Name: 배아 마우스의 뇌에 추적 조건부 유전 Transsynaptic (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: 배우세요 배아 마우스 뇌에서 신경 회로 발달을 시각화하는 유전자 인코딩 횡시냅틱 추적자 방법. 단일 세포 해상도로 상류 및 하류 뉴런을 식별하여 발달 신경과학의 핵심 질문에 답합니다.

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원고에 대한 비판적인 논평을 해준 마이클 캔들리시에게 감사한다. 이 프로젝트는 Deutsche Forschungsgemeinschaft의 보조금 BO1743/6 및 SFB/TRR 152 P11 및 Z02의 지원을 받았습니다.

참고 : 윤리 문 : 동물 과목을 포함하는 절차는 함부르크 대학과 자를란 트 대학의 동물 복지위원회에 의해 승인되었다. 1. 준비 및 배아 조직의 고정 <ol><li> 배아를 해부하고, 동물을 희생하기 전에 조직의 후속 고정을위한 솔루션을 준비하는 데 필요한 모든 장비를 정렬합니다. 주의 : 항상 (pH 7.4까지 조정을 0.1 M 인산 완충 생리 식염수 (PBS)에 4 % PFA) 신선한 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 용액을 제조 하였다. </li><li> 윤리적으로 승인 절차 시간이 초과 임신 여성 마우스를 안락사. </li><li> 플랫폼에 마우스를 전송합니다. 70 % 에탄올로 복부의 복부 측면을 적시고 복강을 노출 예리한 가위를 사용하여 수직 절개. </li><li> 배아 체인을 확인하고 신중하게 사용 무딘 집게를 잡아 당깁니다과 얼음처럼 차가운 PBS에 배치합니다. </li><li> 에서 개별 배아를 제거미세 가위와 집게를 사용하여 배아 체인. 배아 주위에 여분의 조직을 제거하고 얼음처럼 차가운 PBS로 씻어. </li><li> (PFA로 배아를 전송하기 전에) 작은 꼬리 생검을 가지고 성별 식별 및 추적 대립 유전자의 유전자형 PCR 용 꼬리 용해 버퍼에 품어. </li><li> 대부분의 측면에서 배아에서 시작 진탕 얼음 빙냉 4 % PFA를 포함하는 튜브에 각각 별도로 배아 옮긴다. </li><li> 일정한 진탕 E13.5의 연령이나 얼음에 1.5 시간 동안 젊은에서 배아를 만끽. 일정한 흔들림 얼음에 2.5 시간 동안 나이 E14.5 및 E15.5에서 배아를 만끽. </li><li> 배아 나이 E16.5 이상은, 목을 벨 및 PFA 용액에 머리를 담근 전에 외피를 제거합니다. E16.5 배아의 머리는 일정 흔들림 얼음에 4.5 시간 동안 담가 할 수 있습니다. </li><li> 적절한 고정 후, 얼음처럼 차가운 PBS와 배아를 세 번 씻는다. 그들이 가라 앉을 때까지 4 ° C에서 PBS 용액에 30 % 자당에 배아를 전송바닥에. </li></ol> 2. 동결 <ol><li> 냉동 프로세스를 시작하기 전에 필요한 모든 자료 정렬 : 극저온 금형, 극저온 장갑, 페더급 곤충학 집게, 마커 펜과 최적의 절단 온도 화합물을 OCT () </li><li> 영구 알콜 성 마커 극저온 금형 레이블 (조직, 날짜와 유전자형의 방향을 언급). 얼음 양동이에 짓 눌린 드라이 아이스 100 % 에탄올의 비자금을 준비합니다. 이소 펜탄을 포함하는 내부 유리 비커를 놓습니다. 이소 펜탄가 식을 때까지 10 분 동안 기다립니다. </li><li> 한편, 자당 용액으로부터 조직을 제거 실험실 물티슈를 사용하여 조직의 주위에 여분의 크로스를 닦아. 조직을 덮을 경우 OCT 미리 라벨링 크라이 금형에 조직을 전송. OCT에서 공기 방울을 피; 특히 조직의 주위에. </li><li> 조직의 손상을 방지하기 위해 페더급 곤충학의 집게를 사용하여 OCT에서 조직의 방향을. 극저온 몰 전송함으로써 시작 동결예비 냉각 욕에 펜탄 D. 제대로 고정되지 않으므로 OCT를에 이소 펜탄을 기울여야합니다. -80 ° C에서 알루미늄 호일과 가게에서 샘플을 감 쌉니다. </li></ol> 3. 냉동 절편 <ol><li> 저온 유지 장치를 사용하여 다섯 시리즈의 14 μm의 얇은 시리얼 섹션을 잘라 면역 (IF) 분석을 위해 SuperFrost® 플러스 유리 슬라이드에 수집합니다. 사용 할 때까지 -80 ° C에서 슬라이드를 저장합니다. </li></ol> Tyramide 신호 증폭 (TSA) 프로토콜을 사용하여 4. 추적기 시각화 <ol><li> 염색에 필요한 버퍼 및 시약을 준비합니다. 항상 갓 이용의 날에 트리스의 NaCl-트윈 (TNT) 버퍼를 준비합니다. <ol><li> 1 L.의 최종 부피까지 1 ml의 피펫을 사용하여 트윈 20의 500 μl를 추가 한 M 트리스 - 염산의 pH가 7.5, 5 M의 NaCl 30 ml의 DDH 2 O를 100 ml의를 사용하여 TNT 버퍼를 준비합니다. 천천히 트윈 20을 추가하고 모든 트윈 (20)에 있는지 확인하도록 여러 번 아래 피펫을 세척솔루션입니다. </li><li> 트리스 - 염화나트륨 블로킹 업 한 L.