Sumoylation과 신진 효모 동원체 단백질 Ndc10과 Ndc80의 유비퀴틴 화를 감지 할 수 있습니다 단백질 정제 기술

이 절차의 전반적인 목표는 신진 효모 운동 핵심 단백질인 NDC 10 및 NDC 80의 시뮬레이션 및 유비퀴틴화를 감지하는 것입니다. 이는 먼저 SMT 3 태그가 지정된 히스 플래그 및 NDC 10 또는 NDC 80 태그가 지정된 MT를 발현하는 효모 세포를 수확하고 이러한 세포에서 단백질 추출물을 만들어 수행됩니다. 두 번째 단계는 합산 검출을 위해 히스 플래그 태그가 지정된 SMT 3개의 접합체를 정제하거나 유비퀴틴화(ubiquitination) 검출을 위해 mik tagg kinetic core 단백질을 면역 침전

그 후, sum ation 또는 ubiquitination은 western blot analysis에 의해 검출됩니다. 궁극적으로 NDC 10 및 NDC 80에 대한 사다리 패턴의 존재는 이러한 단백질이 시뮬레이션되고 유비퀴틴화되었음을 확인합니다. 설명된 단백질 정제 방법을 통해 발아 효모 주머니에서 connico 단백질 ND C 10 및 NDC 80의 시뮬레이션과 유비퀴틴화를 모두 검출할 수 있습니다.

내 cci. 이 기술의 가장 큰 장점은 우리가 만든 균주가 두 개의 에피토프 공격을 가지고 있다는 것인데, 하나는 테스트 단백질에 대한 것이고 다른 하나는 시뮬레이션을 검출할 수 있다는 것입니다. 이러한 태그를 사용하면 다클론 혈청을 사용할 때 자주 관찰되는 교차 반응으로 인한 배경이 줄어듭니다.

이 절차의 시연은 제 연구실의 연구원인 Canero Uni가 수행할 것입니다. 관심 단백질은 이전에 준비된 효모 세포 펠릿에서 추출되어 섭씨 영하 20도에서 보관됩니다. Resus, 0.5 밀리리터의 얼음 냉각 버퍼에 세포를 현탁시킵니다.

추출물이 니켈 니트릴, 트리아세트산 또는 니켈 NTA superflow 비드를 사용하는 풀다운 분석용인 경우 guine buffer를 사용하십시오. 추출물이 면역침전을 위한 경우 buffer A를 사용합니다. 튜브를 항상 얼음 위에 두십시오.

세포 현탁액을 2밀리리터로 옮깁니다. 각 튜브에 캡 2개를 조입니다. 세포 현탁액 비드의 부피와 동일한 유리 구슬 부피를 추가합니다.

미니 비드 비터로 세포를 실온에서 2분 동안 치대고 얼음 위에 튜브를 2-3분 동안 놓습니다. 구슬 치기와 아이싱을 세 번 반복합니다. 30-60분 동안 섭씨 4도에서 빠른 속도로 소용돌이

현미경으로 시각화하여 세포를 확인하여 세포가 용해되었는지 확인합니다. 용해된 세포는 어두운 유령으로 나타나며 경계나 정의된 모양이 없습니다. 최적으로 세포의 80% 이상이 누워있어야 합니다.

그런 다음 푸시 핀을 사용하여 튜브 바닥에 구멍을 뚫습니다. 나사 캡을 느슨하게 끼우고 튜브를 15ml 원추형 튜브에 넣습니다. 1000회 G에서 1분 동안 원심분리기

용해물을 모으기 위하여는, 추출한 단백질을 모으기 위하여 15, 000 시간 G 4 섭씨 온도에 30 분 동안 마이크로 분리기 관 분리기로 용해물을 옮기십시오. 단백질 분석 키트를 사용하여 추출된 단백질의 농도를 측정한 후 각 추출물이 동일한 양의 단백질을 포함하도록 모든 추출물을 정규화합니다. 적절한 버퍼를 사용하여 총 부피를 1ml로 가져옵니다.

총 단백질의 대략 5 밀리그램은 50 OD 600의 세포에서 얻어집니다. 추출된 단백질의 50마이크로리터를 전체 세포 추출물로 저장합니다. 나머지 950마이크로리터의 단백질 추출물은 나중에 단백질 정제 또는 MT 태그 단백질의 면역침전을 위해 사용될 것입니다.

50마이크로리터의 전체 세포 추출물에 50마이크로리터의 2 x laly 샘플 버퍼를 추가합니다. 섭씨 100도의 열 블록에서 샘플을 3-5분 동안 배양한 후 웨스턴 블롯으로 분석합니다. 정제에 필요한 니켈 NTA Superflow 비드를 준비하여 이 절차를 시작합니다.

1분 동안 저속 원심분리에 필요한 비드의 양을 얻습니다. 상층액을 제거하고 PBS로 비드를 세척합니다. PBS 1ml를 넣고 비드가 다시 현탁될 때까지 튜브를 위에서 아래로 뒤집습니다.

저속 원심분리로 비드를 모으고 상등액을 제거합니다. 이런 식으로 구슬을 총 5번 씻습니다. 비드를 1ml의 guine buffer에 현탁시키고 처리할 샘플에 해당하는 튜브 수로 분취합니다.

저속 원심분리로 비드를 모으고 각 샘플의 상등액을 제거합니다. 전체 세포 추출물 950 마이크로 리터를 첨가하십시오. 구슬 100 마이크로 리터에 미리 준비.

