Name: Sumoylation과 신진 효모 동원체 단백질 Ndc10과 Ndc80의 유비퀴틴 화를 감지 할 수 있습니다 단백질 정제 기술 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 28 s
Description: 배우세요 Saccharomyces cerevisiae에서 Ndc10과 Ndc80 단백질의 sumoylation 및 ubiquitination을 검출하는 단백질 정제 기술입니다. 이 방법은 키네토코어 단백질의 번역 후 수정을 연구하는 데 활용됩니다.

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지원과 조언을 해주신 Oliver Kerscher 박사님과 논문에 대한 지원과 의견을 주신 Basrai 실험실의 구성원들에게 감사드립니다. 이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 교내 연구 프로그램(Intramural Research Program)의 지원을 받았습니다.

효모 세포의 성장 (1) <ol><li> 작은 플라스크에 YPD (표 1) 30 ㎖에 효모 세포를 접종한다. 진탕 30 ℃에서 밤새 품어. </li><li> YPD 50ml에 600 나노 미터 (600 OD = 0.2)에서 0.2의 광학 밀도로 세포를 희석하고, 진탕하면서 30 ℃에서 배양한다. </li><li> 600 nm의 (OD 600 = 1.0)에서 1.0의 광학 밀도 문화를 성장. </li><li> 원심 분리기 세포 2,000 XG에 5 분 동안 상층 액을 버린다. </li><li> 세포를 세척 2000 XG에서 5 분 동안 40 ml의 멸균 원심에서 세포 펠렛을 재현 탁. 뜨는을 취소하고 -20 ℃에서 세포 펠렛을 저장합니다. </li></ol> 단백질 2. 추출 <ol><li> 또는 니켈의 superflow NTA 비드를 사용 풀다운 분석 용 빙냉 구아니딘 완충액 (표 1) 0.5 ㎖ 중의 재현 탁 세포 면역에 대한 A (표 1) 버퍼. 항상 얼음에 튜브를 유지합니다. </li><li> 2m로 이동L 스크류 캡 튜브. </li><li> 유리 구슬의 동일한 볼륨 (자료 표)를 추가합니다. </li><li> 다음 2 ~ 3 분 동안 얼음에 배치, 실온에서 2 분 동안 미니 비드 비터의 셀 (자료 표)를 구슬은-이겼다. 이 세 번 반복합니다. </li><li> 30 ~ 60 분 동안 4 ℃에서 고속에 소용돌이. 세포가 용해되어 있는지 확인하기 위해 현미경으로 시각화하여 세포를 확인합니다. 참고 : 용균 세포는 어두운 유령을 표시하고 경계 또는 정의 된 모양이 부족합니다. 최적의 셀의 적어도 80 %를 용해한다. </li><li> 15ml의 원뿔형 튜브 (스크류 캡이 느슨 함) 컬렉션에 푸시 핀과 장소를 이용하여 튜브의 바닥에 구멍을 천공. </li><li> 해물를 수집하기 위해 1 분 동안 1,000 XG에 원심 분리기. </li><li> 마이크로 원심 분리기 튜브에 해물을 전송합니다. </li><li> 4 ℃에서 30 분 동안 15,000 XG에 원심 분리기는 추출 된 단백질을 수집합니다. </li><li> ASSA 단백질을 사용하여 추출 된 단백질의 농도를 측정Y 키트 (자재 표)과 모든 추출물을 정상화는 동일한 양의 단백질을 함유한다. 적절한 버퍼 1 ml의에 총 볼륨을 가져 오십시오. 참고 : 총 단백질의 약 5 mg의 50 OD 600 세포로부터 얻어진다. </li><li> 전체 세포 추출물 (WCE)와 같은 (2.10 단계에서 추출 된 총 단백질은 5 mg의 경우 250 μg의 단백질) 50 μl를 저장합니다. 배 램 믈리 시료 완충액 (표 1) 50 μl를 첨가하고 3-5 분 동안 가열 블록에서 100 ° C에서 배양한다. 로드 웨스턴 블롯 분석 (5 절 : 웨스턴 블롯 분석)에 대한 SDS-PAGE 젤의 각 샘플의 10 μL. </li></ol> HF-Smt3 복합체 3. 정제 <ol><li> 실험 1 분간 저속 원심 분리 (800-1,500 XG)에 의해 (샘플 당 구슬 100 ㎕)에 필요한 니켈 NTA의 superflow 비즈 (재료 표)를 얻습니다. 상층 액을 제거합니다. </li><li> 워시 비즈 PBS (자료 표)의 1 ml의 5 배 : 반전 최고의 오버구슬이 재현 탁 될 때까지 바닥, 저속 원심 분리하여 구슬을 수집하고 뜨는을 제거합니다. </li><li> 구아니딘 완충액 (표 1) 1 ㎖에 비드를 일시 및 처리 대상에 대응하는 샘플 튜브의 개수로 나누어지는. 저속 원심 분리하여 구슬을 수집하고 뜨는을 제거합니다. 상단을 통해 반전 바닥에서 잘 구슬을 섞는다. 참고 : 상단 오버 바닥을 반전 잘 구슬을 섞는다. </li><li> 니켈 NTA의 superflow 구슬 100 μL에 각 샘플의 경우, (단백질의 추출 단계 2.11에서) 나머지 WCE의 950 μl를 추가합니다. </li><li> 적어도 4 시간 또는 밤새 4 ℃에서 흔들 플랫폼에 품어. </li><li> 4 ℃에서 1 분 800-1,500 XG에 원심 분리기. </li><li> 상층 액 (삭제) 50 μl를 저장합니다. 