의 최종 부피의 pH 7.5, 5 M NaCl을 30 ml의 DDH 2 O 1 M 트리스 - 염산 100 ㎖를 사용하여 (TNB) 버퍼 것은 차단 시약 5g 추가 준비 (구비 천천히 버퍼에 조금씩 키트) 교반하면서. (이 30 ~ 60 분보다 오래 걸릴 안) 완전히 차단 시약을 용해 연속 교반하면서 55 ° C로 점차 솔루션을 가열. 균일 한 가열을 55 ℃에서 수조를 사용하여 달성했다. 이 솔루션은 우유를 나타납니다. 사용하기 전에 실온에 대한 해결책을 가져와. 장기간 저장을 위해 -20 ℃에서 분취 가기. </li><li> 분자 생물학 / HPLC 등급의 DMSO에 (키트와 함께 제공) 비오틴 tyramide 시약을 복원합니다. 이는 따라 키트 DMSO의 적당량 다를 수 사용된다. 4 ° C에서 원액을 저장합니다. 주 : 각 Cre 호텔 및 R26 대립 유전자 이형 동물 섹션은 회로 분석에 사용될 수있다. 사용의ections 음성 대조군을 각각 하나 Cre 호텔 또는 1 R26 대립 유전자를 운반하는 한배에서. 정확히 두 번 이형 동물의 슬라이드처럼 음성 대조군 슬라이드를 취급합니다. 또한, 이중 이형 동물로부터 하나의 제어를 포함하지만 슬라이드 TSA 시약 (비 증폭 제어) 뺀다. </li></ol></li><li> 날카로운 신선한 메스는 조직 섹션을 둘러싼 초과 OCT를 제거하고 PAP 펜으로 절 주위에 경계를 표시 사용. </li><li> 실온에서 2 ~ 3 분 (RT)에 대한 슬라이드를 건조시킵니다. 5 분마다 TNT와 RT 배에서 슬라이드를 씻으십시오. 내인성 퍼 옥시 다제 활성을 급냉 0.3 %에서 30 분 동안 빙냉 메탄올 중의 H 2 O 2 용액을 RT에서 슬라이드를 배양한다. </li><li> 5 분 PBS로 세척 배 RT 각. 조직 투과성으로 대한 PBS에서 0.5 % 트리톤 X-100에서 10 분 동안 품어. 5 분마다 TNT와 RT 배에서 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> TNB와 블록 (30)에 대해 (슬라이드 당 200 ~ 300 μL 차단 솔루션)가습 실에서 실온에서 분. 모든 섹션이 완전히 TNB에 포함되어 있는지 확인합니다. 슬라이드 단계 사이에 건조시키지 마십시오. </li><li> 초과 차단 버퍼를 배출하고 추적 인식 차 항혈청 적용 RT 또는 밤새 4 ℃에서 2 시간 동안 TNB에 희석 (1 : GTT 15,000 토끼 방지 GFP : BL 1,000 염소 항 - WGA 1). 완전히 조직 절편 (슬라이드 당 200 ~ 300 μL)를 충당하기에 충분한 볼륨을 사용하십시오. 참고 : 여기에 추천 차 항혈청 희석 조정해야 할 수 있습니다. </li><li> 5 분 교반 각각 TNT와 RT 배에서 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> (: 반 WGA 500 말 방지 염소 IgG를, 1 : 실온에서 1 시간 동안 TNB에 방지 GFP 5,000 염소 항 - 토끼 IgG의 1) 첫 번째 항혈청의 호스트를 인식 바이오틴 차 항혈청과 섹션을 품어. </li><li> 5 분 교반 각각 실온에서 TNT 씻을 배. 100 스트렙 타비 딘 (SA) 컨쥬 게이트 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (SA-HRP 제공 위스콘신 : 1을 품어가습 챔버 내에서 30 분 동안 실온에서 TNB의 키트) 토륨. 5 분마다 TNT와 RT 배에서 슬라이드를 씻으십시오. 한편 TSA를 해동. </li><li> (키트와 함께 제공, BL의 시각화 및 GTT에 대한 TSA + 키트 TSA 키트를 사용) TSA 증폭 희석제에 TSA 1:50 희석. RT에서 정확하게 10 분 동안 희석 TSA의 조직 섹션을 품어. 미래 실험 나머지 희석 TSA 시약을 사용하지 않는 이상적 이전 세정 단계 동안, 사용 직전에 희석 TSA; 항상 신선한 준비합니다. </li><li> 5 분 교반 각각 TNT와 RT 배에서 슬라이드를 씻으십시오. 실온에서 30 분 동안 TNB 500 알렉사 Fluor® 546 스트렙 타비 딘 복합체 : 1 품​​어. 5 분 교반 각각 TNT와 RT 배에서 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 핵 염색 RT에서 PBS에 5 % bisbenzimide 용액에서 10 분 동안 품어. 5 분 교반 각각 TNT와 RT 배에서 슬라이드를 씻으십시오. Fluromount G로 마운트하고 표면 형광 또는 공 초점 현미경을 수행합니다. <em&gt; 문제 해결 : 트레이서 전송의 효능 (사용 Cre 호텔 드라이버 라인으로 결정) 생산 세포에 ROSA26 궤적의 발현 량에 의존하고, 신경 회로 (트레이서, 수렴 등의 제조 뉴런의 예 번호)를 분석 할 것이다. 