Name: 배아 쥐의 뇌에서 차 중뇌 도파민 신경 세포의 분리, 문화 및 장기 유지 보수 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: 배우세요 배아 쥐 뇌 중뇌 도파민 신경 세포 분리 및 장기 배양 프로토콜입니다. 면역형광 현미경으로 신경 세포를 식별하며 파킨슨병 신경퇴행 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 작업은 임페리얼 칼리지 런던(Imperial College London) 의과대학 뇌과학부(Division of Brain Sciences, Department of Medicine)에서 K.N.A.에 투여한 창업 자금으로 수행되었습니다.

참고 : 동물이 유지되고 승인 된 기관의 가이드 라인과 모든 동물의 절차를 준수하여 처리 제국 대학의 동물 복지로 하였다 윤리적 검토 기관 (AWERB) 및 홈 오피스와 하버드 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 연방 및 주 정부 규정에. 1. 시약 및 장비 설치 <ol><li> 해동, 나누어지는 -80 ºC에서 저장 한 ㎎ / ㎖ 라미닌 솔루션입니다. 1-2 ㎍ / ㎠의 코팅 농도 결과 1ml를 DMEM / F12에서 2 μl를 녹인다. 참고 : 천천히 얼음과 판 / 커버 슬립에 추가 즉시 차가운 DMEM / F12에 용해 및 해동 라미닌. </li><li> 4 ºC에서 75 ml의 0.01 % 425 ml의 PBS에서 폴리 오르니 틴 L-및 저장의 희석. 참고 : 작업 솔루션의 유효 기간은 1 개월까지이다. </li><li> 너희 최대 4 ºC에서 25 % (중량 / 부피) PBS에서 BSA, pH가 7.4, 저장을 녹여아칸소. </li><li> (HBSS)에 50 % FBS 비활성화 미디어를 준비합니다. </li><li> (+) - - 포도당 (중량 / 부피), 0.25 %의 BSA (중량 / 부피) 50 U / ml의 페니실린과 스트렙토 마이신, 1 배 N2 보충, 5 % (부피 / 부피) FBS, 0.36 %의 D를 추가하여 완전한 매체 준비 DMEM / F12 및 저장 4 ºC에서. 참고 : 유효 기간 10 일입니다. </li><li> 적어도 30 분 동안 70 % (부피 / 부피) 에탄올을 끓는 배치 된 커버는 그리스와 오토 클레이브의 모든 흔적을 제거합니다. </li><li> 장소 24 웰 플레이트에 된 커버와 각 웰에 500 ㎕의 폴리 -L- 오르니 틴 솔루션을 추가합니다. RT의 조직 문화 후드에서 1 시간을 품어하고, 500 μL 물로 3 회 세척한다. 각 플레이트에 500 μL의 라미닌 솔루션을 추가하고 37 ºC에서 가습 된 조직 문화 인큐베이터에서 O / N을 품어. 참고 : 더 세척이 24 시간 배양 한 후 세포의 죽음에 폴리 -L- 오르니 틴 세 번보다 적지 결과를 세척, 라미닌 처리 후 필요 없지만. </li><li> 천연 가스 토치 f를 통해 유리 피펫의 팁을 폴란드어절름발이. 참고 :이 단계 후에 팁의 직경이 정상 크기의 절반해야한다. </li><li> 멸균 된 가위와 오토 클레이브를 사용하여, 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브의 캡을 잘라. </li></ol> 배아 복부 중뇌 2. 해부 <ol><li> 마취시키다가 시간이 초과 임신 (E12.5) CO 2 흡입 댐 후 자궁 전위에 의해 안락사. </li><li> 70 % 에탄올로 복부를 스프레이 자궁 주머니가 모두 노출 될 때까지 복부 절개를합니다. 사용 집게 질 첨부 파일을 절단하고 자궁을 제거합니다. 100mm 페트리 접시에 얼음처럼 차가운 HBSS의 자궁을 놓습니다. </li><li> 집게 (그림 1C)를 사용하여 자궁과 양막에서 배아를 제거합니다. 신선한 얼음처럼 차가운 HBSS에있는 장소 배아. 주 : 그림 1D의 사각형은 배아 복부 중뇌의 위치를 나타냅니다. </li><li> 해부 현미경 (10 배 확대)에서 배아를 놓고 중간 뇌를 해부, 지협과 중뇌 - diencephalic 경계 영역에서 뇌를 절단 bioscissor와 집게 사용하여 아치 (그림 1E를 절개 라인도 1a를 참조하십시오). </li><li> 전체 중뇌을 복용 한 후, mediodorsal 중뇌 (그림 1 층)에 상처를합니다. </li><li> 두 포셉 (그림 1H)를 사용하여, 수막을 제거합니다. 참고 : 중요한 단계 :이 단계는 최적의 신경 세포 수율과 생존을 위해 필수적이다. 