배 램 믈리 시료 완충액 50 μl를 첨가하고 3-5 분 동안 가열 블록에서 100 ° C에서 배양한다. 로드 웨스턴 블롯 분석 (제 5 SDS-PAGE 젤의 각 샘플의 10 μL : 웨스턴 블롯 항문이 Analysis). </li><li> 락을 플랫폼에 한 번 5 ~ 10 분 동안 구아니딘 버퍼 1 ml의 씻을 구슬. </li><li> 워시 비즈 락 플랫폼에서 5 ~ 10 분 동안 버퍼 (표 1)을 깨고 1 ml의 5 배. </li><li> 배 램 믈리 샘플 버퍼의 90 μL에 재현 탁 구슬. </li><li> 1 M 이미 다졸의 10 μl를 추가합니다. 참고 : 이미 다졸 인해 이미 다졸과 구슬 사이의 경쟁의 상호 작용에 니켈 NTA 비즈에서 그의 태그가 단백질을 해리하는 데 도움이됩니다. </li><li> 3-5 분간 가열 블록에서 100 ° C에서 인큐베이션. </li><li> 소용돌이, 다음 30 초 동안 13,000 XG에 원심 분리기. 새로운 튜브에 뜨는을 전송합니다. </li><li> (: 웨스턴 블롯 분석 제 5 절) 웨스턴 블롯 분석을위한 SDS-PAGE 젤에서 각 샘플의 부하 10 ~ 20 μL. 주 : WCE 5mg을 사용하는 경우는 10 ~ 20 μL, 0.5-1.0 mg의 입력에 대응한다. </li></ol> Myc와 태그가 동원체 단백질 4. 면역 침전 <ol><li> 반 C-Myc와 아가 로스 친 화성 젤을 구하는tibody (자료 표) 저속 원심 분리 (800-1,500 XG)에 의한 실험 (샘플 당 수지 25 μL)에 필요한. 상층 액을 제거합니다. </li><li> 버퍼 1 ml의 씻을 수지 5 배 : 수지가 재현 탁 될 때까지 반전 최고의 오버 바닥, 저속 원심 분리하여 수지를 수집하고, 상층 액을 제거합니다. </li><li> 완충액 1 ㎖에서 수지를 일시 및 처리 대상에 대응하는 샘플 튜브의 개수로 나누어지는. 저속 원심 분리하여 수지를 수집하고, 상층 액을 제거합니다. 참고 : 위 이상 바닥을 반전 아니라 수지를 섞는다. </li><li> 수지의 25 μL에 : (단백질의 추출 단계 2.11에서) 나머지 WCE의 950 μl를 추가합니다. </li><li> 4 ° C에서 하룻밤 흔들 플랫폼에 품어. </li><li> 4 ℃에서 1 분 800-1,500 XG에 원심 분리기. </li><li> 상층 액 (삭제) 50 μl를 저장합니다. 배 램 믈리 시료 완충액 50 μl를 첨가하고 3-5 분 동안 가열 블록에서 100 ° C에서 배양한다. 소호광고 웨스턴 블롯 분석을위한 SDS-PAGE 젤 (5 절 : 웨스턴 블롯 분석)에서 각 샘플의 10 μL. </li><li> 버퍼 1 ml의 씻을 수지 5 배 : 수지가 재현 탁 될 때까지 반전 최고의 오버 바닥, 저속 원심 분리하여 수지를 수집하고, 상층 액을 제거합니다. </li><li> SUMEB 샘플 완충액 (표 1) 100 ㎕에 재현 탁 수지. 참고 : SUMEB 샘플 버퍼가 8 M 우레아 1 % SDS (강한 변성 조건)가 포함되어 있습니다. </li><li> 3-5 분간 가열 블록에서 100 ° C에서 인큐베이션. </li><li> 소용돌이, 다음 30 초 동안 13,000 XG에 원심 분리기. 새로운 튜브에 뜨는을 전송합니다. </li><li> (: 웨스턴 블롯 분석 제 5 절) 웨스턴 블롯 분석을위한 SDS-PAGE 젤에서 각 샘플의 부하 10 ~ 20 μL. 주 : WCE 5mg을 사용하는 경우는 10 ~ 20 μL, 0.5-1.0 mg의 입력에 대응한다. </li></ol> 5. 웨스턴 블롯 분석 <ol><li> 4~12% 비스 - 트리스 젤 (자료 표)와 반환 한의 단백질 추출물을로드ORM 전기는 90 분 동안 120 V에서 (버퍼를 실행 : 자료 표). </li><li> 90 분 (: 자재 표 전송 버퍼)에 대해 30 V로 전송 장치를 이용하여 니트로 셀룰로오스 막 (자재 표)로 겔로부터 단백질을 옮긴다. </li><li> 실온에서 1 시간 동안 5 % 우유 / 1X TBST (표 1)에서 막을 차단. </li><li> 5 % 우유 / 1X TBST 밤새 4 ° C가 차 항체 (자료 표)와 멤브레인을 품어. 1,000 (안티 - 플래그 및 안티 UB 항체) 또는 1 : 5,000 (안티 - Myc와 항체) 일차 항체를 들어, 1의 희석을 사용합니다. </li><li> 1X TBST 10 분마다 막 배를 씻으십시오. </li><li> 실온에서 1 시간 동안 5 % 우유 / 1X TBST에서 이차 항체 (자재 도표)와 함께 막을 인큐베이션. 이차 항체의 5,000 희석 : 1을 사용합니다. </li><li> 1X TBST 10 분마다 막 배를 씻으십시오. </li><li> ECL 가공용으로 멤브레인을 품어NG 용액 (자료 표) 5 분. </li><li> 블루 민감한 X 선 필름 막 (자료 표)를 노출 및 자동 개발자 (자료 표)를 사용하여 개발할 수 있습니다. </li></ol>