따라서 여기에 추천 차 항혈청 희석이 부족하거나 과도한 신호를 방지하기 위해 조정해야 할 수 있습니다. 배경은 항상 적절한 제어 슬라이드 (위 참조)를 사용하여 분석해야한다. </li></ol> 배아 섹션 5. τlacZ 염색 <ol><li> 염색에 필요한 버퍼 및 시약을 준비합니다. 항상 신선하게 사용하기 전에 LacZ를 버퍼 C를 준비합니다. <ol><li> 1 ㎖의 70 % 디메틸 포름 아미드 (DMF)에 X-gal을 40 g을 첨가하여, 5- 브로 모 -4- 클로로 -3- 인돌 릴 - β-D-갈 락토 (X-GAL) 스톡 용액 (40 ㎎ / ㎖)을 준비한다. 장기간 저장을 위해 -20 ℃에서 알루미늄 호일 및 저장소와 커버. </li><li> 준비 니트로 블루 테트라 졸리움 (NBT) 성1 ㎖의 70 % DMF에 NBT의 50g을 첨가하여 옥랑 수용액 (50 ㎎ / ㎖). 장기간 저장을 위해 -20 ℃에서 알루미늄 호일 및 저장소와 커버. </li><li> LacZ의 25 % 글루 타르 알데히드의 80 μL, 4 % 5 ㎖ PFA, 1 M의 20 μl를 이용하여의 MgCl 2, 500 mM의 EGTA 100 ㎕, 마지막에 1 M 인산 완충액 pH 7.4 ml의 DDH 2 O 닫 정착액 준비 10 ㎖의 부피. </li><li> LacZ를 500 mM의 EGTA 5 ㎖, 500 ml의 최종 부피 50 ㎖의 DDH 포스페이트 완충액 pH 7.4 중 1 M, 2 O, 1 M의 MgCl 2의 1 ml를 사용하여 버퍼 준비한다. </li><li> 1 ml의 1 M 중의 MgCl 2, 500 mM의 EGTA 5 ㎖, 5 ml의 1 % 소듐 데 옥시 콜레이트, 10 % NP-40을 100 ㎖, 50 일 M 인산염 완충액 pH 7.4 ml의 DDH 2 O를 사용 LacZ의 버퍼 B를 준비 500 ml의 최종 부피까지. </li><li> NBT 원액 10 μL와 LacZ를 버퍼 B. 1 ㎖에 X-여자 원액의 12.5 μL 사용 직전에 신선한 확인하고 알루미늄 호일로 커버를 추가하여 LacZ를 버퍼 C를 준비합니다. </li></OL&gt; </li><li> (한편 PAP 펜으로 슬라이드를 준비) 적어도 10 ~ 15 분 동안 실온에서 슬라이드를 건조시킵니다. </li><li> LacZ를 가진 부분은 화학 퓸 후드 안쪽 습윤 챔버에서 상온에서 2 분간 정착액 수정. PBS로 3 회 씻어 2 mM의의 MgCl 2 보충. </li><li> LacZ를 가진 슬라이드 RT에서 10 분마다 3 회 씻어 버퍼 LacZ를 버퍼 A.와 슬라이드를 헹군다. 5 분마다 LacZ를 버퍼 B와 과정을 2 회 반복한다. 가습 실에서 6 시간 또는 하룻​​밤 30 ~ 37 ° C에서 LacZ를 버퍼 C에서 슬라이드를 품어. 참고 : LacZ를 버퍼 C의 충분한 양을 추가; 슬라이드는 배양 중에 건조하지 않아야합니다. </li><li> 적절한 배양 후 PBS로 슬라이드를 2 mM의의 MgCl 2 보충 씻는다. 간단히 DDH 2 O.로 섹션을 씻어 메이어의 글리신 젤라틴 커버 슬립. 미분 간섭 대비 (DIC) 촬상 셋업 장착 광학 현미경에 적합. </li></ol> 6. Gend어 및 트레이서 유전자형 <ol><li> 1 M 트리스 - 염산의 pH가 8.5, 500 mM의 EGTA 100 ㎕를 1 ml에 사용 꼬리 용해 버퍼를 준비, 10 % SDS 200 μl의 5 M의 NaCl과 DDH 2 O의 400 μl를 10 ml의 최종 볼륨을 확인합니다. </li><li> 꼬리 생검을 포함하는 각 에펜 도르프 튜브에 꼬리 용해 버퍼 500 μl를 추가합니다. 100 mg / ml의 최종 농도로 단백질 분해 효소 K를 추가한다. 55 ° C에서 진탕 기에서 밤새 품어. </li><li> 실온에서 10 분 동안 17,000 XG에 원심 분리기 샘플. 새로운 원심 분리기 튜브에 뜨는을 전송합니다. 상층 액에 이소프로판올 500 μl를 추가합니다. 상하 반전 튜브하여 적어도 5 분 동안 혼합한다. </li><li> 실온에서 5 분 동안 17,000 XG에서 원심 분리기에 스핀. 상층 액을 붓고. 70 % 에탄올 200 μl를 추가합니다. 적어도 5 분 동안 흔들어. </li><li> 5 분 동안 17,000 XG에 원심 분리기. Pipetman (부어하지 않음)과 상층 액을 제거합니다. 15 ~ 30 분 동안 따뜻한 챔버 (37 ° C)에서 펠렛을 건조. </li><li> 100 μL에 재현 탁 펠릿와이드 보어 필터링 정보를 사용하여 낮은 TE 산도 8.0 또는 물. 적절한 용해 밤새 C 1 시간 동안 37 °에서 55 ° C에 넣습니다. 4 ℃에서 보관하십시오. </li><li> PCR 반응 (꼬리 DNA 1 μL, 각각의 프라이머의 2.5 μL DMSO 오후 10, 25 각각의 dNTP의 μM 및 1M 베타를 포함하는 50 ㎕의 반응 혼합물)에 대한 DNA 1 μl를 사용합니다. 유전자형과 성 식별을위한 PCR 프라이머는 재료 표에 나열되어 있습니다. </li></ol>