섭씨 4도의 흔들 플랫폼에서 최소 4시간 또는 하룻밤 동안 배양합니다. 섭씨 4도에서 1분 동안 800-1500배 G의 원심분리기. 상등액 50마이크로리터를 절약합니다.

이 상층액에 50마이크로리터의 2 x laly 샘플 버퍼를 추가하고 섭씨 100도의 열 블록에서 3-5분 동안 배양합니다.각 샘플의 10마이크로리터는 나중에 웨스턴 블롯으로 분석됩니다. 니켈 NTA superflow 비드를 실온의 흔들 플랫폼에서 1ml의 guine buffer로 5-10분 동안 한 번 세척합니다.

다음으로, 브레이킹 버퍼로 최종 세척한 후 1ml의 브레이킹 버퍼로 비드를 5회 세척하고 90마이크로리터의 2 x laly 샘플 버퍼에 비드를 다시 현탁시킵니다. 니켈 NT에서 그의 태그가 지정된 단백질을 분리하는 데 도움이 되도록 10마이크로리터의 1몰 iole을 추가합니다. 구슬은 섭씨 100도의 열 블록에서 3-5분 동안 배양합니다. 그 때 와류는 13, 30 초 동안 G 시간에 13, 000 시간 분리기를 이용한다.

상층액을 새 튜브로 옮깁니다. 이 절차를 시작하려면 저속 원심분리로 필요한 양의 anti cmic aero affinity gel 항체를 얻습니다. 상등액을 제거하고 완충액 A로 수지를 세척하고 완충액 A를 1ml씩 넣고 수지가 다시 현탁될 때까지 위에서 아래로 뒤집습니다.

저속 원심분리로 수지를 모으고 상등액을 제거합니다. 총 5번 세탁하십시오. 1ml의 버퍼 A에 수지를 현탁시키고 처리할 샘플에 해당하는 튜브 수로 분취합니다.

저속 원심분리로 수지를 모으고 상등액을 제거합니다. 950마이크로리터의 전체 세포 추출물을 25마이크로리터의 수지에 첨가하고 다음 날 섭씨 4도의 흔들리는 플랫폼에서 하룻밤 동안 배양합니다. 섭씨 4도에서 1분 동안 800-1500배 G의 원심분리기.

상등액 50마이크로리터를 절약합니다. 이 상층액에 50마이크로리터의 2 x lamly 샘플 버퍼를 추가하고 섭씨 100도의 가열 블록에서 3-5분 동안 배양합니다. 완충액으로 수지를 씻고 1ml의 완충액을 추가하고 수지가 다시 현탁될 때까지 위에서 아래로 뒤집습니다.

저속 원심분리로 수지를 채취하고 최종 세척에서 상등액을 제거한 후 상층액을 제거합니다. 100마이크로리터의 수메 샘플 버퍼에 수지를 재현탁시키고 섭씨 100도의 열 블록에서 3-5분 동안 배양합니다. 그 때 와류는 13, 30 초 동안 G 시간에 13, 000 시간 분리기를 이용한다.

상층액을 새 튜브로 옮깁니다. 마지막으로 이 프로토콜에서 수집된 모든 샘플을 로드합니다. SDS 페이지에서 웨스턴 블롯 분석용 젤, SMT 3 또는 HF SMT 3 태그가 지정된 폴리 히스타민 플래그와 NDC 80 및 NDC 10 태그가 지정된 MT를 발현하는 효모 균주를 사용하여 kinetico 단백질의 시뮬레이션을 검출했습니다.

HF SMT 3개의 기질은 니켈 비드를 사용하여 친화성 정제되고 Anti-Flag 항체로 검출되었습니다. 합 moated NDC 80은 안티 마이크 항체로 프로브했을 때 HF SMT 3개의 기판에서 검출되었습니다. HF SMT 3이 없는 대조 균주에 변형 단백질이 없다는 것은 HF SMT 3과 표적 단백질 간의 상호 작용의 특이성을 나타냅니다.

또한, NDC 80 및 NDC 10의 유비퀴틴화를 검출하기 위해 NOCO 데솔 처리된 세포에서 NDC 80 및 NDC 10의 합계가 감소합니다. Mick은 ND C 80 또는 ND C 10을 면역 침전시키고 웨스턴 블롯 분석을 수행하여 안티 마이크 및 안티 유비퀴틴 항체를 분석하고, 전체 세포 추출물 및 상등액을 분석하고, NDC 80 M 및 NDC 10 M 면역 침전 샘플의 발현을 확인했으며, 안티 MIC로 프로브한 샘플은 NDC 80 및 NDC 10이 번역 후 변형을 포함함을 시사하는 여러 고분자량 밴드를 보여주었습니다. 항 유비퀴틴으로 조사된 면역 침전 샘플의 래더링 패턴은 ND C 80 및 ND C 10이 유비퀴틴화됨을 보여주었습니다.

NDC 80 및 NDC 10의 래더링 패턴은 프로테아좀 억제제 MG 1 32로 처리함으로써 향상되었습니다. 이것이 폴리 유비퀴틴화(poly ubiquitination)를 나타낸다는 것을 추가로 확인하면 이 비디오를 시청한 후에는 박쥐 NN의 짝짓기 검출 및 백신 접종을 가능하게 하는 단백질 정제 기술에 대해 잘 이해하게 될 것입니다.