배아 쥐의 뇌에서 차 중뇌 도파민 신경 세포의 분리, 문화 및 장기 유지 보수

이 절차의 목표는 설치류의 복부 중뇌에서 일차 뉴런을 효율적으로 분리하고 배양하는 것입니다. 이것은 먼저 설치류 배아의 중뇌를 해부함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 복부 중뇌를 조심스럽게 분리하는 것입니다.

다음으로, 신경 조직을 해리하여 단일 세포 현탁액을 생성해야 합니다. 마지막 단계는 부착된 세포를 24웰 플레이트로 늦게 옮기기 전에 커버 슬립의 작은 부피로 1차 뉴런을 플레이트하는 것입니다. 궁극적으로 항체 및 면역형광 현미경 검사는 배양 내 도파민 뉴런을 식별하는 데 사용됩니다.

중뇌의 도파민 뉴런은 인지에서 움직임과 감정을 조절하고 뇌의 보상 분비를 포함한 여러 기능에 관여합니다. 그들은 또한 파킨슨병, 중독 및 정신 분열증을 포함한 신경 및 신경 정신 질환과 관련이 있습니다. 복부 중뇌를 복구하는 방법.

뉴런 배양은 도파민 뉴런의 생리학 및 세포 특성을 연구하고 변성의 원인을 이해하는 데 사용할 수 있습니다. 파킨슨병과 같은 질환이 진행되는 동안. 먼저 커버 슬립을 준비합니다.

70% 에탄올에 최소 30분 동안 끓여서 기름기의 흔적을 제거하십시오. 그런 다음 커버 슬립을 오토클레이브합니다. 커버 슬립을 24개의 웰 플레이트로 옮기고 각각에 아테네의 폴리올 반 밀리리터를 추가합니다.

음, 플레이트를 실온에서 한 시간 동안 배양하십시오. 작업 폴리올 또는 아테네 용액의 유통 기한은 1개월입니다. 그런 다음 세탁 당 반 밀리리터의 물로 커버 슬립을 세 번 세탁하십시오.

세 번의 세척이 모두 없으면 배양된 세포는 24시간 동안 생존하지 못합니다. 다음으로 라미닌 용액을 수리합니다. 먼저 얼음에서 천천히 해동하십시오.

그런 다음 라미닌을 차가운 D-M-E-M-F 12에 녹여 즉시 사용하십시오. 이제 갓 만든 작업 라미닌 용액을 반 밀리리터씩 각 웰에 넣고 플레이트를 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다. 마지막으로, 유리 피펫을 준비 할 때 팁을 정상 크기의 절반으로 연마합니다.

복부 절개 cision을 만들어 자궁낭을 드러내고 집게를 사용하여 자궁을 잘라냅니다. 100mm 접시에 담아 자궁을 얼음처럼 차가운 HBSS로 옮기고 집게로 배아를 제거하기 시작합니다. 분리된 배아를 차가운 HBSS의 새 접시로 옮깁니다.

이제 해부 현미경으로 10배 배율로 복부 중뇌의 이 위치에 접근할 준비를 합니다. 바이오 가위 또는 집게를 사용하여 협부와 meas 및 cephalic di cephalic boundary region에서 뇌를 절단하여 meas와 cephalic arch를 절개합니다. 전체 중뇌를 제거한 후 내측 등쪽 중뇌를 절개합니다.

겸자를 사용하여 수막을 제거합니다. 이 단계는 뉴런 배양 성공에 매우 중요합니다. 비뉴런 세포는 배양 및 조건에서 죽고 이웃 뉴런에 부정적인 신호를 보냅니다.

이제 중뇌 조직을 나비 모양으로 평평하게 만듭니다. 복부 중뇌를 떠나는 멸균 칼날로 각 날개의 약 절반을 잘라냅니다. 복부 중뇌를 15ml 원뿔형 튜브에 담긴 얼음처럼 차가운 HBSS로 이식합니다.