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</ol>

이해 상충이 선언되지 않았습니다.

유 전적으로 정의 뉴런 집단의 신경 회로를 추적 트랜스 transsynaptic 트레이서로 표현하면 트레이서 neurotopic 바이러스 또는 정위 주사에 비해 몇 가지 장점을 가지고있다. 먼저, 추적기 내인성 단백질로서 생산하고, 따라서 임의의 면역 반응을 유도하지 않으며 선택적 신경 통로 재현성을 다른 동물에서 분석 될 수있다. 이 비 침습적 방법이기 때문에 둘째, 자궁 내, 예를 들어, 정위 주사 쉽게 접근하지 뉴런으로부터 회로를 추적하는데 이용 될 수있다. 제한 추적을 검출에 어려움이 발생할 수 있습니다 transsynaptic 전송에 일반적으로 낮은 효능을 포함한다. 또한, 추적 분자는 모든 시냅스에 희석됩니다. 대조적으로, 바이러스 복제 신경성 차례로 바이러스 복제는 시냅스를 횡단 한 후 신호를 증폭 리드. 그러나, 바이러스 복제는 또한 주요이다 limitat극한 인한 바이러스 성 신경성 세포 독성 바이러스의 사용 이온. 유전 transsynaptic 추적자 및 유전자 변형 신경성 바이러스의 일부 기...

해부학 경로 추적은 뇌와 행동 한 관계를 해독하는데 가장 일반적으로 사용되는 도구 중 하나이다. 신경 회로 추적 기술의 발전은 마우스 2 유전자 확인 된 신경 세포 집단에서 신경 회로를 추적 할 수있는 기능 신경 과학자을 수여했다. 이러한 기술적 인 발전에도 불구하고 그것은 특히 배아 성숙 중에 신경 회로의 형성을 해명 도전 남아있다. 현재까지 개발 된 추적 방법 중 대부분 transsynaptic 트레이서 정위 주사 또는 신경성 유전자 변형 바이러스 (도 1) 2,3- 기반으로하기 때문이다. 이러한 기술은 연결 공간 및 시간 해상도, 이러한 현상 뇌, 주사 부위에서 대부분의 impor 주사 부위의 재현성, 잠재적으로 염증 기술적 도전 탐침 주사와 같은 몇몇의 본질적인 한계를 달성하면서신경성 바이러스로 인한 tantly 세포 독성은 4 개 사용을 제한한다. 다른 방법은 유전자 변형 생쥐에서 유전자와 transsynaptic 추적자을 표현하는 것입니다. 우리는 최근에이 기술을 수정 및 유전자 확인 된 신경 세포 인구 5의 신경 회로를 매핑하는 이진 유전 transsynaptic 추적 시스템을 개발했다. Cre 호텔 - 중재 후 우리의 실험 전략은 양방향 추적 보리 렉틴 (BL) 6 ROSA (26) 현장에서 GFP (GTT) (7)에 융합 역행 추적 파상풍 독소 조각 C를 표현하는 두 개의 새로운 녹아웃 마우스 균주를 기반으로 재조합. 여기에서 우리는 선택적으로 kisspeptin을 생산 신경 세포 BL과 GTT, 생식 축 8,9의 성숙을 조절에 관여하는 신경 펩타이드을 표현하는이 마우스 균주를 사용했다. 우리는이 기술 키스의 개발 및 성숙을 시각화하기에 적합 함을 입증여성 마우스의 뇌 (5)의 배아 개발하는 동안 peptin 신경 회로. 번식 전략 R26-BL-IRES-τlacZ (BIZ) 및 R26-GFP-TTC (GTT) 추적 선 노크 재조합 ROSA26 대립 유전자를 전달 계통 5이다. R26-BIZ 및 R26-GTT의 대립으로 인해 두에 loxP 사이트 (5)에 의해 측면 강한 전사 정지 신호의 존재에 전사적으로 침묵. BIZ과 GTT 유전자의 발현은 전사 정지 신호의 Cre 호텔 - 매개 제거에 의해 활성화된다. BIZ-R26 및 R26-GTT 대립 단순히 치운다 드라이버 라인과 교차하여 독립적으로 사용될 수있다. 각각의 Cre 호텔 및 R26 대립 유전자에 대한 분석 동물 이형을 사용할 수있다. 하나 또는 하나 Cre 호텔 R26 대립 유전자를 운반 한배 새끼는 각각 대조군으로 사용되어야한다. 대안 적으로, t를 생성 할 수도있다노크에 riple Cre 호텔, R26-BIZ 및 R26-GTT 대립 유전자를 운반하는 동물, 그러나 이것은 하나의 추가 크로스가 필요합니다.