<ol><li>Johnson, P. R., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO-1%3A+Ubiquitin+gains+weight%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">SUMO-1: Ubiquitin gains weight.</a> Trends Cell Biol. 7, 408-413 (1997).</li>
<li>Hewawasam, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psh1+is+an+E3+ubiquitin+ligase+that+targets+the+centromeric+histone+variant+Cse4%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Psh1 is an E3 ubiquitin ligase that targets the centromeric histone variant Cse4.</a> Mol Cell. 40, 444-454 (2010).</li>
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</ol>

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이러한 HA, Myc와, 플래그 및 GST와 같은 에피토프 태그 널리 단백질의 생화학 적 분석을 위해 사용된다. HF-Smt3 및 Ndc10 Ndc80과 같은 나 Myc 태그가 동원체 단백질과 균주의 구성은 이러한 sumoylation 유비퀴틴과 같은 PTMS의 검출을 용이하게한다. HF-Smt3 분석를 풀다운는 sumoylated 동원체 단백질, Ndc10 및 Ndc80 (그림 1)의 검출을 할 수 있습니다. 안티 - 플래그 항체를 이용하여 친 화성 정화 프로토콜과 웨스턴 블롯 분석 HF-Smt3 및 표적 단백질 사이의 상호 작용의 특이성을 설정, 수정 된 단백질은 HF-Smt3없이 제어 변형에 검출되지 않았다있다. 단백질 기질에 Myc와 태그의 사용은 HF-Smt3 접합체에 sumoylated Ndc10 및 Ndc80의 존재를 검증한다. 또한, Ndc10과 Ndc80 모두의 sumoylation는 nocodazole 처리 된 세포 (그림 1C 및 1...