배양 조건은 뇌 세포의 최적이기 때문에, 주위 조직에서 세포의 대부분은 도금 후 다이이 조직으로부터 세포 사멸 신호 문화 무결성이 손상된다. </li><li> 멸균 면도날 (도 1H, I)을 사용하여 나비 형상을 관찰하고, 각 날개의 약 절반을 절단하는 페트리 접시에 중뇌 조직을 병합. 주 : 그림 1J는 격리 된 복부 중뇌를 보여줍니다. </li><li> 이동15 ML 원뿔 관에 얼음처럼 차가운 HBSS로 복부 중뇌의 조각 다음 배아를 진행합니다. 참고 : 2.1-2.8 이상 1 시간을 안 단계. 얼음이 기간을 넘어 배아를 유지하는 것은 상당히 세포 생존 능력을 감소시킨다. </li></ol> 복부 중간 뇌 세포의 3 해리 <ol><li> 층류 후드 하에서 복부 중뇌 조각을 전송. HBSS를 제거하고 (복부 중뇌의 최대 12 조각에 충분한 볼륨을) 원뿔 튜브로 예열 한 ㎖ (37 ° C) 0.05 % 트립신 EDTA를 추가합니다. 5 ~ 10 분 동안 37 ºC에서 조직을 품어. </li><li> 후드 트립신 EDTA를 제거하고 조직을 1 ml의 탈 활성화 매체 (혈청 트립신을 비활성화합니다)를 추가합니다. </li><li> 비활성화 매체를 제거하고 두 번 완전 배지 1 ㎖의의 조직을 씻는다. 주 : 해리 된 세포를 폐기하는 것을 방지하기 위해, 튜브의 모든 매체를 제거하고 조직을 피펫 피한다. </li><li> 1ml의 완전한 매체와 trit 추가화재 연마 유리 피펫으로 조직을 요산. 거품의 형성을 방지하고 단일 세포 현탁액이 달성 될 때까지 분쇄하여 계속합니다. 참고 : 일반적으로 8-10 완전한 분리에 필요한 제한된 팁을 통과한다. </li><li> RT에서 5 분 400 XG에서 세포를 원심 분리기와 매체를 제거합니다. </li><li> 다시 일시 중지 천천히 피펫 팅에 의해 완전 배지 1 ㎖의의 펠렛을 위 아래로 4 배합니다. </li></ol> 4. 도금 복부 중간 뇌 세포 <ol><li> 90 ㎕의 트리 판 블루 용액으로 세포 현탁액 10 μL와 혼합하여 혈구 세포의 수를 계산. 참고 : 세포의 생존도이 단계에서 확인할 수 있습니다. </li><li> 캡의 상단에 한 번에 집게, 하나를 사용하여, 100mm 페트리 접시에 멸균 microcentrifuge 관 뚜껑을 놓고 폴리-L-오르니 틴 / 라미닌 코팅 된 커버를 전송할 수 있습니다. 참고 : 된 커버를 세척하지 말고이 uneve의 원인이되므로, 라미닌 건조 방지n 개의 문화와 세포의 생존 감소. </li><li> (볼륨 유출없이 커버 슬립의 표면을 덮도록 최적) 완전 배지를 첨가하여 1 μL 당 1500 세포로 볼륨을 조절하고, 각 커버 슬립 위에 세포 현탁액 100 ㎕ (150,000 세포의 합계)를 추가한다. 가습 조직 문화 인큐베이터에서 배양 접시를 닫고 1 시간 동안 그들을 품어 (37 ° C, 5 % CO 2). 주 : CRITICAL 단계 :이 단계는 세포의 부착과 생존을 증강 용 커버 슬립 당 ​​배아의 개수를 증가시키기 위해 필요하다. 대안 적으로, 세포를 직접 웰 (함유 된 커버)하지만 세포의 수 (대신 150,000) 웰 당 350,000 증가되어야로 전달 될 수있다. 직접 전송 때문에 (옆 또는 커버 슬립 아래) 판에 부착 세포의 약 3-4 된 커버를 산출하는 동안 즉,이 방법을 사용하여, 8-10, 커버 슬립, 취득 할 수있다. 평균 viabili이 방법을 사용하여 배양 TY는 약 90 %였다. </li></ol> 5. 문화 성장 및 유지 관리 <ol><li> 배양 1 시간 후에, 조심스럽게 400 ㎕의 예열 (37 ºC까지) 완전 배지 함유하는 24 웰 플레이트에 배지를 포함하여 전송 된 커버 (총 부피 : 500 μl를). 37 ºC에서 세포 O / N을 품어. </li><li> 우물의 배양 후 24 시간 이내에, 부드럽게 각 웰에 500 ㎕의 완전 배지를 추가합니다. 주 : 처음 몇 시간은 도파민 뉴런의 생존과이 지점을 넘어 크게 변하지 않는다 생존 세포의 수에 대한 가장 중요한 단계이다. </li><li> 처음 2 주 동안이나 매체가 노란색이 될 때까지 문화에 추가 용지를 추가하지 마십시오. 2 주 이상 또는 신선한 완전한 예열 미디어 (일반적으로 매 2 주) 노란색, 미디어의 교환 절반 (500 μL) 중간 색상 변경을 배양합니다. 참고 : 내 도파민 뉴런문화는 이러한 조건에서 6 개 이상의 주 동안 살아남을 것입니다. </li></ol>