<table><tbody><tr><td>비스벤즈이미드(Hoechst 33258 염료)</td><td>Sigma</td><td>14530-100MG</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Sigma</td><td>32205-1L</td><td></td></tr><tr><td>극저온 금형(필어웨이)</td><td>Polyscience Inc.</td><td>18646A-1</td><td>22 x 22 x 20mm</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>시그마</td><td>D8418-100ML</td><td></td></tr><tr><td>디메틸 포름아미드(DMF)</td><td>VWR 화학 물질</td><td>23470,293</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>ROTH</td><td>3054.3</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>글루타르알데히</td><td>드 시그마</td><td>G5882-50ML</td><td></td></tr><tr><td>과산화수소</td><td>시그마</td><td>34988-7</td><td></td></tr><tr><td>이소펜탄(메틸 2-부탄)</td><td>시그마</td><td>M32631-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>카이저의 글리신 젤라틴</td><td>머크</td><td>1092420100</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>시그마</td><td>494437-1L</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M2670-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>ROTH</td><td>HN00.2</td><td></td></tr><tr><td>NBT</td><td>시그마</td><td>298-83-9</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40 대체</td>품 <td>Fluka</td><td>743.85</td><td></td></tr><tr><td>OCT</td><td>Leica</td><td>14020108926</td><td></td></tr><tr><td>PAP 펜</td><td>Dako</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>파라팜알데히드</td><td>시그마</td><td>P6148-1KG</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 데옥시콜레이트</td><td>시그마</td><td>D6750-25G</td><td></td></tr><tr><td>자당</td><td>시그마</td><td>S7903-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost 슬라이드</td><td>Thermo Scientific</td><td>FT4981GLPLUS</td><td></td></tr><tr><td>TSA 키트</td><td>PerkinElmer</td><td>NEL700</td><td></td></tr><tr><td>TSA 플러스 키트</td><td>PerkinElmer</td><td>NEL749A001KT</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>ROTH</td><td>AE15.2</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>ROTH</td><td>3051.2</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>ROTH</td><td>9127.1</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>ROTH</td><td>2315.1</td><td></td></tr><tr><td>저온 유지 장치</td><td>Leica</td><td>na</td><td></td></tr><tr><td>광학 현미경, DIC 이미징이 장착된</td><td>Zeiss</td><td>Axioskop2, Axio Vision 소프트웨어가</td><td></td>장착된 Zeiss Axioskop2</tr>, <tr><td></td><td>Axio Vision 소프트웨어가</td><td></td>장착된 <td>Zeiss</td> Axioskop2</tr>, <tr><td>Photoshop</td>, <td>Adobe</td><td>PS6</td><td></td></tr>, <tr><td>Goat anti-WGA(BL 인식)</td><td>Vector Laboatories</td><td>AS-2024</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylayted horse anti-goat IgG</td><td>Vector Laboatories</td><td>BA-9500</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylated goat anti-rabbit IgG</td><td>Vector Laboatories</td><td>BA-1000</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-GFP (recognizes GTT)</td><td>Invitrogen</td><td>A11122</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-GnRH</td><td>Affinity Bio Reagent</td><td>PA1-121</td><td></td></tr><tr><td>Dylight488-donkey anti-rabbit IgG</td><td>Thermo Scientific</td><td>SA5-10038</td><td></td></tr><tr><td>SA-Alexa Fluor 546</td><td>Life Technologies</td><td>S-11225</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Primers</td></tr><tr><td>BL Fwd (BIZ 유전형 분석용)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>ATGAAGATGATGAGCACCAGGGC</td></tr><tr><td>BL Rev (BIZ 유전형 분석용)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>AGCCCTCGCCGCAGAACTC</td></tr><tr><td>Cre Fwd (Cre 유전형 분석용)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>GTCGATGCAACGAGTGATGAGGTTCG</td></tr><tr><td>Cre Rev (Cre 유전형 분석용)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>CCAGGCTAAGTGCCTTCTCTACACCTGC</td></tr><tr><td>TTC Fwd (GTT 유전형 분석용)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>AGCAAGGGCGAGGAGCTGTT</td></tr><tr><td>TTC Rev (GTT 유전형 분석용)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>GTCTTGTAGTTGCCGTCGTCCTTGAA</td></tr><tr><td>XY Fwd (성별 유전형 분석</td><td>)Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>TGAAGCTTTTGGCTTTGA</td></tr><tr><td>XY Rev (성별 유전형 분석용)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>CCGCTGCCAAATTCTTTG</td></tr><tr><td>ROSA26 Fwd</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC</td></tr><tr><td>ROSA26 Rev</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>GCAGATGGAGCGGGAGAAAT</td></tr><tr><td>SA Rev</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC</td></tr></tbody></table>

배아 마우스의 뇌에 추적 조건부 유전 transsynaptic

Conditional Genetic Transsynaptic Tracing in the Embryonic Mouse Brain

해부학적 경로 추적은 뇌와 행동 사이의 관계를 해독하는 데 매우 중요합니다. 그러나 뇌의 배아 성숙 과정에서 신경 회로의 형성을 밝히는 것은 기술적으로 어려운 일인데, 현재까지 개발된 대부분의 시냅스 경유 추적 방법은 입체택시 추적자 주입에 의존하기 때문입니다. 이 문제를 극복하기 위해 우리는 쥐의 뇌에서 조건부 유전자 시냅스 경단 추적을 위한 이진 유전 전략을 개발했습니다. 이를 위해 Cre 매개 재조합 후 ROSA26 유전자 자리에서 양방향 시냅스 경호 추적자 보리 렉틴(BL)과 역행 시냅스 경진 추적자 테파누스 독소 단편 C를 선택적으로 발현하기 위해 두 개의 상보적인 knock-in 마우스 균주를 생성했습니다. 이 마우스의 세포 특이적 추적자 생산은 유전적으로 암호화되어 있으며 기계적 추적자 주입에 의존하지 않습니다. 따라서 우리의 실험적 접근 방식은 배아 쥐 뇌의 신경 회로 형성을 연구하는 데 적합합니다. 또한, 시냅스를 가로지르는 추적자 전달은 시냅스 활동에 의존하기 때문에 이러한 마우스 균주는 단일 세포 해상도에서 뇌 발달 중 유전적으로 정의된 뉴런 집단 간의 통신을 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 여기에서는 새로운 재조합 ROSA26 대립유전자를 사용하여 마우스 배아에서 시냅스 경유 추적을 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 우리는 발달 중인 암컷 쥐 뇌에서 생식 축의 성숙에 기저가 되는 신경 회로를 설명하기 위해 이 실험 기술을 활용했습니다.