각각 표적 단백질에 (S. cerevisiae의 1 Smt3 SUMO) 유비퀴틴과 sumoylation는 유비퀴틴과 작은 유비퀴틴 같은 수정의 활용을 할 수 있습니다. 동원체 단백질 PTMS 충실한 염색체 분리를 보장하기 위해 상이한 세포주기 단계에서 자신의 세포 수준 및 단백질 - 단백질 상호 작용에 영향을 미친다. 예를 들어, Cse4 / CENP-A 및 외부 동원체 단백질 Dsn1의 세포 수준 게놈 안정성 2-5을 보장하기위한 유비퀴틴 매개 단백질 분해에 의해 조절된다. 잘못된 동원체 - 미세 소관 첨부 불안정 직접 미세 소관 6-8과 상호 작용 Dam1과 Ndc80 단지를 인산화 Ipl1 / 오로라 B 키나제가 필요합니다. 일흔을 통해 동원체 단백질의 확인에도 불구하고, PTMS, 예를 들어, 유비퀴틴과 SUMO 이러한 단백질의 변형을 조사 거의 연구가있다. 주요한 제한은 PTM을 보존하는 능력이다정화 및 sumoylation, 인산화, 메틸화, 등과 같은 PTMS의 검출을위한 사용자 정의 항체의 소수 중의. sumoylated 동원체 단백질의 특성은 Ndc10, Cep3는 Bir1 및 Ndc80 사용자 정의 항체 (9)를 이용했다. 또한 Ndc10 유비퀴틴은 10 기재로서 연루되어왔다. 인간 Hec1 (S. cerevisiae의에서 Ndc80)도 APC / C-hCdh1 E3 리가 아제 (11)에 의해 규제, 유비퀴틴 화를 위해 기판이다. 따라서, Ndc10 및 Ndc80는 S.에서 sumoylation 및 유비퀴틴을 모두 감지 할 수있는 프로토콜의 최적화를위한 좋은 후보입니다 cerevisiae의. sumoylation의 식별을 용이하게하기 위해, 우리는 HF-Smt3 및 Myc와 태그가 Ndc10 또는 Ndc80을 표현 균주를 건설했다. 에피토프 태그 (HF :을 His6-FLAG)의 사용으로 인해 자주 후보 단백질에 대해 발생하는 폴리 클로 날 혈청에서 관찰되고 교차 반응의 배경을 최소화한다. 우리는 선호도와 프로토콜을 고안HF-Smt3 접합체를 정제 한 다음 정제 Smt3 제제 sumolyated Ndc10 및 Ndc80의 존재를 검출하기 위해 상업적 방지 플래그 및 안티 나 Myc 항체를 사용 하였다. 유비퀴틴을 위해, 우리는 Myc와 태그가 동원체 단백질의 유비퀴틴 화를 보존하는 변형 된 면역 프로토콜을 고안 Ndc10과 Ndc80의 유비퀴틴 화를 감지하는 상업 항 UB 항체로 웨스턴 블롯 분석을 수행 하였다.

<table><tbody><tr><td>유리 구슬</td><td>BioSpec 제품</td><td>11079105</td><td>직경 0.5mm</td></tr><tr><td>미니 비드비터</td><td>BioSpec 제품</td> <td># 693</td><td>8 세포 교란 자</td></tr><tr><td>Ni-NTA superflow</td><td>Qiagen</td><td>30430</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8215</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Anti-C-Myc agarose 친화성 젤 개미 토끼</td><td>Sigma-Aldrich</td>에서 생산<td>A7470</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Monoclonal anti-Flag M2 항체 마우스</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1804</td><td>1차 항체, 희석 1:1,000</td></tr><tr><td>c-Myc 항체 (A-14)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-789</td><td>1차 항체, 희석 1:5,000</td></tr><tr><td>정제 마우스 항체 단클론 9E10</td><td>Covance</td><td>MMS-150P</td><td>1차 항체, 희석 1:5,000</td></tr><tr><td>Ubiquitin (P4G7) 단클론 항체</td><td>Covance</td><td>MMS-258R</td><td>1차 항체, 희석 1:1,000</td></tr><tr><td>ECL Rabbit IgG, HRP 연결 전체 Ab</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>NA934V</td><td>2차 항체, 희석 1:5,000</td></tr><tr><td>ECL 마우스 IgG, HRP 연결 전체 Ab</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>NA931V</td><td>2차 항체, 희석 1:5,000</td></tr><tr><td>DC 단백질 분석</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0116</td><td></td></tr><tr><td>니트로셀룰로오스 멤브레인</td><td>Novex</td><td>LC2001</td><td>0.45mm 공극 크기</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris 단백질 겔</td><td>Novex</td><td>NP0321BOX</td><td>1.0mm, 10웰</td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS Running Buffer</td><td>Novex</td><td>NP0002</td><td>20x</td></tr><tr><td>NuPAGE 전송 버퍼</td><td>Novex</td><td>NP0006-1</td><td>20x</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico 화학발광 기판</td><td>Thermo Scientific</td><td>34078</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS pH7.4</td><td>GIBCO</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>청색 민감성 X선 필름</td><td>Dbio</td><td>DBOF30003</td><td></td></tr><tr><td>자동 현상액</td><td>Kodak</td><td>M35AX-OMAT</td><td></td></tr><tr><td>Nocodazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1404</td><td>50 mg</td></tr><tr><td>MG-132</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S2619</td><td>25 mg</td></tr></tbody></table>