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</ol>

이해 상충이 선언되지 않았습니다.

중뇌 도파민 성 신경 세포는 중추 신경계에서 도파민의 주요 원인이다. 그들은 세 그룹으로 나누어, 흑질의 유리체 compacta (SNpc), 복부 피개 영역 (VTA)과 retrorubral 필드 (RRF) 10, 11. SNpc과 VTA의 뉴런은 감정, 동기 부여 및 모터 동작의 제어 등의 기능에 관여, mesocortical 변연계 및 nigro - 선조체 주요 도파민 경로, 상승을 제공합니다. SNpc 흑질 선조 및 시스템의 기능적 파괴에서 뉴런의 죽음은 제 가장 두드러진 신경 변성 질환, 파킨슨 병 (PD) (12, 13)의 주요 병리학 적 특성이다. 현재 치료 방법은 질병의 증상을 해결하고 중지 또는 퇴화 속도를 느리게하고 천천히, 점진적 세포 손실의 원인은 여전히 14 ~ 16 알 수 없습니다. 따라서, 생체 내에서와 developme에의 연구를위한 체외 기법의 개발ntal, 생화학,이 신경 인구의 생리 학적 특성은 PD의 ...

흑질에서 도파민 신경 세포의 손실 compacta는 파킨슨 병 (PD), 두 번째 가장 흔한 신경 퇴행성 질환의 추기경 모터 증상에 이르게 갈 거예요. 이 중뇌 신경 인구의 서거의 근본적인 원인은 알려져 있지 않다. 사용 된 개발 및 신경 생리 학적 특성과 mesDA 신경 세포, 여러 세포 배양 및 동물 모델 시스템의 생존을 변조에 대한 책임을 생화학 적 경로를 연구합니다. 쥐의 도파민 세포주 1RB 3 27 (N27), 인간 도파민 신경 아세포종 세포주 SH-SY5Y, MN9D 인간 중뇌 세포를 LUHMES 마우스 도파민 하이브리드 세포주 포함 불멸화 세포주는, 생화학 및 제한된 역학적 연구 한 사용되어왔다 -5. mesDA 뉴런 특이 손실 연구를 위해 몇몇 신경 독소 계 유전 모델 6-8 개발되었다. 차 복부 중뇌 문화, 도파민 성 신경 세포의 신경 세포와 시냅스 특성이 일반적인 장애의 발병 기전에 관여하는 경로를 연구하기위한 필수 불가결 한 도구를 제공합니다. 여기에서 우리는 더 높은 생존 성 및 배아 당 된 커버의 수율 증가의 결과로 수정을 포함 중뇌 도파민 신경 세포의 분리에 대한 자세한 프로토콜을 제시한다. 사전 성숙한 E12.5 마우스 중뇌 (쥐에 E14.5)의 사용은 생존을 향상시킵니다. 이 나이에 신경 해부 동안 그대로 세포 잎, 이는 아직 축삭을 개발하여 현저하게 수명을 연장해 스트레스를 최소화하지 않았습니다. 또한,이 프로토콜의 2 절에 설명 된대로 복부 중뇌의주의 해부, 더 생존 성을 향상시킨다. 커버 슬립 당 ​​배아의 개수를 증가시키기 위해 대안적인 도금법이 프로토콜 부 (4)에 제시되어있다. 이 아래 4 된 커버에 비해 배아 당 최대 10 된 커버의 수율로 연결표준 도금 조건 따라서 당 실험 동물의 양을 감소시킨다. 축삭과 dentrites의 문화 전시 가지 뉴런은 시냅스 연결을 형성 라이브 세포 이미징, 면역 세포 화학 및 전기 생리학 연구에 대한 이러한 문화가 적합 신경 세포와 시냅스 마커의 존재를 알 수있다. 또한, 신경 세포 배양의 사용은 유전 적 및 약리학 적 조작을 용이하게한다. 체외에서 2 일에서 신경 돌기의 가지 발달 연구 수 있습니다. 또한, 문화의 장기 생존율 (최대 6 주) 뉴런의 느린, 진보적 인 변성의 연구에 적합합니다.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco의 변형 Eagle 배지 영양 혼합물 F-12</td><td>Invitrogen</td><td>11330</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), 액상</td><td>Invitrogen</td><td>24020-117</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청, 열 비활성화 (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>16140</td><td></td></tr><tr><td>N2 보충제 (100X), 액상</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-포도당 용액(물 중 45%(wt/vol)</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 BSA</td><td>Sigma</td><td>A9430</td><td></td></tr><tr><td>Engelbreth-Holm-Swarm 쥐 육종 기저막의 라미닌</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Invitrogen</td><td>15070</td><td></td></tr><tr><td>트립신(0.05% (wt/vol)</td><td>Invitrogen</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA) 세포 배양 테스트</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>항-티로신 하이드록실라제(Th) 항체</td><td>Pel-Freez Biologicals</td><td>P60101-0&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-ornithine, 0.01% 용액</td><td>Sigma</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Map2 (Microtubule associated protein-2A 및 -2B) 항체</td><td>Millipore</td><td>MAB3418</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Synapsin-1 항체</td><td>Millipore</td><td>AB1543P</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 당나귀 항토끼 IgG&nbsp; &nbsp; 항체</td><td>분자 프로브</td><td>A-21206</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 당나귀 안티-토끼 IgG&nbsp; &nbsp; 항체</td><td>분자 프로브</td><td>A-21207</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 당나귀 안티-양 IgG&nbsp; &nbsp; 항체</td><td>분자 프로브</td><td>A-11015</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 당나귀 안티-양 IgG&nbsp; &nbsp; 항체</td><td>분자 프로브</td><td>A-11016</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 당나귀 안티-마우스 IgG&nbsp; &nbsp; 항체</td><td>Molecular Probes</td><td>A-21203</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue solution (0.4% (wt/vol))</td><td>Biowhittaker</td><td>17-942E</td><td></td></tr><tr><td>Stereo</td><td>Microscope Carl Zeiss</td><td>Stemi 2000-C</td><td></td></tr><tr><td>Inverted phase contrast microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>Axiovert 40 C</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Forceps</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>May-45</td><td></td></tr><tr><td>Cover Slip Govern Follows &ndash; Dumoxel</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11251-33</td><td></td></tr><tr><td>두 개의 Dumont #45 펜치 &ndash; Dumoxel</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11245-30</td><td></td></tr><tr><td>블레이드 홀더/브레이커 플랫 그립 - 11cm</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>10052-11</td><td></td></tr><tr><td>학생 아이리스 가위 - 스트레이트 11.5 cm</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>광섬유 할로겐 조명기</td><td>Nikon</td><td>MKII</td><td></td></tr><tr><td>일회용 붕규산 유리 파스퇴르 피펫</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>혈구계</td><td>Proscitech</td><td>SVZ2NIOU</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &마이크로; m 멸균 필터 유닛</td><td>Nalgene</td><td>NL-CE-156-4020</td><td></td></tr><tr><td>100x20 mm 페트리 접시</td><td>BD Biosciences</td><td>351005</td><td></td></tr><tr><td>라운드 커버 슬립 #1 두께 독일 유리 12 mm</td><td>Bellco 유리</td><td>1943-10012&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