이 섹션에서는 R26-BIZ (B L- I RES-τlac의 Z)과 R26-GTT (G FP-TT C) 대립 유전자와 협력을 얻을 수있다 대표적인 결과를 보여줍니다. 여기에서 우리는 생식 축 조절 신경 회로의 성숙을 분석 R26-BIZ 및 R26-GTT 대립 유전자를 사용합니다. 척추 동물의 복제를 중앙에서 성선 자극 호르몬 방출 호르몬 (GnRH에)을 분비하는 시상 하부의 신경 세포의 작은 부분 집합에 의해 제어된다. Kisspeptin, GnRH에 뉴런의 강력한 활성화 제,의 GnRH 및 kisspeptin 뉴런들 사이의 신경 회로가 5 알려지지 않았다 현상 암컷 마우스 뇌에서 성립하지만 때의 GnRH 뉴런의 활성 조절에 관여한다. 먼저 우리는 BIZ과 GTT 유전자의 발현은 특히 배아에 Cre 호텔 의존 재조합에 의해 활성화되는 것을 보여kisspeptin 특정 Cre 호텔 드라이버 라인 (10)을...

이진 유전 전략을 활용하여 Cre 매개 재조합 후 상보적 시냅스 경진 추적자를 발현하는 마우스의 신경 회로 추적을 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 세포 특이적 추적자 생산은 유전적으로 암호화되기 때문에 당사의 실험적 접근 방식은 단일 세포 해상도에서 쥐 배아 뇌 발달 중 신경 회로의 형성 및 성숙을 연구하는 데 적합합니다.

배아 마우스의 뇌에 추적 조건부 유전 Transsynaptic

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits ...