sumoylation과 신진 효모 동원체 단백질 ndc10과 ndc80의 유비퀴틴 화를 감지 할 수 있습니다 단백질 정제 기술

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

이러한 인산화, 메틸화, 아세틸 화, 유비퀴틴 및 sumoylation 같은 번역 후 변형 (PTMS)는, 많은 단백질의 세포 기능을 조절한다. 센트로 DNA와 연관 동원체 단백질의 PTMS는 유전체의 안정성을 유지하기 위해 충실한 염색체 분리를 중재. 같은 질량 분석 및 웨스턴 블롯 분석과 같은 생화학 적 접근 방법이 가장 일반적으로 PTMS의 식별을 위해 사용된다. 여기서, 단백질의 정제 방법은, 사카로 마이 세스 세레 비지에 동원체 단백질 Ndc10 및 Ndc80의 sumoylation 및 유비퀴틴 양쪽의 검출을 허용하는 기술된다. Ndc10 Myc와 - 태그 또는 Ndc80가 건설하고 우리의 연구에 사용 된 표현 폴리 히스티딘 플래그 태그가 Smt3 (HF-Smt3) 및 변형. sumoylation의 검출을 위해, 우리는 니켈 비드를 사용하여 자신 태깅 sumoylated 단백질을 정제 친화력 프로토콜을 고안 sumoylated Ndc10 A를 검출하기 위해 항 - 나 Myc 항체로 웨스턴 블롯 분석을 이용ND Ndc80. 유비퀴틴의 검출을 위해, 우리는 Myc와 태그가 단백질의 면역을위한 프로토콜을 고안 Ndc10과 Ndc80이가 도처 것을 보여 방지 UB 항체와 웨스턴 블롯 분석을 사용했다. 우리의 결과는 그의 플래그에 대한 관심의 에피토프 태그 단백질이 Smt3 변형 여러 PTMS의 검출을 용이하게 태그를 보여줍니다. 앞으로의 연구는이 기술의 개발은 특정 PTM에 의존 단백질 상호 작용을 식별하고 특성화 할 수 있도록해야한다.

이전에 설명 된대로 9,12- 동원체 단백질과 Ndc80 Ndc10의 sumoylation을 검출하도록, HF-Myc와 Smt3 및 태깅 동원체 단백질 (또는 Ndc80 Ndc10)와 균주 (표 2)를 구성 하였다. HF-Smt3 접합체 친화력의 Ni-NTA 비드를 사용하여 정제 하였다. HF-Smt3 (그림 1A와 1B, 왼쪽 패널)없이 제어 변형에 결석했다 스모 기판의 sumoylated 형태의 안티 - 플래그 항체 허용 감지와 정제 HF-Smt3의 웨스턴 블롯 분석. 예상대로, 스모 기판의 여러 형태는 HF-Smt3 변형 검출되었다. Ndc80과 Ndc10이 방지 Myc와 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하여 정제 HF-Smt3 복합체에 존재하는 경우에 우리는 다음 결정. Ndc80 Ndc10 또는보다 높은 분자량이었다 다중 대역 명확 (도 1A 및 1B,...

이 원고는 신진 효모 사카로 마이 세스 세레 비지에, sumoylation 및 동원체 단백질, Ndc10 및 Ndc80의 유비퀴틴의 검출에 대해 설명합니다.

Sumoylation과 신진 효모 동원체 단백질 Ndc10과 Ndc80의 유비퀴틴 화를 감지 할 수 있습니다 단백질 정제 기술

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular ...