배아 쥐의 뇌에서 차 중뇌 도파민 신경 세포의 분리, 문화 및 장기 유지 보수

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

mesDA(mesDA) 뉴런의 퇴화는 파킨슨병 장애의 병리학적 특징입니다. 생리적 기능과 이러한 뉴런의 취약성 및 죽음과 관련된 생물학적 과정에 대한 연구는 근본적인 원인을 이해하고 이 일반적인 신경 퇴행성 질환의 치료법을 밝히는 데 필수적입니다. mesDA 뉴런의 1차 배양은 질병 진행 중 이러한 뉴런의 발달, 장기 생존 및 퇴화를 이해하기 위해 분자, 생화학 및 전기 생리학적 특성을 조사할 수 있는 도구를 제공합니다. 여기에서는 E12.5 마우스(또는 E14.5 마우스) 배아에서 중뇌 도파민 뉴런의 분리, 배양 및 유지를 위한 자세한 방법을 제시합니다. 이 프로토콜에서 최적화된 세포 배양 조건은 축삭 및 수지상 돌기, 시냅스 연결 및 기타 뉴런 형태학적 특성의 존재를 초래하여 배양을 이 뉴런 집단의 생리학적, 세포적, 생물학적 및 분자적 특성 연구에 적합하게 만듭니다.

티로신 수산화 효소 (목)에 대한 면역 조직 문화에 세포의 0.5 % 사이가 도파민 것을 보여준다. 티로신 하이드 록 (TH)와 미세 소관 관련 단백질 2 (Map2에) 항체 (그림 3)를 사용하여, 신경 돌기 도금 후 2 시간 이내에 나타나며 첫 날에 의해, 축삭과 수상 돌기는 구별 (그림 2)입니다. 뉴런은 6 주 이상 생존과 광범위한 가지를 보여줍니다. 이전에 나타낸 바와 같이 문화 뉴런 신경교 비 직접 혈청 배지에서의 농도와 관련된다. 비교적 순수한 연결을 문화를 얻을 수있는 문화에서 FBS를 제거하는 동안, 우리와 다른 혈청 또한 문화 9 도파민 신경 세포의 생존을 증가 시킨다는 것을 발견했다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52475/52475fig1.jpg" /> <st...

파킨슨병 동안 중뇌 도파민성 뉴런의 퇴화 원인은 완전히 이해되지 않았습니다. 세포 배양 시스템은 이러한 뉴런의 신경 생리학적 특성을 연구하는 데 필수적인 도구를 제공합니다. 여기에서는 신경퇴행의 체외 모델링에 활용할 수 있는 최적화된 프로토콜을 제시합니다.

