천장 문화 성숙한 지방 세포의 탈분화를 통해 인간 된 지방 줄기 세포의 생성

성숙한 지방세포는 in vitro에서 전구세포로 분화할 수 있는 능력을 가지고 있습니다. 이는 성숙한 세포를 배지가 완전히 채워진 플라스크에 넣고 뒤집어서 배양하는 기술인 씰 배양(seal culture)을 통해 이루어집니다. 부유 세포는 플라스크 벽면에 부착되며, 지질로 채워진 둥근 세포에서 길쭉한 섬유아세포 유사 세포로 형태가 변합니다. 균질합니다.

실험실에 조직 샘플이 도착하면 신장된 세포 집단을 얻어 배양할 수 있습니다. 필요한 지방세포 수에 따라 지방 조직의 무게를 잰 후, 적절한 양의 샘플을 50 ml 튜브에 넣으십시오. 소화 과정을 통해 조직 1 g당 약 1백만 개의 세포를 얻을 수 있을 것으로 예상됩니다.

천장 배양(Ceiling cultures)은 25 cm 플라스크당 500,000개의 세포와 6-웰 플레이트의 각 웰당 50,000개의 세포를 사용하여 수행합니다. 콜라게나아제(collagenase)가 보충된 KRH 작동 완충액을 첨가하고, 가위로 조직을 잘게 다진 후 준비물을 37 °C에서 45분 동안 배양합니다. 배양하는 동안 튜브와 주사기 설정을 준비합니다. 핀셋을 사용하여 반투명한 용액을 나일론 메쉬를 통해 플라스틱 비커에 붓습니다.

세포 준비물을 메쉬에 대고 문질러 거른 후, KRH 작동 완충액 5 ml로 조심스럽게 세척합니다. 여과된 세포 현탁액을 튜브와 주사기가 세트로 된 50 ml 용기에 옮깁니다. 성숙한 지방세포를 약 10분 동안 그대로 둡니다.

세포는 부유하여 완충액 상단으로 이동하게 됩니다. 하단에서 완충액을 천천히 흡입하십시오. 주입기와 튜브를 사용하여 세척용 KRH 작업 완충액 20 ml를 추가하십시오.

세척 단계를 두 번 반복합니다. 버퍼를 수집하여 지방세포 현탁액의 최종 부피를 5 ml로 맞춘 후, 혈구계수기를 사용하여 세포 수를 측정합니다. 20% 송아지 혈청이 보충된 D-M-E-M-F 12를 T 25 플라스크 부피의 4분의 3까지 채웁니다. 성숙한 지방세포 500,000개를 플라스크로 옮깁니다. 배지를 가득 채우고 상단 표면의 기포를 제거합니다.

플라스크에 전용 캡을 돌려 닫습니다. 5% carbon dioxide가 공급되는 세포 배양 인큐베이터에서 플라스크를 뒤집은 상태로 일주일 동안 배양합니다. 남아 있는 기포가 세포 부착을 방해할 수 있으므로 플라스크를 움직이지 않도록 주의하십시오.

웰 바닥에 커버슬립을 놓습니다. 웰에 플라스틱 부싱을 넣고, 8 mL의 배지를 채웁니다. 기포가 없는지 확인하십시오.

피펫 팁을 삽입할 수 있는 공간을 두고 부싱 위에 커버슬립을 놓습니다. 50,000개의 세포를 샘플링하여 커버슬립과 부싱 사이에 팁을 위치시켜 주입합니다. 5% carbon dioxide 조건의 세포 배양 인큐베이터에서 해당 플레이트를 1주일 이하로 배양합니다.

실험 설계에 따라, 세포가 다른 플레이트의 커버슬립에 부착되기 위해서는 최소 3일이 필요합니다. 2 mL의 배지가 담긴 상태에서 커버슬립을 뒤집어 놓습니다. 계속 배양한 커버슬립은 이후 면역형광 실험이나 DNA, RNA 및 단백질 추출을 위해 포르말린으로 고정할 수 있습니다.

성숙한 지방세포의 탈분화는 세포 형태에 큰 변화를 일으킵니다. 이 과정 동안 지방세포는 자신의 표현형을 잃으며, 일반적으로 지질 저장 기능과 관련된 전사체의 발현이 감소합니다. 이 면역형광 이미지는 탈분화의 다양한 단계에 있는 지방세포를 보여줍니다.

원형 형태의 세포들은 성숙한 지방세포 마커인 FABP4를 여전히 발현하는 반면, 문헌에 따르면 길쭉한 형태의 세포들은 더 이상 이를 발현하지 않습니다. 흔히 D 지방세포라고 불리는 D 분화 지방세포는 젊거나 고령인 마른 환자 또는 비만 환자로부터 얻을 수 있습니다. 이들은 장기 배양 능력을 갖추고 있으며 다분화능이 입증되었습니다.

저는 조직 공학 및 세포 치료에 대한 이들의 잠재력 또한 높게 평가합니다. 이들은 지방세포 생리학의 특정 조사를 위한 새로운 모델이 될 수 있습니다.