종양 기질 상호 작용에 대한 세 가지 차원의 공동 문화 모델

이 실험 절차의 전반적인 목적은 3차원 공동 배양법을 통해 폐암 세포와 암 관련 섬유아세포 간의 세포 상호작용을 조사하는 것입니다. 이는 채취한 폐 조직을 1mm 크기로 잘게 분쇄하여 인간 폐암 관련 섬유아세포를 일차 배양함으로써 수행됩니다. 다음 단계는 트립신 처리된 세포를 사용하여 콜라겐 용액을 혼합하고, 이를 6-웰 플레이트로 옮겨 젤화함으로써 섬유아세포가 내장된 콜라겐 젤을 준비하는 것입니다.

다음으로, 암세포와 섬유아세포의 입체 공배양을 준비하기 위해 폐선암 세포를 각 겔의 표면에 도말하고, 웰의 가장자리에서 겔을 분리하여 부유 배양을 유도합니다. 마지막 단계로, 수축된 겔을 6웰 플레이트에 위치한 메쉬 위에 올려 공기 중에 노출시킴으로써 공기-액체 계면 배양 및 침습 분석을 수행합니다. 최종적으로, 조직학적 검사를 통해 암세포의 침습과 형태학적 변화를 평가합니다.

이 절차가 2차원 단일층 배양과 같은 기존 방법보다 갖는 주요 장점은, 3차원 배양 조건에서 다세포 상호작용을 조사할 수 있다는 점입니다. 이 절차는 텍스트 프로토콜에 기술되고 참조된 바와 같이, 수집된 폐 조직으로부터 섬유아세포를 1차 배양하는 것으로 시작합니다. 본 영상에서는 인간 폐암 조직 대신 마우스 폐를 사용합니다.

배양액이 없는 10 centimeter 조직 배양 접시에 폐 조직 샘플을 놓습니다. 멸균 핀셋과 메스를 사용하여 조직을 약 1 millimeter 크기의 작은 조각들로 자릅니다. 이 과정에서 조직 단면이 마르지 않도록 주의하십시오. 그렇지 않으면 세포 성장의 효율이 저하됩니다. 각 조각 주변에 빈 공간이 유지될 수 있도록 작은 폐 조직 조각들을 서로 떨어뜨려 배치합니다.

메스 날을 사용하여 조직 배양 접시의 표면에 긁힘을 만듭니다. 대안적으로, 조직 조각을 덮어주면 여러 차례의 계대 배양 후 세포 성장 및 세포 증식의 효율이 향상됩니다. 먼저 각 웰의 1.5 centimeter 간격으로 두 지점에 실리콘 그리스를 도포합니다.

다음으로 다져진 조직 조각들을 각각의 중심에 개별적으로 배치합니다. 그런 다음 실리콘 그리스를 사용하여 커버슬립을 플레이트 표면에 부착합니다. 조직 절편이 마르기 전에 배양액을 디쉬 또는 6웰 플레이트에 조심스럽게 첨가합니다.

대부분의 효율적인 세포 증식 능력이 상실됩니다. 샘플이 건조된 경우, 콜라겐 젤 형성을 위한 조직 절편의 박리를 방지하기 위해 배지를 너무 빠르게 붓지 마십시오. 섬유아세포를 1배 인산 완충 식염수(PBS)로 세척하고, 트립신을 첨가하여 약 5분간 트립신 처리 후 증식된 세포를 박리하십시오.

37°C에서 10% FBS가 첨가된 DMEM 9mL를 사용하여 세포를 떼어냅니다. 배지에 부유된 세포를 10mL 튜브에 수집하고 200~300 ×g에서 원심분리하여 세포 펠렛을 형성합니다. 생성된 펠렛을 100% FBS에 0.5 × 10⁶ cells/mL 밀도로 재현탁합니다. 콜라겐 겔 제작 전, 냉장고에서 콜라겐 겔 준비에 사용할 시약, 피펫 및 튜브를 냉각시킵니다.

다음으로, 섬유아세포 현탁액을 FBS, Type one A collagen, 5X DMEM 및 재구성 완충액과 혼합하여 콜라겐 겔을 준비합니다. 이때 피펫팅 과정에서 기포가 생성되지 않도록 주의하며 강하게 피펫팅하여 균질한 혼합물을 만듭니다. 그런 다음, 6-웰 플레이트의 각 웰에 혼합물 3 mL씩을 넣고 37 °C 인큐베이터에서 30~60분 동안 건드리지 않은 상태로 겔화시킵니다. 콜라겐 겔 위의 암세포 배양을 위해, 암세포를 3D 공동 배양 배지에서 1 × 10⁵ cells/mL 밀도로 재현탁합니다.

재현탁된 A 5 49 폐선암세포 용액 2 mL를 각 겔의 표면에 붓습니다. 겔 수축 실험을 수행하기 위해 실험 조건에 따라 공배양하는 암세포 또는 섬유아세포의 세포 수를 조절하십시오. 암세포가 콜라겐 겔에 부착될 수 있도록 37 °C에서 겔을 하룻밤 동안 배양합니다.

그 후 각각을 분리하여 각 웰에 부유 배양을 생성합니다. 2~3일마다 21 gauge 각도 바늘이나 작은 스파출라를 사용하여 6-웰 플레이트의 각 겔을 웰 가장자리에서 분리합니다. 2 mL의 3D 공동 배양 배지로 웰을 교체합니다.

5일 동안 매일 각 겔의 크기를 측정하십시오. 마지막으로, 콜라겐 겔 분석을 위한 텍스트 프로토콜을 참조하십시오. 콜라겐 겔을 37 °C에서 5일 동안 배양한 후입니다.

수축된 겔을 메쉬 위에 올려 공기 중에 노출시킵니다. 새로운 6-웰 플레이트에 유세포 분석용으로 시판되는 셀 스트레이너를 이용해 메쉬를 만듭니다. 각 웰에 11 milliliters의 3D co-culture Medium을 조심스럽게 채웁니다.

멸균된 스푼을 사용하여 겔을 메쉬 위에 배치하고, 이 조건에서 겔에 남아 있는 배지를 제거합니다. 겔의 윗면은 공기에 노출된 상태에서 겔의 아랫부분은 배지에 잠기게 합니다. 이러한 배양 조건을 공기-액체 계면(air liquid interface)으로 정의합니다.

종양 미세환경을 모방한 이 공동 배양법은 콜라겐 겔에 매립된 암세포와 섬유아세포 간의 상호작용을 연구하는 데 유용한 도구입니다. A 5 49 세포를 섬유아세포가 매립된 콜라겐 겔 상에서 공동 배양하였으며, 겔을 배지가 담긴 메쉬 위에 올려놓음으로써 A 5 49 세포층이 공기에 노출되도록 하였습니다. 여기 제시된 것은 6-웰 플레이트의 웰 내 메쉬 위에 놓인 겔의 대표 사진으로, hematoxylin 및 eosin을 이용한 조직학적 분석 결과입니다.

3차원 배양 젤의 단면을 염색한 결과, 폐암 관련 섬유아세포가 포함된 콜라겐 젤 내부로 5 49 세포가 침습했음을 확인하였습니다. 이 절차 이후, 종양 기질 상호작용에서 특정 유전자의 기능과 같은 추가적인 의문에 답하기 위해 유전자 발현 분석이나 넉다운(knockdown)과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.