전체 조직과 조직 검사에서 인간 상피 Enteroids과 Colonoids 설립

이 절차의 전반적인 목표는 장 조직에서 인체 투입구를 생성하는 것입니다. 이것은 먼저 기저에 있는 점막하 조직에서 장 점막을 절개함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 EDTA로 점막을 배양하여 결합 조직에서 상피의 해리를 촉진

다음으로, 장샘(intestinal crypt)은 해리된 상피(disharated epithelium)로부터 분리된다. 마지막으로, 장샘(intestinal crypt)은 기저막 기질(basem membrane matrix)에서 배양됩니다. 궁극적으로, 면역조직화학 기법은 배양된 OID의 상피 조직과 특정 상피 마커를 표시하는 데 사용됩니다.

이 방법의 함의는 이제 환자 특이적 생검에서 OID를 생성할 수 있다는 사실이며, 이는 이제 실험실에서 해당 조직을 사용하여 이전에는 할 수 없었던 장 질환 및 진단을 볼 수 있다는 것을 의미합니다. 완충액과 시약을 준비한 후 텍스트 프로토콜에 따라 기저막을 얼음 위에서 해동하고 조직을 받았을 때 섭씨 37도의 이산화탄소 인큐베이터에서 24웰 플레이트를 사전 배양합니다. 칼슘과 마그네슘이 없는 KO의 PBS 또는 DPBS가 제거될 때까지 조직을 씻어냅니다.

얼음처럼 차가운 DPBS로 채워진 실리콘 코팅 유리 페트리 접시에 조직을 넣고 점막 면이 위를 향하도록 하고 미누친 핀으로 조직을 늘리고 고정하여 조직을 고정합니다. 다음으로, 해부 현미경으로 미세 해부 가위와 미세한 구부러진 집게를 사용하여 점막하와 결합 조직에서 기저의 점막을 제거합니다. 그런 다음 점막 쪽이 위를 향하게 하여 절개된 점막을 펴고 실리콘 코팅 유리 페트리 접시에 평평하게 고정합니다.

구부러진 집게를 사용하여 점막 표면을 부드럽게 긁어냅니다. 이 단계는 제제의 품질을 향상시키는 데 필요합니다. 갓 준비한 2밀리몰 EDTA 킬레이트 완충액으로 점막을 덮습니다.

그런 다음 얼음으로 조직을 씻은 후 해부 현미경으로 텍스트 프로토콜에 따라 3-4회 구부러진 집게를 사용하여 점막을 부드럽게 긁어내어 피펫으로 장샘을 풀어냅니다. 페트리 접시에서 크립트 현탁액을 부드럽게 제거하고 50ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 조직을 확인하여 점막에서 거의 모든 소낭선이 제거되었는지 확인합니다.

150 마이크로 미터 필터를 통해 crypt suspension을 두 번 필터링하고 현미경을 사용하여 흐름을 확인합니다.crypt suspension을 세척하고 필요한 crypt 수를 5 ml 둥근 바닥 튜브로 옮긴 후 텍스트 프로토콜에 따라 150 Gs 및 4 °C에서 10 분 동안 crypt fraction을 원심 분리합니다. 그런 다음 사전 냉각된 피펫 팁과 기저막 매트릭스 Resuspend를 사용하여 상층액을 제거합니다. 토굴 펠릿.

웰당 기저막 매트릭스에 있는 50마이크로리터의 크립트 현탁액을 웰 중앙의 기저막 매트릭스를 천천히 배출하여 예열 플레이트에 적용합니다. 섭씨 37도의 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 플레이트를 30분 동안 배양하여 기저막 매트릭스가 완전히 중합될 수 있도록 합니다. 그런 다음 기저막 매트릭스에 CHIR 9 0 2 2 1 각각 2.5마이크로몰이 보충된 500마이크로리터의 완전한 인간 미니 장 배지를 오버레이합니다.

그리고 Thien은 조직을 배양하여 2 일 후에 배지를 변경하고 그 후 격일로 배지를 바꿉니다. 이 그림은 전체 조직에서 갓 분리된 crypts의 전형적인 예를 보여줍니다. 생검에서 분리된 crypt의 수는 전체 조직보다 적습니다.

일반적으로 한 번의 패스로 두 번의 생검 교합이 수행됩니다. 각 생검 물기는 10제곱밀리미터 표면의 결과를 낳으며 생검당 평균 50-100개의 크립스가 발생합니다. 5-6일 동안 배양과 기저막 매트릭스를 거친 후, Crips는 소장을 위한 장구(entero sphere)와 결장을 위한 대장구(colono sphere)를 형성하기 위해 둥글게 되고 7일 후에 통과합니다.

여기에 표시된 생검에서 확립된 진입 또는 OID는 파종 시 더 낮은 밀도에서 동일한 발달을 겪습니다. 따라서 포장은 일반적으로 배양에서 10-12일 후에 이루어집니다. 여기에서 볼 수 있듯이 OID와 OID는 모두 발광면을 나타내며 상피가 늘어서 있습니다.

증식 세포는 OID 내에서 관찰될 수 있으며 새싹 끝 내에 위치합니다. 여기에서 녹색으로 표시된 e catrin으로 염색된 OID의 컨포칼 이미징은 상피 세포를 보여줍니다. 이 그림은 상피 세포 접착 분자 유전자의 선천적 돌연변이로 인해 낭포성 섬유증과 터프팅 장병증이 있는 환자의 유입이 성장하는 것을 보여줍니다.

이 절차를 따르거나 실시간 PCR 또는 서양 혈액과 같은 방법을 사용하여 관심 유전자 또는 프로빙에 관한 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 환자의 특정 질문에 답하기 위해 실험실에서 효율적으로 진입을 생성할 수 있도록 human Crips를 일관되게 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.