흐름에서 백혈구의 모집에 기질 세포의 영향 분석

본 절차의 전반적인 목적은 조직 상주 세포가 염증 발생 시 백혈구 보충을 지원하는 혈관 내피 세포의 능력에 어떤 영향을 미치는지 조사하는 것입니다. 이를 위해 먼저 두 가지 인 비트로(in vitro) 혈관 모델인 마이크로슬라이드 모델과 필터 모델 중 하나를 사용하여 내피 세포와 중간엽 줄기 세포의 공동 배양을 설정합니다. 이후 흐름 분석법(flow assay)을 수행하기 전에 이러한 배양 세포에 사이토카인을 처리합니다.

그 다음, 사용되는 모델 시스템에 따라 수정 사항을 적용하여 유동 기반 접착 시스템을 단계별로 조립합니다. 마지막 단계는 내피세포 위로 백혈구를 관류시켜 유동으로부터의 모집과 그 이후의 거동을 관찰하는 것입니다. 궁극적으로, 이러한 다세포 유동 기반 접착 분석은 중간엽 줄기세포와 내피세포 간의 상호작용이 염증 발생 시 호중구 모집을 억제한다는 것을 보여주었습니다.

이 방법은 조직 상주 세포(예: 중간엽 줄기세포)가 백혈구 이동 과정을 어떻게 조절하는가, 만성 염증이나 암과 같은 질환에서 이러한 변화가 일어나는가와 같이 백혈구 이동 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 또한, 이러한 지식을 활용하여 새로운 치료 전략을 개발할 수 있을 것입니다. 시작하려면, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 마이크로 슬라이드 모델 또는 필터 모델을 사용하여 중간엽 줄기세포와 혈관 내피세포의 공배양 시스템을 구축하고 유동 시스템을 조립하십시오.

먼저 히터를 켜고 37 °C로 설정합니다. 그런 다음 플런저를 제거한 20 mL 시린지와 5 mL 시린지를 3방향 밸브(three-way tap)에 연결합니다. 다음으로 밸브와 3방향 밸브 사이의 거리와 거의 일치하도록 2.4 mm 튜브를 길게 측정하여 자릅니다.

1.3 millimeter 튜브를 8~10 millimeter 길이로 자른 후, 이를 굵은 튜브의 한쪽 끝에 삽입합니다. 굵은 튜브 쪽을 3방향 탭(three-way tap)에 부착하고 가는 튜브 끝을 전자식 3방향 마이크로 밸브의 포트에 연결하여 세척 리저버를 구성합니다.

그 다음, 마이크로포어 테이프를 사용하여 탭을 퍼스펙스 챔버에 부착합니다. 이어서, 6~8 mm 길이의 굵은 튜브와 가는 튜브 조각을 준비하고, 가는 튜브를 굵은 튜브의 한쪽 끝에 삽입합니다. 플런저를 제거한 2 mL 주사기에 굵은 튜브 끝부분을 연결합니다.

이제 2mL 주사기의 얇은 튜브 끝을 전자 마이크로 밸브의 포트에 연결하여 샘플 저장소를 만듭니다. 다음으로 마이크로 밸브와 현미경 스테이지 중심 사이의 거리만큼 긴 얇은 튜브를 측정하여 자릅니다. 마이크로 슬라이드 모델의 경우, 얇은 튜브 끝에 8~10mm 길이의 굵은 튜브 조각을 부착합니다.

그 다음, 굵은 튜브의 끝에 L자형 커넥터를 연결합니다. 이것은 마이크로 슬라이드 또는 필터 모델에 연결됩니다. 얇은 튜브의 끝에는 8~10mm 길이의 portex blue line manometer 연결 튜브를 부착합니다.

다음으로 얇은 튜브 끝을 마이크로 밸브에 연결합니다. 이 튜브는 세척액 및 시료 저장조의 공통 출력구가 됩니다. 저장조에 소 혈청 알부민이 포함된 인산 완충 식염수를 채웁니다.