그런 다음 한 시간 이내에 가능한 한 많은 배아를 해부합니다. 한 시간 이상 얼음 위에 보관된 배아는 세포 생존력이 떨어집니다. 도파민 뉴런의 높은 생존력을 보장하기 위해 해부부터 도금까지의 시간이 1시간을 초과해서는 안 됩니다.

또한, 수막을 제거하는 것은 후드 아래의 뉴런의 생존에 매우 중요합니다. 복부 중뇌 컬렉션에서 HBSS를 제거합니다. 그런 다음 A DTA에 따뜻한 0.05% 트립스 밀리리터를 첨가하면 조직 12개에 충분한 용액을 넣을 수 있습니다.

조직을 섭씨 37도에서 5-10분 동안 배양합니다. 후드 아래에서 트립 A DTA를 1밀리리터의 비활성화로 교체합니다. 매체는 부드럽게 팽창하여 혼합된 다음 비활성화 매체를 제거하지만 해리된 세포가 버려지지 않도록 충분한 배지를 남겨 둡니다.

다음으로, 세포를 잃지 않고 완전한 매체로 조직을 두 번 씻으십시오. 이제 1ml의 완전한 매체를 추가합니다. 그런 다음 단일 세포 현탁액이 얻어질 때까지 기포를 형성하지 않고 화염 연마 피펫으로 조직을 분쇄합니다.

약 8-10개의 패스로 충분합니다. 지속 시간이 끝나면 400G의 세포를 5분 동안 원심분리합니다. 배지를 제거하고 1ml의 완전한 배지에 세포를 재현탁합니다.

현탁액을 얻기 위해 세포를 최대 4회 피펫팅합니다. 현탁액에 있는 세포의 건강 상태를 세고 평가하는 것으로 시작합니다. 혈구 분석기와 함께 triam blue exclusion 사용.

이제 셀 현탁액을 마이크로리터당 1500 셀로 조정합니다. 그런 다음 멸균된 마이크로 원심분리기 튜브 캡을 100mm 접시에 옮깁니다. 준비된 커버 슬립을 집게를 사용하여 캡에 놓습니다.

커버 슬립을 세척하지 말고 건조시키지 마십시오. 각 커버 슬립에 100마이크로리터의 서스펜션을 로드합니다. 이 다소 특이한 방법은 90%의 배양 생존력을 제공하며 성공을 위한 중요한 단계입니다.

그런 다음 페트리 접시를 닫고 배양 후 한 시간 동안 인큐베이터로 옮기고 각 웰에서 섭씨 37도까지 따뜻한 400 마이크로 리터의 완전한 배지를 포함하는 매체에서 24 웰 플레이트로 커버 슬립을 조심스럽게 옮긴 다음 밤새 세포를 배양합니다. 처음 몇 시간은 24시간 이내에 세포가 생존하는 데 가장 중요합니다. 각 웰에 반 밀리리터의 완전한 배지를 부드럽게 첨가합니다.

2주마다. 미디어의 절반을 변경합니다. 배양권이 노란색으로 바뀌면 절반 미디어 변경을 더 빨리 수행할 수 있지만 변경은 여전히 드물어야 합니다.

도파민 뉴런은 이러한 조건에서 6주 이상 생존한다. 2주간의 배양 후 티로신, 하이드록실라제 및 신경 마커에 대한 면역조직화학은 세포의 1%가 도파민성임을 보여줍니다. 신경 세포 돌기는 도금 후 2시간 이내에 나타납니다.

문화에서 첫날이 끝날 때쯤이면 축삭돌기와 수상돌기를 구별할 수 있습니다. 궁극적으로 뉴런은 6주 이상 생존하고 이 절차에 따라 광범위한 성장을 보입니다. 도파민 뉴런의 기계론적 질문에 답하기 위해 바이러스 형질전환, 면역 형광 또는 전기생리학과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.