Myh6 발기인 - 선택과 함께 ES-세포 프로그래밍을 바탕으로 설치류 심장 페이스 메이커 세포 집합체의 생성

이 절차의 전반적인 목표는 매우 순수한 부비동 결절 세포를 생성하는 것입니다. 이것은 먼저 배지를 변형하여 세포 분화를 유도하고 정의된 크기의 배아체를 형성하는 매달린 방울을 만듦으로써 달성됩니다. 다음으로, 배아체를 젤라틴으로 코팅된 접시에 올려 세포층을 형성합니다.

그런 다음 항생제 선택이 시작되고 심근세포만 살아남습니다. 마지막으로, 세포층은 빠르게 박동하는 단일 부비동 결절 세포 또는 작은 부비동 결절체를 얻기 위해 해리됩니다. 궁극적으로 살아있는 세포 이미징은 부비동 결절 세포의 높은 박동 주파수를 보여주는 데 사용됩니다.

이 방법의 가장 큰 장점은 예를 들어 약물 검사를 위해 매우 순수한 부비동 결절 세포를 생산할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 세포가 기본 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하기 때문에 부비동 결절 질환의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술은 분화 절차가 먼저 배지를 흡인하여 공급세포에서 PSC를 제거하기 이틀 전에 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 방사선 조사된 공급세포로 배양된 ES 세포주 및 만능 줄기세포로 시작하는 방법을 개발하는 박사 과정 학생인 Julia Yung이 실험실에서 발표할 예정입니다.

10ml의 PBS를 사용하여 세포를 세척하십시오. 그런 다음 7ml의 콜라겐 분해 효소 4 용액을 넣고 섭씨 37도에서 10 분 동안 세포를 배양합니다. 그런 다음 멸균 40마이크로미터 필터를 50ml 튜브에 넣습니다.

그런 다음 콜라겐분해효소 용액을 위아래로 5회 피펫팅하여 PSC 콜로니를 조심스럽게 헹굽니다. 셀 현탁액을 필터로 옮기고 PBS 8ml를 사용하여 필터를 세 번 헹굽니다. 그런 다음 필터를 뒤집어 페트리 접시에 거꾸로 놓고 필터 바닥에 PBS 10ml를 피펫팅합니다.

PSC 콜로니를 제거하기 위해 이제 세포 현탁액을 15ml 튜브로 옮기고 300회씩 5분 동안 원심분리기를 합니다. G. PBS를 제거하고 Accutane 1 밀리리터로 세포를 현탁시키고 37 °C에서 5 분 동안 배양합니다. 배양 후 PBS 10ml를 첨가합니다.

배 여기저기 피펫팅해서 세포 해결책을 섞고 300배 G.Once PBS가 제거되면, 세포를 resuspend하고 세포 수 씨를 결정하기 위하여 세포 배양 매체의 10 밀리리터를 이용하십시오.75 평방 센티미터 여과기 플라스크에 있는 평방 센티미터 당 15, 000의 세포는 플라스크가 50이어야 할 때 37 섭씨 온도 및 5%carbon dioxide에 2 일 동안 그(것)들을 경작하십시오 70%confluent로. 텍스트 프로토콜에 따라 분화 배지에 현탁된 세포와 Resus를 수확한 후, HDS가 건조되는 것을 방지하기 위해 2차 페트리 접시에 물 20ml와 행잉 드롭 또는 HD 용액 5ml를 피펫으로 넣습니다.

다음으로, 트레이에 최대 50ml의 세포 현탁액을 피펫팅합니다. 그런 다음 페트리 접시의 뚜껑을 뒤집고 12채널 피펫을 사용하여 각각 20마이크로리터의 세포 현탁액이 들어 있는 180HDS를 뚜껑에 놓습니다. 조심스럽게 뚜껑을 뒤집어 페트리 접시에 올려 놓습니다.