PBSA를 흘려보내 튜브 내의 기포를 제거하여 프라이밍한 다음, 마노미터 튜브를 50 milliliter 유리 주사기에 연결합니다. 마이크로 슬라이드 모델의 경우에는 유리 주사기로 이어지는 마노미터 튜브 끝에 10 to 12 millimeter 길이의 두꺼운 튜브 조각만 연결합니다. 두꺼운 튜브의 끝에 L자형 커넥터를 장착합니다.

10 milliliters의 PBSA를 채워 시린지를 프라이밍합니다. 튜빙과 연결된 끝부분이 위를 향하도록 시린지를 뒤집고, 내부의 모든 공기 방울을 밀어낸 후 다시 5 milliliters의 PBSA를 채웁니다. 마지막으로, 주입 및 추출을 위해 유리 시린지를 시린지 펌프에 장착합니다.

유량 설정을 위해 유리 시린지의 리필 속도와 직경을 설정하십시오. 마이크로 슬라이드를 도립 위상차 현미경의 스테이지 위에 놓으십시오. 3방향 콕을 돌려 PBSA가 유입 튜브를 통해 흐르게 하십시오.

L자형 커넥터를 마이크로 슬라이드 채널의 유입구 포트에 연결합니다. 그다음 시린지 펌프의 L자형 커넥터를 채널의 유출구 포트에 연결합니다. 마이크로 슬라이드 위에 떨어진 PBSA를 닦아냅니다.

또는 필터 모델의 경우, 먼저 금속 템플릿을 사용하여 유리 커버스립과 동일한 크기로 파라필름을 자릅니다. 그 다음, 금속 템플릿을 사용하여 파라필름에 20 by 4 mm 크기의 슬롯을 잘라내어 유로(flow channel)를 만듭니다. 파라필름 가스켓을 사용하여 유리 커버스립 위에 유로의 위치를 표시합니다.

6웰 필터의 가장자리를 유리 커버슬립에 맞춥니다. 필터가 유량 채널 표시부를 완전히 덮고 있는지 확인하십시오. 10번 메스를 사용하여 필터를 조심스럽게 잘라냅니다.

다음으로 파라폼 가스켓으로 필터를 조심스럽게 덮고, 유로 슬롯이 필터의 중앙에 오도록 합니다. 깨끗한 티슈를 사용하여 기포를 밀어내어 제거합니다. 이제 커버슬립을 Perspex 유동 챔버 바닥 플레이트의 오목한 부분에 배치합니다.

상단 퍼스펙스 플레이트를 가스켓 위에 놓고 플레이트들을 서로 나사로 고정합니다. 3방향 밸브를 돌려 PBSA 세척 완충액이 밸브를 통해 흐르도록 합니다. 그런 다음 마노미터 튜브를 상단 퍼스펙스 플레이트의 입구 포트에 연결합니다.

기포가 빠져나갈 수 있도록 유로 채널에 PBSA를 흘려줍니다. 그런 다음 시린지 펌프의 압력계 튜브를 퍼스펙스 플레이트의 배출구 포트에 연결합니다. 챔버의 상단 플레이트에 떨어진 PBSA를 닦아냅니다.

마지막으로, 챔버를 도립 위상차 현미경의 스테이지 위에 놓고 초점을 조절하여 필터 위의 혈관 내피 세포를 시각화함으로써 혈관 내피 세포 위로 백혈구를 관류시킵니다. 초점 조절이 완료되면 시린지 펌프를 refill로 설정하고 run을 누릅니다. 혈관 내피 세포 단층을 시각화하려면, 정제된 중성구 2 mL를 샘플 저장조에 넣고 2분 동안 가온합니다.

그런 다음 PBSA로 내피세포를 2분 동안 세척합니다. 밸브를 열어 내피세포 위로 호중구를 관류시킵니다. 호중구 볼루스를 4분 동안 주입합니다.