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

본 절차의 목적은 설치류의 복측 중뇌로부터 일차 뉴런을 효율적으로 분리하고 배양하는 것입니다. 이는 먼저 설치류 배아의 중뇌를 해부함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 복측 중뇌를 정밀하게 분리하는 것입니다.다음으로, 신경 조직을 해리하여 단일 세포 현탁액을 얻어야 합니다. 마지막 단계는 일차 뉴런을 적은 부피로 커버슬립에 도말한 후, 나중에 부착된 세포들을 24웰 플레이트로 옮기는 것입니다. 최종적으로, 항체와 면역형광 현미경법을 사용하여 배양액 내의 도파민성 뉴런을 식별합니다.중뇌의 도파민성 뉴런은 인지 과정에서의 운동 및 감정 조절과 뇌의 보상 분비 등 여러 기능에 관여합니다. 또한 이러한 뉴런은 파킨슨병, 중독, 조현병을 포함한 신경학적 및 신경정신과적 질환과도 연관되어 있습니다. 복측 중뇌를 복구하는 방법입니다.신경세포 배양은 도파민성 신경세포의 생리학적 및 세포적 특성을 연구할 뿐만 아니라, 파킨슨병과 같은 질환 과정에서 발생하는 이들의 퇴행 원인을 이해하는 데 활용될 수 있습니다. 먼저, 커버슬립을 준비하십시오.70% ethanol에서 최소 30분 동안 끓여 그리스의 흔적을 모두 제거합니다. 그다음 커버슬립을 오토클레이브로 멸균합니다. 커버슬립을 24웰 플레이트로 옮기고 각 웰에 polyol all athene 0.5 mL를 추가합니다.플레이트를 실온에서 1시간 동안 배양하십시오. 폴리올 워킹 솔루션 또는 Athene 솔루션의 유효 기간은 한 달임을 유의하십시오. 그다음 커버슬립을 회당 0.5 mL의 물로 3회 세척하십시오.세 차례의 세척 과정을 모두 거치지 않으면 배양된 세포가 24시간 동안 생존할 수 없습니다. 다음으로, laminin 용액을 준비하십시오. 먼저 얼음 위에서 천천히 해동해야 합니다.그런 다음 차가운 D-M-E-M-F 12에 라미닌을 녹여 즉시 사용하십시오. 이제 각 웰에 갓 제조한 라미닌 작업 용액 0.5 mL를 넣고 플레이트를 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 마지막으로, 유리 피펫을 준비할 때 팁을 원래 크기의 절반으로 연마합니다.복부 절개를 통해 자궁낭을 노출시킨 후, 핀셋을 사용하여 자궁을 절단하여 분리합니다. 분리한 자궁을 100 mm 디쉬에 담긴 얼음처럼 차가운 HBSS로 옮기고, 핀셋으로 배아를 제거하기 시작합니다. 분리된 배아를 차가운 HBSS가 담긴 새 디쉬로 옮깁니다.이제 해부 현미경 아래에서 10배 배율로 복측 중뇌의 해당 부위에 접근할 준비를 합니다. 바이오 가위나 포셉을 사용하여 등쪽뇌교(isthmus)와 중뇌-전뇌 경계 부위에서 뇌를 절개하여 중뇌와 머리궁(cephalic arch)을 분리합니다. 중뇌 전체를 적출한 후, 내측 등쪽 중뇌를 절개합니다.포셉을 사용하여 뇌수막을 제거합니다. 이 단계는 신경세포 배양의 성공을 위해 매우 중요합니다. 비신경세포는 배양 조건 하에서 사멸하며, 이는 인접한 신경세포에 부정적인 신호를 줄 수 있습니다.이제 중뇌 조직을 나비 모양으로 폅니다. 멸균된 칼날로 각 날개 부분의 약 절반을 잘라내어 복측 중뇌만 남깁니다. 복측 중뇌를 15 milliliter 원심분리관(conical tube)에 담긴 차가운 HBSS로 옮깁니다.