세포가 ebs를 형성하도록 이틀 동안 배양한 후, 2차 페트리 접시의 뚜껑을 조심스럽게 뒤집고 두 개의 페트리 접시에서 파생된 EBS를 50ml 튜브로 옮깁니다. EBS가 튜브 바닥에 가라앉을 때까지 10분 정도 기다린 다음 가능한 한 많은 매체를 흡입합니다. 10ml의 분화 매체를 사용하여 EBS를 현탁하고 현탁액을 10cm 페트리 접시로 옮깁니다.

세포가 4일 동안 현탁액으로 배양되면 텍스트 프로토콜에 따라 EBS를 젤라틴으로 코팅된 10제곱센티미터 세포 배양 접시 1개에 옮기고 현미경으로 다음 2-6일 동안 배양하고 세포가 박동하기 시작한 지 3일 후에 세포의 박동 병소와 세포층 형성을 확인합니다. 배지를 흡입하고 10ml의 새로운 차별화를 추가합니다. 400 μm의 밀리리터 당 G 4 18을 포함하는 배지는 4 일 후에 세포에 공급됩니다. 세포층을 흡인하지 않고 배지를 조심스럽게 제거합니다.

그런 다음 PBS 10ml를 첨가하여 세포를 세척합니다. PBS를 조심스럽게 제거한 후 10ml의 콜라겐 분해 효소 4 용액을 넣고 세포를 50 ml 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 섭씨 37도에서 5분 동안 배양한 후 10회 상하 피펫팅하여 현탁액을 격렬하게 혼합하고 추가로 5분 동안 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다.

작은 클러스터의 서스펜션이 있어야 합니다. 그런 다음 PBS 20ml를 넣고 300회씩 10분간 원심분리합니다. G, PBS를 조심스럽게 흡인하고 유도 된 중국 심방체 또는 SAB를 생성하는 경우, G 4 18 밀리리터 당 400 마이크로 그램을 포함하는 분화 배지 12 밀리리터를 사용하여 Resus에 세포를 현탁시키고 분화 배지를 추가하는 대신 단일 결절 세포를 생성하기 위해 24 웰 젤라틴 코팅 플레이트의 6 웰에 각각 2 밀리리터를 봅니다.

PBS를 제거한 후 5ml의 Accutane을 사용하여 세포를 현탁시키고 섭씨 37도에서 5분 동안 배양합니다. 피펫을 위아래로 격렬하게 움직입니다. 섭씨 37도에서 5분 동안 배양한 후 현탁액을 혼합합니다.

20ml의 PBS를 첨가하고 12ml의 분화로 300배 G에서 5분 동안 원심분리합니다. G 4 18을 포함하는 매체. 세포를 현탁시키고 24웰 젤라틴 코팅 플레이트 배양의 6개 웰에 각각 2밀리리터씩 보고 텍스트 프로토콜에 따라 세포 분석을 수행합니다.

이 비디오에서 시연된 프로토콜을 사용하여 isab S는 isab S의 해리 후 여기에서 볼 수 있듯이 분당 약 450회의 박동 주파수를 가진 만능 줄기 세포에서 생성될 수 있습니다. 이 세포는 과분극, 활성화, 고리 뉴클레오티드, 개폐 양이온과 같은 부비동 결절의 기능에 필수적인 단백질의 높은 발현 수준을 보여줍니다. 채널 4, HCN 4, 코넥션 4, 코넥션 5, 코넥션 30.2, MYH 6.

채널 차단제 ZD 7 2 88 또는 무스카린 수용체 작용제 카라콜로 치료하면 ISAB 유래 세포의 박동 빈도가 현저히 감소합니다. 반면에 베타 부신 수용체 작용제 이소프렌은 박동 빈도를 높입니다. 전반적으로 우리의 기술은 심장 박동기의 기능과 질병을 더 잘 이해할 수 있는 길을 열 것입니다.

이 비디오를 시청한 후에는 PLU의 강력한 줄기 세포에서 완전한 기능을 하는 부비동 결절 세포를 생성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.