배아 쥐의 뇌에서 차 중뇌 도파민 신경 세포의 분리, 문화 및 장기 유지 보수

본 절차의 목적은 설치류의 복측 중뇌로부터 일차 뉴런을 효율적으로 분리하고 배양하는 것입니다. 이는 먼저 설치류 배아의 중뇌를 해부함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 복측 중뇌를 정밀하게 분리하는 것입니다.

다음으로, 신경 조직을 해리하여 단일 세포 현탁액을 얻어야 합니다. 마지막 단계는 일차 뉴런을 적은 부피로 커버슬립에 도말한 후, 나중에 부착된 세포들을 24웰 플레이트로 옮기는 것입니다. 최종적으로, 항체와 면역형광 현미경법을 사용하여 배양액 내의 도파민성 뉴런을 식별합니다.

중뇌의 도파민성 뉴런은 인지 과정에서의 운동 및 감정 조절과 뇌의 보상 분비 등 여러 기능에 관여합니다. 또한 이러한 뉴런은 파킨슨병, 중독, 조현병을 포함한 신경학적 및 신경정신과적 질환과도 연관되어 있습니다. 복측 중뇌를 복구하는 방법입니다.

신경세포 배양은 도파민성 신경세포의 생리학적 및 세포적 특성을 연구할 뿐만 아니라, 파킨슨병과 같은 질환 과정에서 발생하는 이들의 퇴행 원인을 이해하는 데 활용될 수 있습니다. 먼저, 커버슬립을 준비하십시오.

70% ethanol에서 최소 30분 동안 끓여 그리스의 흔적을 모두 제거합니다. 그다음 커버슬립을 오토클레이브로 멸균합니다. 커버슬립을 24웰 플레이트로 옮기고 각 웰에 polyol all athene 0.5 mL를 추가합니다.

플레이트를 실온에서 1시간 동안 배양하십시오. 폴리올 워킹 솔루션 또는 Athene 솔루션의 유효 기간은 한 달임을 유의하십시오. 그다음 커버슬립을 회당 0.5 mL의 물로 3회 세척하십시오.

세 차례의 세척 과정을 모두 거치지 않으면 배양된 세포가 24시간 동안 생존할 수 없습니다. 다음으로, laminin 용액을 준비하십시오. 먼저 얼음 위에서 천천히 해동해야 합니다.

그런 다음 차가운 D-M-E-M-F 12에 라미닌을 녹여 즉시 사용하십시오. 이제 각 웰에 갓 제조한 라미닌 작업 용액 0.5 mL를 넣고 플레이트를 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 마지막으로, 유리 피펫을 준비할 때 팁을 원래 크기의 절반으로 연마합니다.

복부 절개를 통해 자궁낭을 노출시킨 후, 핀셋을 사용하여 자궁을 절단하여 분리합니다. 분리한 자궁을 100 mm 디쉬에 담긴 얼음처럼 차가운 HBSS로 옮기고, 핀셋으로 배아를 제거하기 시작합니다. 분리된 배아를 차가운 HBSS가 담긴 새 디쉬로 옮깁니다.

이제 해부 현미경 아래에서 10배 배율로 복측 중뇌의 해당 부위에 접근할 준비를 합니다. 바이오 가위나 포셉을 사용하여 등쪽뇌교(isthmus)와 중뇌-전뇌 경계 부위에서 뇌를 절개하여 중뇌와 머리궁(cephalic arch)을 분리합니다. 중뇌 전체를 적출한 후, 내측 등쪽 중뇌를 절개합니다.

포셉을 사용하여 뇌수막을 제거합니다. 이 단계는 신경세포 배양의 성공을 위해 매우 중요합니다. 비신경세포는 배양 조건 하에서 사멸하며, 이는 인접한 신경세포에 부정적인 신호를 줄 수 있습니다.

이제 중뇌 조직을 나비 모양으로 폅니다. 멸균된 칼날로 각 날개 부분의 약 절반을 잘라내어 복측 중뇌만 남깁니다. 복측 중뇌를 15 milliliter 원심분리관(conical tube)에 담긴 차가운 HBSS로 옮깁니다.