그런 다음 한 시간 이내에 가능한 한 많은 배아를 다음 배아 해부 과정으로 진행하십시오. 한 시간 이상 얼음 위에 보관된 배아는 세포 생존율이 떨어집니다. 도파민성 뉴런의 높은 생존율을 보장하려면 해부부터 플레이팅까지의 시간이 한 시간을 초과하지 않아야 합니다.또한, 덮개 아래에서 뉴런이 생존하기 위해서는 뇌수막을 제거하는 것이 매우 중요합니다. 복측 중뇌 수집물에서 HBSS를 제거하십시오. 그 다음, 조직 12조각에 충분한 양인 0.05% trypsin A DTA 따뜻한 용액 1ml를 추가하십시오.조직을 37 °C에서 5~10분 동안 배양합니다. 후드 내에서 tripsin A DTA를 1 mL의 불활성화 배지로 교체합니다. 가볍게 흔들어 섞어준 후, 해리된 세포가 함께 버려지지 않도록 배지를 적당량 남기고 불활성화 배지를 제거합니다.다음으로, 세포가 소실되지 않도록 완전 배지로 조직을 두 번 세척하십시오. 이제 완전 배지 1 mL를 첨가합니다. 그런 다음 기포가 생기지 않도록 화염 연마된 피펫으로 조직을 분쇄하여 단일 세포 현탁액을 얻을 때까지 반복합니다.약 8~10회 정도 계대 배양하면 충분합니다. 해당 시간이 지난 후, 세포를 400 Gs에서 5분 동안 원심 분리합니다. 배지를 제거하고 1 mL의 완전 배지로 세포를 재부유시킵니다.세포 부유액을 만들기 위해 피펫팅을 4회까지 반복합니다. 헤모사이토미터를 이용한 트리판 블루 염색법(trypan blue exclusion)으로 부유액 내 세포 수를 측정하고 세포 상태를 평가하는 것부터 시작하십시오.이제 세포 현탁액을 microliter당 1500 cells로 조정합니다. 그런 다음 멸균된 마이크로 원심분리 튜브 캡을 100 millimeter 디쉬로 옮깁니다. 핀셋을 사용하여 준비된 커버슬립을 캡 위에 올립니다.커버슬립을 세척하지 말고 건조되지 않도록 주의하십시오. 각 커버슬립에 현탁액 100 µL를 분주합니다. 이 다소 이례적인 방법은 90%의 배양 생존율을 제공하며, 성공을 위한 결정적인 단계입니다.그런 다음 페트리 접시를 닫고 인큐베이터로 옮겨 1시간 동안 배양합니다. 배양 후, 배지가 포함된 커버슬립을 각 웰에 37 °C로 데운 완전 배지 400 µL가 들어 있는 24웰 플레이트로 조심스럽게 옮긴 다음, 세포를 하룻밤 동안 배양합니다. 처음 몇 시간이 24시간 이내의 세포 생존에 가장 결정적입니다. 각 웰에 완전 배지 0.5 mL를 조심스럽게 추가합니다.2주마다 배지의 절반을 교체하십시오. 배지 색상이 노란색으로 변하면 배지 절반 교체를 더 일찍 수행할 수 있으나, 교체 횟수는 여전히 적게 유지해야 합니다.도파민성 뉴런은 이러한 조건에서 6주 이상 생존합니다. 배양 2주 후, tyrosine hydroxylase 및 뉴런 마커에 대한 면역조직화학 염색 결과 세포의 1%가 도파민성 뉴런임을 보여줍니다. 뉴런 돌기(Neuronal projections)는 플레이팅 후 2시간 이내에 나타납니다.배양 첫째 날이 끝날 무렵이면 축삭과 수지상돌기를 구별할 수 있습니다. 결과적으로, 이 절차를 거친 뉴런은 6주 이상 생존하며 광범위한 성장을 보입니다. 도파민성 뉴런의 기전적 질문에 답하기 위해 바이러스 형질도입, 면역형광법 또는 전기생리학과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