본 실험의 목적은 양방향으로 이동하는 트랜스 시냅스 추적자(trans synaptic tracer), 역방향으로만 이동하는 두 번째 추적자, 그리고 표적 세포에서 이동하지 않는 세 번째 표지라는 세 가지 서로 다른 세포 표지 시스템을 사용하여 배아 생쥐 뇌의 신경 회로 발달을 시각화하는 것입니다. 이를 통해 표적 뉴런, 상위 뉴런 및 하위 뉴런을 식별할 수 있습니다. 실험 결과는 본 실험 프로토콜이 단일 세포 해상도로 배아 암컷 생쥐 뇌의 신경 회로 형성을 분석하는 데 사용될 수 있음을 보여줍니다.이 방법은 특정 신경 회로가 언제 형성되는지, 그리고 배아 발달 과정에서 어떻게 구성되는지와 같은 발달 신경과학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 또한, 이 방법은 성체 마우스의 신경 회로를 추적하는 데에도 사용될 수 있습니다. 구체적으로, 유전적으로 식별된 뉴런 간의 시냅스 활성을 분석하는 데 활용될 수 있으며, 다양한 실험 조건이 시간이 지남에 따라 신경 회로를 어떻게 조절하는지 분석하는 데 사용될 수 있습니다.방금 안락사시킨 임신한 마우스로 시작합니다. 복부의 배측을 70% ethanol로 소독한 후, 수직 절개를 하여 배아를 노출시킵니다. 배아 사슬을 제거하여 얼음처럼 차가운 PBS가 담긴 접시에 옮깁니다.뭉툭한 핀셋을 사용하여 개별 배아를 제거합니다. 미세 가위와 핀셋을 사용하여 용액 내에서 개별 배아를 분리하고, 배아가 완전히 깨끗해지면 그 과정에서 여분의 조직을 제거합니다. 각 배아에서 꼬리 생검 조직을 소량 채취하여 용해 버퍼가 담긴 튜브에 넣고 성별 확인 및 유전자형 분석을 위한 DNA를 수집합니다.그런 다음 배아를 갓 제조하여 얼음에 보관한 4% PFA로 옮깁니다. 각 배아의 처리가 끝나면, 배아의 크기에 따라 최소 1.5시간 동안 흔들어주며 PFA 내에서 배양합니다. 배양이 완료되면.고정된 조직을 얼음처럼 차가운 PBS로 3회 세척하며, 세척당 최소 5분 동안 수행합니다. 그 후 배아를 4°C로 유지된 30% sucrose 용액으로 옮깁니다. 조직이 용액 속에 완전히 가라앉으면 동결 절편 제작을 진행합니다.먼저, 영구 알코올 내성 마커를 사용하여 cryo mold에 라벨을 붙입니다. 다음으로, 아이스 버킷에서 100%Ethanol에 분쇄된 드라이아이스를 섞어 슬러리를 준비하고, 이 슬러리를 이용하여 isop pentane이 담긴 유리 비커를 약 10분 동안 냉각시킵니다. 기다리는 동안, sucrose 용액에서 조직을 꺼내고 표준 실험용 와이프로 과도한 sucrose를 닦아냅니다.그 다음 조직을 미리 라벨링된 cryo mold로 옮깁니다. 조직이 완전히 잠길 정도의 충분한 양의 OCT를 넣습니다. 특히 조직 주변에 OCT 내 기포가 생기지 않도록 주의하십시오.다음으로, 조직의 손상을 최소화하기 위해 깃털 무게의 곤충학용 핀셋을 사용하여 조직의 방향을 잡습니다. 필요한 경우, 튀김 현상이 발생하지 않도록 냉각된 iso pentane 욕조에서 동결 몰드를 동결시킵니다. 동결된 몰드는 랩으로 감싸 -80 °C에 보관하였다가 이후 절편 제작에 사용할 수 있습니다.이를 14 micron 두께의 연속 절편으로 5장씩 한 세트로 자릅니다. 각 5장 세트를 super frost plus 유리 슬라이드에 수집합니다. 본 프로토콜을 위한 용액을 준비할 때, 반드시 신선하게 조제한 TNT 버퍼에 tween 20을 천천히 첨가하십시오.그런 다음 용액을 천천히 위아래로 펌핑하여 혼합합니다. TNB 완충액을 준비할 때는 저어주면서 블로킹 시약을 소량씩 천천히 첨가합니다. 그 후 항온수조를 사용하여 용액을 55 °C로 가열합니다.용액이 우윳빛으로 변할 것입니다. 이제 조직 작업을 시작하기 위해, 먼저 메스를 사용하여 조직 절편 주변의 과잉 OCT를 제거하십시오. 그런 다음 пап 펜을 사용하여 각 절편의 경계를 표시하십시오.슬라이드를 실온 상태로 둡니다. 그런 다음 실온의 1x PBS 버퍼로 3회 세척하며, 각 세척 시간은 5분으로 합니다. 다음으로, 슬라이드를 얼음처럼 차가운 0.3% 메탄올 내 과산화수소 용액에 30분 동안 배양하여 내인성 peroxidase 활성을 억제합니다.이어서 실온의 PBS에서 5분씩 3회 세척합니다. 그런 다음 조직을 투과성 있게 만들기 위해 슬라이드를 PBST에 10분 동안 배양합니다. 이번에는 TNT로 슬라이드를 3회 세척합니다.이제 습윤 챔버 내에서 각 슬라이드가 잠길 정도의 충분한 양의 TNB를 사용하여 조직을 블로킹합니다. 상온에서 30분 동안 블로킹을 진행하십시오. 슬라이드가 마르지 않도록 주의하십시오.블로킹 버퍼를 완전히 제거한 후, 트레이서와 결합시키기 위해 TNB에 희석한 1차 항체로 슬라이드 전체를 덮습니다. 실온에서 2시간 동안 또는 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 1차 항체를 제거하기 위해, 실온에서 TNT로 슬라이드를 3회 세척하며, 각 세척 단계는 5분 동안 수행합니다.이 세척 과정 동안 가볍게 흔들어 줍니다. 다음으로, 절편을 2차 항체 용액에서 1시간 동안 배양합니다. 이후 실온에서 TNT 세척을 3회 수행하여 결합되지 않은 2차 항체를 제거합니다.그 후 가습 챔버에서, TNT로 슬라이드를 세척하는 동안 TNB 내의 1:100으로 희석된 stripped havein 결합 horseradish peroxidase 용액에 조직을 넣고 상온에서 30분 동안 배양합니다. 배양 후, TSA 용액을 새로 희석합니다. 이제 새로 만든 TSA 희석액을 조직에 처리하고 상온에서 정확히 10분 동안 둡니다.TSA 배양 시간의 정밀한 조절이 매우 중요합니다. 따라서 한 번에 너무 많은 슬라이드를 처리하지 마십시오. 한 단계에서 최대 10장의 슬라이드까지 처리할 수 있습니다.추가 슬라이드는 다음 세척 단계를 거쳐 처리될 때까지 TNT 세척 버퍼에 보관할 수 있습니다. 조직을 1:500으로 희석한 Alexa Fluor 546 streptavidin conjugate가 포함된 TNB에서 30분 동안 배양하십시오.실온에서, 세 번의 TNT 세척을 더 실시하여 스트립된 habitant 접합물을 제거합니다. 그 다음 핵 염색을 위해, PBS 내의 5% BIS benza 용액을 실온에서 10분 동안 처리하고, 세 번의 TNT 세척으로 BIS benzo 염색약을 제거합니다. 이후 fluoro Mount G로 슬라이드를 마운트하고 분석을 진행합니다.설명된 프로토콜을 사용하여 R 26 BIZ 및 R 26 GTT 대립유전자를 보유한 생쥐에서 생식축을 조절하는 신경 회로의 성숙도를 분석하였습니다. 트랜스유전자의 발현은 Kisspeptin 특이적 creed 드라이버 라인을 사용하여 궁상핵의 배아 kisspeptin 뉴런에서 creed 의존적 재조합에 의해 활성화되었습니다. kiss. IC R 26 BIZ에서 kisspeptin은 녹색으로, BL은 적색으로 나타낸 이중 면역형광 염색 결과입니다.마우스의 KISS IC R 26 GTT 모델에서 BL의 활성화가 관찰됩니다. 이중 면역형광 염색 결과, KISSPEPTIN은 녹색으로, Cree 드라이버에 의해 활성화된 GTT는 적색으로 나타납니다. 이러한 진단 결과와 기타 분석을 통해 E 18.5 실험 배아에서 트랜스진이 기능적임이 입증되었습니다. 궁상핵의 Kisspeptin 뉴런은 이미 GNRH와 통신하고 있음이 확인되었습니다.Z가 결핍된 뉴런은 kisspeptin을 발현하는 CRE 뉴런으로 국한되었으나, BL은 시냅스 간 전이를 통해 상위 및 하위 뉴런으로 전달되었습니다. 모든 GNRH 뉴런은 아니었으나, 일부 GNRH 뉴런에서 BL이 검출되었습니다.따라서 배아 GNRH 뉴런의 일부만이 궁상핵 kisspeptin 뉴런과 시냅스로 연결되어 있습니다. GNRH 뉴런에서는 역행성 추적자가 검출되지 않았습니다. GTT는 이러한 뉴런들이 kisspeptin 뉴런의 하위에 있음을 입증합니다.이 기술을 숙달하면 본 절차에 따라 하루 만에 수행할 수 있습니다. 연결된 뉴런의 생화학적 특성을 식별하기 위해 이중 면역형광법과 같은 다른 방법들을 활용할 수 있습니다. 이 기술은 신경과학 및 발생생물학 분야의 연구자들이 발생 과정과 성체 동물 모두에서 단일 세포 해상도로 신경 연결성을 탐구할 수 있는 길을 열어줄 것입니다.이 영상을 시청한 후, 여러분은 생쥐의 신경 회로 형성 및 성숙 과정을 시각화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

개발 뇌 마우스로 유전자 전송 방법은 고유한 수술 방법과 전극의 특별한 모양을 사용하여 설명합니다. 이 독특한 기술은 두뇌 개발을 공부에 많은 도움이됩니다 neuroscientists temporally과 공간 플라스미드 DNA의 transfection 수 있습니다.

