전체 조직과 조직 검사에서 인간 상피 Enteroids과 Colonoids 설립

이 실험 절차의 전반적인 목적은 장 조직으로부터 인간 장 오가노이드를 생성하는 것입니다. 이는 먼저 장 점막을 하부의 점막하 조직으로부터 박리함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 점막을 EDTA와 함께 배양하여 상피 세포가 결합 조직으로부터 분리되도록 촉진하는 것입니다.

다음으로, 분리된 상피세포로부터 장크립트를 분리합니다. 마지막으로, 분리한 장크립트를 기저막 매트릭스에서 배양합니다. 최종적으로, 면역조직화학 기법을 사용하여 배양된 OID의 상피 구조와 특정 상피 마커를 확인합니다.

이 방법이 갖는 의미는 이제 환자 맞춤형 생검 조직으로부터 OID를 생성할 수 있다는 점이며, 이는 과거에는 불가능했던 장 질환 연구 및 진단을 위해 실험실에서 해당 조직을 사용할 수 있음을 의미합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 버퍼와 시약을 준비한 후, 조직을 수령하면 기저막을 얼음 위에서 해동하고 24웰 플레이트를 37 °C의 이산화탄소 배양기에 넣어 예열하십시오. 칼슘과 마그네슘이 없는 KO's PBS 또는 DPBS를 사용하여 DPBS가 투명해질 때까지 조직을 세척하십시오.

얼음처럼 차가운 DPBS가 채워진 실리콘 코팅 유리 페트리 접시에 조직의 점막 면이 위를 향하도록 놓은 다음, 미뉴친 핀(minuchin pins)을 사용하여 조직을 당겨 고정합니다. 이어서 해부 현미경 하에서 미세 해부 가위와 미세 끝 곡선 핀셋을 사용하여 점막 하층의 점막을 점막하 조직 및 결합 조직으로부터 제거합니다. 그 후 점막 면이 위를 향하도록 하여, 분리된 점막을 실리콘 코팅 유리 페트리 접시 위에 평평하게 펴서 핀으로 고정합니다.

곡선 핀셋을 사용하여 점막 표면을 부드럽게 긁어냅니다. 이 단계는 표본의 품질을 향상시키기 위해 필요합니다. 점막을 갓 준비한 2 mM EDTA 킬레이션 완충액으로 덮습니다.

그 후, 텍스트 프로토콜에 따라 해부 현미경 하에서 조직을 얼음 위에서 3~4회 세척한 다음, 곡선 핀셋을 사용하여 점막을 부드럽게 긁어 파이펫으로 장 음와(intestinal crypts)를 분리합니다. 페트리 접시에서 음와 현탁액을 조심스럽게 제거하여 50 milliliter 원심 분리 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 조직을 확인하여 거의 모든 음와가 점막에서 제거되었는지 확인합니다.

크립트 현탁액을 150 µm 필터로 두 번 여과하고, 현미경을 사용하여 여과 상태를 확인합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 크립트 현탁액을 세척하고 필요한 수의 크립트를 5 mL 라운드 바텀 튜브로 옮긴 후, 크립트 분획을 150 G, 4 °C에서 10분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 미리 냉각된 피펫 팁을 사용하여 상층액을 제거하고, basement membrane matrix로 크립트 펠릿을 재현탁합니다.

미리 가온한 플레이트의 각 웰 중앙에 basement membrane matrix 내의 crypt 현탁액 50 µL를 천천히 분주합니다. basement membrane matrix가 완전히 중합될 수 있도록 37 °C, 5% CO2 배양기에서 30분 동안 배양합니다. 그 다음, 2.5 µM의 CHIR 9 0 2 2 1이 첨가된 complete human mini gut medium 500 µL를 basement membrane matrix 위에 층을 이루도록 가합니다.

그리고 Thien은 배지를 2일 후에 교체하고, 그 이후로는 격일로 교체하며 조직을 배양합니다. 이 그림은 전체 조직에서 갓 분리한 crypt의 전형적인 예를 보여줍니다. 생검 조직에서 분리된 crypt의 수는 전체 조직에서보다 적습니다.

일반적으로 한 번의 통과 시 두 번의 생검을 수행합니다. 각 생검 시 10 square millimeter 표면적이 확보되며, 생검당 평균 50~100개의 crips가 얻어집니다. 배양 및 basement membrane matrix에서 5~6일간 배양하면, Crips가 뭉쳐 소장의 경우 entero spheres를, 결장의 경우 colono spheres를 형성하며, 7일 후 계대 배양합니다.

여기에 제시된 생검으로부터 확립된 오가노이드(organoids) 또는 OID는 파종 시 더 낮은 밀도에서 동일한 발달 과정을 거칩니다. 따라서 패키징은 일반적으로 배양 후 10~12일 후에 수행됩니다. 여기에 나타난 바와 같이, OID와 OID 모두 루멘(luminal) 측을 나타내며 상피세포로 둘러싸여 있습니다.

증식하는 세포들이 OID 내에서 관찰되며, 이들은 싹 끝(bud tips) 부분에 위치합니다. e-cadherin을 녹색으로 염색한 OID의 공초점 이미징을 통해 상피세포를 확인할 수 있습니다. 본 그림은 낭성 섬유증과 상피세포 접착 분자 유전자의 선천적 돌연변이로 인한 튐 장병증(tufting enteropathy)을 앓고 있는 환자로부터 성장한 장 상피세포를 보여줍니다.

본 절차를 따르거나 실시간 PCR 또는 Western blot과 같은 방법을 사용하여 관심 유전자 또는 프로브에 관한 추가적인 질문에 답할 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 연구실에서 환자 특이적 질문에 답하기 위해 엔티티를 효율적으로 생성할 수 있도록 인간 CRISPR를 일관되게 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.