이 절차의 전반적인 목표는 출아 효모의 키네토코어 단백질인 NDC 10 및 NDC 80의 SUMOylation 및 유비퀴틴화를 검출하는 것입니다. 이는 먼저 His-FLAG 태그가 붙은 SMT3와 Myc 태그가 붙은 NDC 10 또는 NDC 80을 발현하는 효모 세포를 수확하고, 이 세포들로부터 단백질 추출물을 제조함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 SUMOylation 검출을 위해 His-FLAG 태그가 붙은 SMT3 접합체를 정제하거나, 유비퀴틴화 검출을 위해 Myc 태그가 붙은 키네토코어 단백질을 면역침전시키는 것입니다.그 후, 웨스턴 블롯 분석을 통해 sum ation 또는 유비퀴틴화를 검출합니다. 최종적으로, NDC 10 및 NDC 80의 래더링 패턴(laddering pattern) 존재는 이들 단백질이 시뮬레이션되고 유비퀴틴화되었음을 확인시켜 줍니다. 설명된 단백질 정제 방법은 출아 효모 sacro의 connico 단백질인 ND C 10 및 NDC 80의 시뮬레이션과 유비퀴틴화를 모두 검출할 수 있게 합니다.My cci. 이 기술의 주요 장점은 우리가 생성한 균주가 테스트 단백질에 대한 것과 시뮬레이션 검출을 가능하게 하는 것, 이렇게 두 가지 에피토프 공격 지점을 가지고 있다는 점입니다. 이러한 태그를 사용하면 다클론 혈청을 사용할 때 빈번하게 관찰되는 교차 반응으로 인한 배경 신호를 줄일 수 있습니다.이 절차의 시연은 본 실험실의 연구원인 Canero Uni가 진행하겠습니다. 이전에 준비하여 -20 °C에 보관해 둔 효모 세포 펠릿에서 표적 단백질을 추출할 것입니다. 세포를 0.5 mL의 차가운 버퍼에 다시 현탁하십시오.니켈 니트릴, 트라이 아세틱 애시드 또는 니켈 NTA superflow 비드를 사용하는 풀다운 분석용 추출물인 경우 guine 버퍼를 사용하십시오. 면역침전용 추출물인 경우 버퍼 A를 사용하십시오. 튜브는 항상 얼음 위에 보관하십시오.세포 현탁액을 2 mL 튜브로 옮깁니다. 각 튜브의 스크루 캡을 닫습니다. 세포 현탁액의 부피와 동일한 양의 유리 비드를 추가합니다.상온의 미니 비드 비터(mini bead beater)에서 세포를 2분 동안 분쇄한 후, 튜브를 얼음 위에 2~3분 동안 놓아둡니다. 비드 분쇄와 냉각 과정을 3회 반복합니다. 4 °C에서 고속으로 30~60분 동안 볼텍싱(vortex)합니다.현미경으로 세포를 시각화하여 확인함으로써 세포가 용해되었는지 확인하십시오. 용해된 세포는 어두운 고스트(ghost) 형태로 나타나며, 경계나 정의된 모양이 없습니다. 최적으로는 세포의 최소 80%가 용해되어야 합니다.다음으로, 푸시 핀을 사용하여 튜브 바닥에 구멍을 뚫습니다. 스크류 캡을 느슨하게 닫고 튜브를 15 milliliter 원심분리관에 넣습니다. 1000 ×g에서 1분 동안 원심분리합니다.용해물을 수집하려면, 용해물을 마이크로 원심분리 튜브로 옮긴 후 4°C에서 15,000 ×g로 30분 동안 원심분리하여 추출된 단백질을 수집합니다. 단백질 분석 키트를 사용하여 추출된 단백질의 농도를 측정한 후, 모든 추출물이 동일한 양의 단백질을 포함하도록 정규화합니다. 적절한 버퍼를 사용하여 총 부피를 1 mL로 맞춥니다.세포 50 OD 600으로부터 약 5 mg의 총 단백질을 얻습니다. 추출된 단백질 중 50 µL를 전세포 추출물(whole cell extract)로 보관하십시오. 나머지 950 µL의 단백질 추출물은 추후 단백질 정제 또는 MT 태그 단백질의 면역침전법에 사용됩니다.전세포 추출물 50 µL에 2x Laemmli 샘플 버퍼 50 µL를 첨가합니다. 웨스턴 블롯으로 분석하기 전, 히팅 블록에서 샘플을 100 °C로 3~5분 동안 배양합니다. 정제에 필요한 nickel NTA superflow 비드를 준비하는 것으로 이 절차를 시작하십시오.1분간 저속 원심분리를 하여 필요한 양의 비드를 얻습니다. 상층액을 제거하고 PBS로 비드를 세척합니다. PBS 1 mL를 첨가하고 비드가 다시 부유될 때까지 튜브의 위아래를 뒤집어 섞어줍니다.저속 원심분리를 통해 비드를 수집하고 상층액을 제거합니다. 이러한 방식으로 비드를 총 5회 세척합니다. guine buffer 1 mL에 비드를 현탁한 후, 처리할 샘플 수에 맞춰 튜브에 분주합니다.저속 원심분리를 통해 비드를 수집하고 각 시료의 상층액을 제거합니다. 이전에 준비한 전세포 추출물 950 µL를 비드 100 µL에 첨가합니다.4°C의 로킹 플랫폼에서 최소 4시간 또는 하룻밤 동안 배양합니다. 