밸브를 잠그고 실험의 나머지 과정 동안 세척 저장조에서 PBSA를 관류시키십시오. 실험을 수행할 때, 어세이 도중 어느 시점에서도 기포가 통과하지 않도록 주의하십시오. 기포는 내피세포 단층을 파괴하고 부착된 호중구의 탈락을 유발할 수 있습니다. 디지털 이미지 캡처 소프트웨어를 사용하여 호중구 흐름 도중 또는 관류 후에 호중구 모집을 기록하십시오.

유입구 포트에서 대물렌즈를 채널의 가장자리로 이동시켜 포트의 중앙을 확인함으로써 채널의 중심을 식별합니다. 유동 채널 중심부에서 최소 5~10개의 시야를 디지털로 기록하거나, 호중구 흐름 동안 기록합니다. 단일 시야의 이미지를 1분 동안 10초마다 촬영한 후, 채널을 따라 이동하여 다른 시야를 1분 동안 기록합니다.

관류 후 기록을 위해 볼루스 투여 기간 동안 이 과정을 반복하십시오. 백혈구 행동을 평가하기 위해 유동 채널의 중앙을 따라 5~10개의 영역을 10초 동안 기록하십시오. 10초의 간격 동안 1초마다 이미지를 촬영하십시오.

이를 통해 흐름으로부터의 포획 및 부착된 호중구의 행동을 분석하기 위한 충분한 시간을 확보할 수 있습니다. 최소 10개의 이주된 호중구가 포함된 단일 시야를 5분 동안 30초 간격으로 촬영하십시오. 이는 이주된 세포의 속도를 계산하는 데 사용할 수 있으며, 10초 간격의 시야 촬영 시리즈를 추가로 기록하십시오.

이를 통해 호중구가 내피 세포 단층을 통해 이동할 수 있는 시간을 확보합니다. 마지막으로, 시린지 펌프를 정지시키고 배출 튜빙과 유입 튜빙을 순서대로 제거한 다음, 플로우 챔버를 분해하고 샘플 저장조를 PBSA로 헹굽니다. 텍스트 프로토콜에 기술된 백혈구 모집 및 행동 분석을 진행하기 전에, 이후의 필터와 마이크로 슬라이드 채널에 대해 이 과정을 반복합니다. 마이크로 슬라이드 모델에서, tumor necrosis factor alpha를 이용한 사이토카인 자극은 용량 의존적 방식으로 내피 세포에 대한 호중구 부착을 유의하게 증가시켰습니다.

또한, 내피세포 표면에서 롤링하는 호중구의 비율이 TNF alpha 농도에 의존적으로 감소하는 것이 관찰되었습니다. 이는 TNF alpha 농도에 의존적인 증가와 내피세포 단일층을 통해 이동하여 결과적으로 경내피세포 이동(transendothelial migration)을 수행하는 호중구의 비율에서도 반영되었습니다. 필터 기반 유동 분석에서도 유사한 결과가 관찰되었습니다.

예를 들어, TNF alpha 자극은 농도 의존적으로 호중구 접착을 증가시켰습니다. 혈관 내피 세포를 골수 유래 중간엽 줄기세포와 공동 배양했을 때, 내피 세포만 단독으로 배양했을 때보다 호중구 접착이 유의하게 감소했습니다. 이는 마이크로 슬라이드 모델에서 예상된 결과와 같이 단독 배양 시 나타난 현상입니다.

다시 한번, 필터 기반 모델을 사용했을 때도 유사한 효과가 관찰되었으며, 단일 배양에 비해 공동 배양에서 접착이 적게 나타났습니다. 이 영상을 시청한 후에는 염증 발생 시 백혈구의 모집에 영향을 미치기 위해 기질 세포가 혈관 내피 세포와 어떻게 상호작용하는지 조사하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.