마우스 Utero에 Electroporation : 통제 Spatiotemporal 진 Transfection

이 문서에서는 자세히 utero에서 대뇌 피질과 생쥐의 E14.5에서 해마를 electroporate하는 프로토콜을 설명합니다. 또한이 두 대뇌 지역에서 dendrites 및 쪽이을 연구하는 귀중한 방법임을 보여줍니다.

사용하는 마우스 대뇌 피질과 해마의 시각화 및 Dendrites와 쪽이의 유전자 조작<em&gt; utero에서</em&gt; Electroporation

synaptically 연결 뉴런을 추적하는 방법이 설명되어 있습니다. 우리는 관심의 세포 인구가 유전자 정의 셀 유형에서 시냅스 입력을 받고 있는지 여부를 조사하기 위해 상류 세포의 TVA의 특이성을 사용합니다.

유 전적으로 정의 된 신경 회로의 추적 바이러스

출처: Denaxa, M., el al., 초기 출생 후 마우스 뇌에 화학유전적으로 조작된 피질 중간 뉴런 전구 세포의 이식. J. Vis. 경험. (2019년)이 비디오는 관심 유전자를 운반하는 플라스미드 벡터를 배아 뇌 절편의 중간 뉴런 전구 세포에 주입한 후 플라스미드 진입 및 유전자 발현을 위한 전기천공법을 시사하는 절차를 보여줍니다. 이러한 변형된 전구 세포는 나중에 뇌 장애 치료에 사용될 수 있습니다.

마우스 피질 중간 뉴런 전구세포에서 아가로스 포매 전기천공 보조 유전자 전달

발달 신경 생물학의 근본적인 문제는 어떻게 신경 네트워크가 배아 뇌에 설립되어있다. 여기에서 우리는 크레 / 훈제 연어 - 플라스미드와 지느러미의 interneurons 레이블을 다양한 발달 단계에서 자신의 축삭 돌기 시냅스 목표를 추적하는 조류 후뇌의 PiggyBac 매개 DNA 전위 시스템과 같은 새로운 유전 도구와의 electroporation 기술을 결합했다.

병아리 배아에서 축삭 궤적과 시냅스 대상을 추적하는 후뇌의 일렉트로

시상 하부의 기능 및 의료 중요성에도...

마우스의 유전자 조작을 통해 시상 하부 개발<em&gt; 자궁 내</em&gt; 일렉트로

우리는 체외 준비를 사용하여 뇌의 핵에 선행 성 또는 역행 추적 주사를 통해 신경 세포와 그 프로세스 레이블을하는 기술에 대해 설명합니다. 우리는 내가 N 표시 정확도를 높이기 위해 유리의 형광 표지 된 마우스 돌연변이 및 기본 광학 기기를 복용하여 추적 전기를 체외의 기존 방법을 수정했습니다.

레이저 유도 신경 세포의 추적에서 뇌 외식

이 프로토콜은 방사형으로 이동하는 피질 뉴런의 직접 관찰에 대한 지침을 제공합니다. utero electroporation, organotypic 슬라이스 문화, 그리고 시간 경과 공 촛점 이미징은 결합 뉴런에 관심 유전자의 overexpression 또는 downregulation의 효과를 직접적이고 동적으로 연구하고 개발하는 동안 그들의 차별을 분석합니다.

배아 마우스 두뇌의 organotypic 슬라이스 문화에서 마이 그 레이션 뉴런의 저속 공 촛점 이미징<em&gt; Utero에서</em&gt; 일렉트로 포 레이션

두뇌에 있는 유전자의 세포 자치 기능 손실을 유도 하 여 공부 될 수 있다 또는 셀의 스파스 인구에 있는 기능을 얻을. 여기, Cre recombinase 함수 비보의 손실에 floxed 유전자와 대뇌 피 질의 뉴런 개발의 부족 인구에 제공 electroporation utero에서 설명 합니다.

Cre lox 재결합 Electroporation Utero에 통해 마우스 대뇌 피 질에서 유도

전송 전자 현미경 검사 법 및 utero에서 변환의 조합을 개발 하는 동안 신경 시스템의 정밀한 열 대권 외의 형태학 적 변화를 공부에 대 한 강력한 접근 이다. 이 결합 된 메서드는 그들의 지형 표현에 관하여 neuroplasticity 기본 구조 세부 사항에 변화에 대 한 깊은 통찰력을 수 있습니다.

평가의 개발 쥐의 뇌와 척수의 Utero 변환 후 Ultrastructural Neuroplasticity 매개 변수

대뇌 피질이 발달하는 동안 뉴런과 신경교세포는 심실 내벽의 심실 영역에서 시작하여 뇌 표면으로 이동합니다. 이 과정에는 많은 유전자가 관여합니다. 이 프로토콜은 이동하는 뉴런과 신경교세포 전구세포의 타임랩스 이미징 기술을 소개합니다.

배아 마우스 뇌 절편에서 이동하는 뉴런 및 신경교세포 전구세포의 타임랩스 이미징

배우세요 배아 마우스 뇌에서 신경 회로 발달을 시각화하는 유전자 인코딩 횡시냅틱 추적자 방법. 단일 세포 해상도로 상류 및 하류 뉴런을 식별하여 발달 신경과학의 핵심 질문에 답합니다.

배아 마우스의 뇌에 추적 조건부 유전 Transsynaptic

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