4°C에서 800~1500 ×g로 1분간 원심분리합니다. 상층액 50 µL를 보관합니다.이 상청액에 2x Laemmli 샘플 버퍼 50 µL를 첨가하고 히트 블록에서 100 °C로 3~5분 동안 배양합니다. 이후 각 샘플 10 µL를 웨스턴 블롯으로 분석합니다. 니켈 NTA superflow 비드를 상온의 로킹 플랫폼에서 구아닌 버퍼 1 mL로 5~10분 동안 한 번 세척합니다.다음으로, 비드(beads)를 1 mL의 breaking buffer로 5회 세척합니다. breaking buffer로 마지막 세척을 마친 후, 비드를 90 µL의 2x Laemmli sample buffer에 재현탁합니다. His-tagged 단백질이 Ni-NTA 비드로부터 해리되는 것을 돕기 위해 10 µL의 1 M imidazole을 첨가합니다. 히팅 블록에서 100 °C로 3~5분간 배양합니다. 볼텍싱(Vortex) 후, 13,000 ×g에서 30초 동안 원심분리합니다.상청액을 새 튜브로 옮깁니다. 이 절차를 시작하려면, 저속 원심분리를 통해 필요한 양의 anti cmic aero affinity gel antibody를 확보하십시오. 상청액을 제거하고, 버퍼 A로 레진을 세척합니다. 버퍼 A 1 mL를 첨가하고 레진이 재현탁될 때까지 상하로 반전시켜 섞어줍니다.저속 원심분리를 통해 레진을 수집하고 상층액을 제거합니다. 총 5회 세척합니다. 레진을 1 mL의 버퍼 A에 현탁시킨 후, 처리할 샘플 수에 맞춰 튜브에 분주합니다.저속 원심분리를 통해 레진을 수집하고 상층액을 제거합니다. 25 µL의 레진에 950 µL의 전세포 추출물을 첨가합니다. 4 °C의 로킹 플랫폼에서 하룻밤 동안 배양한 후, 다음 날 4 °C에서 800 ~ 1500 ×g로 1분간 원심분리합니다.상층액 50 µL를 따로 보관합니다. 이 상층액에 2x LaM Ly 샘플 버퍼 50 µL를 첨가하고 히팅 블록에서 100 °C로 3~5분간 배양합니다. 레진을 버퍼 A로 세척하며, 버퍼 A 1 mL를 첨가한 후 레진이 다시 부유될 때까지 상하로 뒤집어 혼합합니다.저속 원심분리를 통해 레진을 수집하고, 최종 세척 후 상층액을 제거합니다. 수집한 레진을 100 µL의 sample buffer에 다시 현탁시킨 후, 히팅 블록에서 100 °C로 3~5분 동안 배양합니다. 볼텍싱 후 13,000 ×g에서 30초 동안 원심분리합니다.상층액을 새 튜브로 옮깁니다. 마지막으로, 이 프로토콜을 통해 수집한 모든 샘플을 로딩합니다. Western blot 분석을 위한 SDS page 겔에서, poly histamine flag 태그가 붙은 SMT three(또는 HF SMT three)와 MT 태그가 붙은 NDC 80 및 NDC 10을 발현하는 효모 균주를 사용하여 kinetico 단백질의 시뮬레이션을 검출하였습니다.HF SMT three 기질 3종을 니켈 비즈를 이용하여 친화성 정제하고 Anti-Flag 항체로 검출하였다. anti mic 항체로 프로빙했을 때, HF SMT three 기질에서 Sum moated NDC 80이 검출되었다. HF SMT three가 없는 대조군 균주에서 변형된 단백질이 나타나지 않은 것은 HF SMT three와 표적 단백질 간의 상호작용이 특이적임을 나타낸다.또한, NDC 80 및 NDC 10의 유비퀴틴화를 검출하기 위해 NOCO desole 처리된 세포에서 NDC 80과 NDC 10의 총량이 감소함을 확인하였습니다. Myc 태그가 붙은 NDC 80 또는 NDC 10을 면역침전시킨 후 anti-Myc 및 anti-ubiquitin 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였습니다. 전세포 추출물과 상층액 분석을 통해 NDC 80 M 및 NDC 10 M의 발현을 확인하였습니다. anti-Myc로 분석한 면역침전 샘플에서 여러 개의 고분자량 밴드가 나타났으며, 이는 NDC 80과 NDC 10에 번역 후 변형이 포함되어 있음을 시사합니다. anti-ubiquitin으로 분석한 면역침전 샘플의 래더링 패턴은 NDC 80과 NDC 10이 유비퀴틴화되었음을 보여주었습니다.NDC 80 및 NDC 10의 래더링 패턴은 프로테아좀 억제제 MG 1 32 처리로 인해 강화되었습니다. 이는 이들이 폴리 유비퀴틴화를 나타낸다는 것을 추가로 확인해 줍니다. 이 영상을 시청하고 나면, bat NN의 검출 및 백신 접종을 가능하게 하는 단백질 정제 기술에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