기본 dissociated midbrain의 도파민 세포 문화는 도파민 뉴런의 presynaptic 특성의 연구 수 있습니다. 그들은 실시간 도파민 릴리스 속도론 및 단백질 / mRNA 도파민 exocytosis의 규제 수준을 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다. 여기, 우리는 당신이 쥐 neonates에서 이러한 문화를 생성하는 방법을 보여줍니다.

쥐 Neonates에서 기본 Dissociated Midbrain의 도파민 세포 문화

우리는 고도로 피더 glial 세포 레이어를 사용하지 않고 태아 쥐 두뇌의 hippocampal 뉴런을 정화의 문화에 대한 프로토콜을 제공합니다.

태아 쥐의 Hippocampal 신경 세포의 분리 및 문화

두뇌의 세포 이질에서 기본 microglia를 분리하는 것은 생리적 및 병리 학적 조건에 모두 자신의 역할을 조사하는 것이 필수적이다. 이 프로토콜은 기계적인 고립과 높은 수율과 높은 순도를 제공 혼합 세포 배양 기술에 대한 실용적 기본 microglial 세포에 대해...

신생아 쥐 뇌 조직의 혼합 Glial 세포 배양의 기본 Microglia 격리

우리는 쥐 배아에서 hippocampal과 대뇌 피질의 신경 세포를 분리하고 문화에 빠른 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 우리가 거​​의 순수의 연결을 문화가 요구되는 실험을 수행할 수 있습니다.

