을 조절하기위한 중요한 요구 사항입니다. 여기에 우리는 세포의 형태와 기능의 정확한 제어를위한 microcontact 인쇄 방법을 설명합니다. 심장 progenitors을 파생 배아 줄기 세포의 높은 정화 인구 사용하여, 우리는 비 등방성 기능 심근 조직을 생성합니다.

Microcontact 인쇄를 통해 정렬 기능 심근 조직의 생성

만능 줄기 세포는 배아 또는 유도 된 pluripotent 줄기 (IPS의) 세포 중 하나는 심근을 포함한 인간의 차별화 된 세포의 중요한 소스를 구성합니다. 여기, 우리는 배아 체 기반 프로토콜을 통해 기능적 인간의 심근을 얻기 위해 그들을 사용하는 방법을 보여주는, IPS 세포의 심장 유도에 초점을 맞출 것이다.

인간의 Cardiomyocytes의 생성 : 피더없는 인간 유도 만능 줄기 세포에서 분화 프로토콜

여기서, 우리는 인간의 생물학적 기능을 다시 요약 관대 배양 조건 하에서 수축성 근섬유 (myospheres)의 입체 클러스터를 형성하는 골격 근육 원종의 균질 한 집단을 생성 향해 인간 배아 줄기 세포 (인간 배아 줄기 세포)의 후생 유전 학적 리 프로그래밍을 기반 프로토콜을 설명 골격 근육.

성적인 프로그램을 다시 만들에 의해 인간 배아 줄기 세포에서 Myospheres의 생성

이 프로토콜에서는 마우스 및 인간 배아 줄기 세포 모두에서 심장 전구 세포의 유도가 설명됩니다. 이 프로토콜의 주요 전략은 배아 줄기 세포주에 조작된 형광 리포터를 사용하여 유세포 분석으로 심장 전구 세포를 풍부하게 하는 것입니다.

배아 줄기 세포에서 심장 전구 세포의 유도

여기에서는 폴리시스트로닉 구조에서 Gata4, Tbx5 및 Mef2c의 레트로바이러스 매개 전달을 사용하여 iCM을 생성하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 효율성과 품질이 향상된 비교적 균질한 재프로그래밍된 세포 집단을 생성하며 향후 iCM 재프로그래밍에 대한 연구에 유용합니다.

Gata4, Mef2c 및 Tbx5의 최적 비율을 표현하는 폴리 시스 트론 구조를 사용하여 유도 된 심근의 향상 발전

in vitro에서 만능 줄기 세포에서 심근 세포를 생성하면 기초 과학 및 임상 응용을 위해 많은 양의 in vitro 심장 조직에 접근할 수 있습니다.  이 프로토콜은 심방화 인자 Grem2를 사용하여 얻은 심근세포의 수를 증가시키고 심방 표현형을 가진 심근세포를 생성합니다.

BMP 길항제 Grem2를 사용하여 다 능성 줄기 세포에서 심방 심근의 차별화

이 원고는 Gata4, Hand2, Mef2c 및 Tbx5의 레트로바이러스 매개 전달을 사용하여 다양한 재프로그래밍된 심장 아형의 생성 및 정량화를 위한 단계별 프로토콜을 설명합니다.

마우스 배아 섬유 아 세포의 전사 인자 매개 재 프로그래밍에 따라 심근 서브 타입을 평가

여기 선물이 overexpression Mef2c, GATA4, Hand2, Tbx5, 미르-1, 그리고 미르-133 (GHMT2m) TGF-β 신호 전달의 억제와 함께 통해 기능 cardiomyocytes에 기본 미 발달 섬유 아 세포를 재 설 정할 하는 강력한 방법. 우리의 프로토콜 생성 박동 cardiomyocytes 일찍 최대 60 %7 일 후 변환 효율.

프로 거리 신호 억제 유도 Cardiomyocytes에 마우스 미 발달 섬유 아 세포의 프로그래밍 요소 중재 Potentiates

이 방법의 목적은 전구 세포 사양 및 기능적 특성을 연구하기 위해 시험관 내에서 심장 필드 특이적 심장 전구 세포를 생성하고 심장 질환 모델링을 위한 챔버 특정 심장 세포를 생성하는 것이다.

마우스 심장 필드 특정 심장 전구 세포의 시험관 내 생성

배우세요 항생제 선택을 이용한 ES세포 기반 심장 페이스메이커 세포 분화법을 통해 설치류에서 고순도의 정동결세포를 생성하는 방법을. 이 기술은 심장 조직 공학 및 약물 테스트 연구에 활용됩니다.

Myh6 발기인 - 선택과 함께 ES-세포 프로그래밍을 바탕으로 설치류 심장 페이스 메이커 세포 집합체의 생성

더 많은 동영상 탐색