Ubiquitination 세 효소의 집합으로 실시하는 핵심 posttranslational 수정합니다. 이 수정에 관여 유전자의 돌연변이가 여러 가지 인간의 질병와 관련된 있습니다. 여기, 우리는 교양 세포에 단백질 ubiquitination을 감지 프로토콜...

단백질 Ubiquitination의 감지

공동 정화 nucleases와 프로 테아제에 의해 전통적인 방법으로 정화 진핵세포 리보솜의 준비 오염 부정 스트림 생화학 및 구조 분석에 영향을 미칩니다. 신속하고 간단한 색층 정화 방법은 모델 시스템으로 효모 변이를 사용하여이 문제를 해결하는 데 사용됩니다.

높은 활성 효모 변이의 색층 정화

이 동영상은 복합 펩타이드 혼합물에서 잔류 디글리신 펩타이드를 포함하는 유비퀴틴닐화 펩타이드를 추출하고 정제하는 방법을 설명합니다. 제시된 방법은 단백질의 원래 유비퀴틴(ubiquitination) 부위를 확인하는 데 도움이 될 수 있습니다.

유비퀴틴화 펩타이드의 면역친화성 기반 추출: 정제된 펩타이드 분획에서 유비퀴틴 태그 펩타이드를 선택적으로 추출하는 기술

이 동영상은 순차 효소 캐스케이드를 사용하여 기질 단백질의 SUMOylation을 위한 in vitro 방법을 보여줍니다. 또한, 단백질의 SUMOylated 상태는 전기영동 및 면역블로팅 기술을 사용하여 식별됩니다.

SUMOylation Assay: 면역블로팅을 통해 기질 단백질의 SUMOylation 상태를 검출하는 In vitro 기술

높은 품질의 효모 세포 추출물의 준비를 개별 단백질 또는 전체 프로테옴의 분석에 필요한 첫 번째 단계입니다. 여기에서 우리는 단백질의 기능, 상호 작용, 그리고 번역 후 수정 사항을 보존하기 위해 최적화 된 신진 효모 세포에 대한 빠르고, 효율적이며 신뢰성있는 균질화 프로토콜을 설명합니다.

함수의 연구, 상호 작용, 그리고 번역 후 수정을위한 신진 효모 단백질 추출 및 정제

유비퀴틴 ligases와 달리 몇 E3 스모 ligases가 확인 되었습니다. 이 수정 된 생체 외에서 SUMOylation 프로토콜 생체 외에서 재구성 분석 결과 의해 소설 스모 E3 ligases를 확인 할 수 있다.

생체 외에서 스모 E3 리가 활동 공부 SUMOylation 분석 결과

이 프로토콜은 치료 또는 표현형과 같은 특정 조건과 관련된 이러한 종류의 번역 후 수정 (PTM)의 변경을 식별하기 위해 유비퀴틴 (Ub) 및 유비퀴틴 -좋아요 (Ubls) 특정 프로테오옴을 확립하는 것을 목표로합니다.

유비퀴틴 및 유비퀴틴과 같은 종속 적 번역 후 수정 및 중대한 변경 식별 프로파일링

CENP-A 유비쿼터스는 세포 분열 사이의 분화를 통해 계승되고 세포 생존가능성에 필수적입니다. 여기서 우리는 EYFP 태그CENP-A (EYFP-CENP-A) 단백질의 유비쿼터션을 확인하기 위해 질량 분광분석 분석을 설명합니다.

EYFP 태그CENP-A(EYFP-CENP-A)의 유비쿼터션을 식별하기 위한 질량 분광분석

프로토콜은 p53 종양 억제 단백질을 예로 사용하여 포유류 세포로부터 유비퀴틴화된 단백질을 정제하는 단계별 방법을 설명합니다. 유비퀴틴화된 p53 단백질은 엄격한 비변성 및 변성 조건 하에서 세포로부터 정제하였다.

포유류 세포에서 유비퀴틴화된 p53 단백질의 정제

본 프로토콜은 토포이소머라제 억제제 및 포름알데히드에 의해 유도된 유비퀴틸화, SUMOylation 및 ADP-리보실화를 포함하여 DNA-단백질 가교결합(DPC) 및 번역 후 변형(PTM)을 검출하고 정량화하는 변형된 방법을 강조하여 DPC 및 그 PTM의 형성 및 복구에 대한 연구를 허용합니다.

DNA-단백질 가교 및 번역 후 변형의 정량적 검출

유비퀴틴화는 세포 내 단백질 기능의 중요한 조절자입니다. 여기서는 포유류 세포에서 기질 단백질 유비퀴틴화 수준을 검출하는 두 가지 세포 용해 방법을 설명하고, 유비퀴틴화 수준 분석에 미치는 효과를 비교합니다. HEK293T 세포 내 단백질 과발현은 일시적 형질전환에 의해 유도되었고, 유비퀴틴화된 단백질은 웨스턴 블롯 분석을 통해 검출되었습니다.

SMAD2/SMURF2를 모델로 삼은 포유류 세포 용해체에서의 유비퀴틴화 검출 비교 전략

배우세요 Saccharomyces cerevisiae에서 Ndc10과 Ndc80 단백질의 sumoylation 및 ubiquitination을 검출하는 단백질 정제 기술입니다. 이 방법은 키네토코어 단백질의 번역 후 수정을 연구하는 데 활용됩니다.

Sumoylation과 신진 효모 동원체 단백질 Ndc10과 Ndc80의 유비퀴틴 화를 감지 할 수 있습니다 단백질 정제 기술

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