쥐 배아 신경 세포의 분리 및 문화 : 빠른 프로토콜

이 비디오는 쥐의 배아 뇌 조직에서 도파민 뉴런을 배양하는 방법을 간략하게 설명합니다. 이 과정에는 단백질 분해 효소로 중뇌를 치료하고, 세포를 분리하고, 세포의 성장과 장기적인 생존을 위해 항생제가 함유된 영양이 풍부한 배지의 폴리머 코팅된 커버슬립에서 배양하는 것이 포함됩니다.

Culturing and Maintaining Dopaminergic Neurons from Mouse Embryonic Brain Tissue

이 비디오는 형질전환 마우스 배아에서 안구 운동, 대구 신경 및 척추 운동 뉴런을 분리하는 것을 보여줍니다. 배아는 쉽게 시각화하고 식별할 수 있도록 녹색 형광 단백질(GFP)로 표지된 운동 뉴런을 발현합니다. 운동 뉴런은 형광 현미경으로 외과적으로 분리되고 배양 배지에서 유지됩니다.

Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from a Mouse Embryo(쥐 배아에서 눈동자, 트로클리어, 척추 운동 뉴런의 분리와 배양)

이 비디오는 마우스 배아의 중뇌에서 도파민 뉴런을 분리하고 배양하는 과정을 보여줍니다. 고립된 복부 중뇌 바닥은 효소를 사용하여 해리됩니다. 생성된 도파민 뉴런은 수확되어 다중 웰 플레이트 내부의 마이크로 섬으로 전달됩니다. 세포는 마이크로 아일랜드 내부의 고밀도로 세포를 유지하기 위해 도파민 뉴런 배지로 배양됩니다.

1차 배아 마우스 중뇌 도파민 뉴런의 분리 및 배양

도파민 뉴런은 뇌에서 중요한 조절 역할을 합니다. 그들의 손실은 파킨슨병과 관련이 있습니다. 이 비디오에서는 배아 마우스 중뇌에서 중심 도파민 뉴런의 1차 배양을 생성하는 방법을 보여줍니다. 이러한 배양은 다양한 스트레스에 대한 이러한 뉴런의 극도의 취약성을 연구하는 데 유용합니다.

마우스 도파민 뉴런의 차 문화

세부 사항에 microglial 함수를 이해 하는 노력 microglia 성숙한 vivo에서 속성 정리 microglial 문화 모델의 부족에 의해 방해 되어 있다. 이 프로토콜 정의 매체 조건 하에서 높은 없는 성숙한 쥐 microglia의 강력한 생존을 유지 하기 위해 설계 된 절연과 문화 접근을 설명 합니다.

절연 및 동적 홍보 설치류 Microglia의 문화 Ramified 혈 청 자유로운 매체에 있는 외관

생체 외에서 가능한 한 적절 하 게 생체 외 조건에서 반영 하는 실험을 실시 하는 것은 쉬운 일이 아니다. 1 차적인 세포 배양물의 사용은 전체 유기체에 있는 세포 생물학을 이해하는 쪽으로 중요한 단계입니다. 제공된 프로토콜은 배아 마우스 소뇌 뉴런을 성공적으로 성장시키고 배양하는 방법을 간략하게 설명한다.

배아 마우스 소뇌에서 분리 된 뉴런의 기본 문화

바로 사용할 수있는 냉동 뉴런은 시냅스 기능을 평가하기위한 강력한 도구입니다. 여기에서는 96웰 플레이트를 사용하여 냉동 재고에서 쉽게 추출한 저밀도 1차 배양을 소개합니다.

배아 해마 뉴런의 냉동 재고를 사용한 쉽고 재현 가능한 저밀도 1차 배양

배우세요 배아 쥐 뇌 중뇌 도파민 신경 세포 분리 및 장기 배양 프로토콜입니다. 면역형광 현미경으로 신경 세포를 식별하며 파킨슨병 신경퇴행 연구에 활용할 수 있습니다.

배아 쥐의 뇌에서 차 중뇌 도파민 신경 세포의 분리, 문화 및 장기 유지 보수

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