그런 다음 한 시간 이내에 가능한 한 많은 배아를 다음 배아 해부 과정으로 진행하십시오. 한 시간 이상 얼음 위에 보관된 배아는 세포 생존율이 떨어집니다. 도파민성 뉴런의 높은 생존율을 보장하려면 해부부터 플레이팅까지의 시간이 한 시간을 초과하지 않아야 합니다.

또한, 덮개 아래에서 뉴런이 생존하기 위해서는 뇌수막을 제거하는 것이 매우 중요합니다. 복측 중뇌 수집물에서 HBSS를 제거하십시오. 그 다음, 조직 12조각에 충분한 양인 0.05% trypsin A DTA 따뜻한 용액 1ml를 추가하십시오.

조직을 37 °C에서 5~10분 동안 배양합니다. 후드 내에서 tripsin A DTA를 1 mL의 불활성화 배지로 교체합니다. 가볍게 흔들어 섞어준 후, 해리된 세포가 함께 버려지지 않도록 배지를 적당량 남기고 불활성화 배지를 제거합니다.

다음으로, 세포가 소실되지 않도록 완전 배지로 조직을 두 번 세척하십시오. 이제 완전 배지 1 mL를 첨가합니다. 그런 다음 기포가 생기지 않도록 화염 연마된 피펫으로 조직을 분쇄하여 단일 세포 현탁액을 얻을 때까지 반복합니다.

약 8~10회 정도 계대 배양하면 충분합니다. 해당 시간이 지난 후, 세포를 400 Gs에서 5분 동안 원심 분리합니다. 배지를 제거하고 1 mL의 완전 배지로 세포를 재부유시킵니다.

세포 부유액을 만들기 위해 피펫팅을 4회까지 반복합니다. 헤모사이토미터를 이용한 트리판 블루 염색법(trypan blue exclusion)으로 부유액 내 세포 수를 측정하고 세포 상태를 평가하는 것부터 시작하십시오.

이제 세포 현탁액을 microliter당 1500 cells로 조정합니다. 그런 다음 멸균된 마이크로 원심분리 튜브 캡을 100 millimeter 디쉬로 옮깁니다. 핀셋을 사용하여 준비된 커버슬립을 캡 위에 올립니다.

커버슬립을 세척하지 말고 건조되지 않도록 주의하십시오. 각 커버슬립에 현탁액 100 µL를 분주합니다. 이 다소 이례적인 방법은 90%의 배양 생존율을 제공하며, 성공을 위한 결정적인 단계입니다.

그런 다음 페트리 접시를 닫고 인큐베이터로 옮겨 1시간 동안 배양합니다. 배양 후, 배지가 포함된 커버슬립을 각 웰에 37 °C로 데운 완전 배지 400 µL가 들어 있는 24웰 플레이트로 조심스럽게 옮긴 다음, 세포를 하룻밤 동안 배양합니다. 처음 몇 시간이 24시간 이내의 세포 생존에 가장 결정적입니다. 각 웰에 완전 배지 0.5 mL를 조심스럽게 추가합니다.

2주마다 배지의 절반을 교체하십시오. 배지 색상이 노란색으로 변하면 배지 절반 교체를 더 일찍 수행할 수 있으나, 교체 횟수는 여전히 적게 유지해야 합니다.

도파민성 뉴런은 이러한 조건에서 6주 이상 생존합니다. 배양 2주 후, tyrosine hydroxylase 및 뉴런 마커에 대한 면역조직화학 염색 결과 세포의 1%가 도파민성 뉴런임을 보여줍니다. 뉴런 돌기(Neuronal projections)는 플레이팅 후 2시간 이내에 나타납니다.

배양 첫째 날이 끝날 무렵이면 축삭과 수지상돌기를 구별할 수 있습니다. 결과적으로, 이 절차를 거친 뉴런은 6주 이상 생존하며 광범위한 성장을 보입니다. 도파민성 뉴런의 기전적 질문에 답하기 위해 바이러스 형질도입, 면역형광법 또는 전기생리학과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.