배아 마우스의 뇌에 추적 조건부 유전 Transsynaptic

다음 실험의 목표는 양방향으로 이동하는 트랜스 시냅스 트레이서(trans synaptic tracer), 역행 방식으로만 이동하는 두 번째 트레이서, 표적 세포에서 이동하지 않는 세 번째 라벨을 사용하여 세 가지 별개의 세포 라벨링 시스템을 사용하여 배아 마우스 뇌의 신경 회로 발달을 시각화하는 것입니다. 표적 뉴런, 업스트림 뉴런, 다운스트림 뉴런을 식별할 수 있습니다. 결과는 이 실험 프로토콜이 단일 세포 해상도에서 배아 여성 마우스 뇌의 신경 회로 형성을 분석하는 데 사용될 수 있음을 보여줍니다.

이 방법은 특정 신경 회로가 언제 형성되고 배아 발달 중에 어떻게 구성되는지와 같은 발달 신경 과학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 성인 마우스의 신경 회로를 추적하는 데에도 사용할 수 있습니다. 구체적으로, 유전적으로 확인된 뉴런 간의 시냅스 활동을 분석하는 데 사용할 수 있으며 시간이 지남에 따라 다양한 실험 조건이 신경 회로를 어떻게 조절할 수 있는지 분석하는 데 사용할 수 있습니다.

방금 안락사된 임신한 쥐부터 시작하십시오. 70% 에탄올로 복부의 복부 쪽을 청소한 다음 수직 절개를 하여 배아를 노출시킵니다. 배아 사슬을 제거하고 접시에 담긴 얼음처럼 차가운 PBS 접시로 옮깁니다.

뭉툭한 집게를 사용하여 개별 배아를 제거합니다. 가는 가위와 집게를 사용하여 용액 속의 개별 배아를 분리하고, 배아가 완전히 씻겨졌을 때 그 과정에서 여분의 조직을 제거합니다. 각 배아에서 작은 꼬리 생검을 채취하여 용해 완충액 튜브에 넣어 성별 식별 및 유전형 분석을 위한 DNA를 수집합니다.

그런 다음 배아를 갓 만든 얼음 위의 차가운 얼음 4%PFA로 옮깁니다. 각 배아를 처리한 후 크기에 따라 최소 1.5시간 동안 교반하면서 PFA에서 배양합니다. 배양이 완료되면.

고정된 조직을 얼음처럼 차가운 PBS로 세척할 때마다 최소 5분 동안 세 번 세척합니다. 그런 다음 배아를 섭씨 4도로 유지되는 30% 자당 용액으로 옮깁니다. 조직이 용액에 완전히 가라앉으면 냉동 절편을 진행합니다.

먼저, 영구적인 알코올 내성 마커를 사용하여 극저온 주형에 라벨을 붙이는 것으로 시작합니다. 다음으로, 얼음 양동이에 100% 에탄올을 넣은 분쇄된 드라이아이스 슬러리를 ISO 펜탄의 유리 비커를 약 10분 동안 냉각시켜 냅니다. 기다리는 동안 자당 용액에서 조직을 제거하고 표준 실험실 물티슈로 여분의 자당을 닦아냅니다.

그런 다음 조직을 사전 라벨링된 극저온 주형으로 옮깁니다. 조직을 덮을 수 있을 만큼 충분한 OCT가 있습니다. OCT에서 특히 조직 주변에 기포를 형성하지 마십시오.

다음으로, 깃털 무게 곤충학 겸자를 사용하여 손상을 최소화하도록 조직의 방향을 지정합니다. 필요한 경우 물이 튀지 않도록 냉각된 iso pentane bath에서 극저온 주형을 동결합니다. 얼어붙은 주형은 주형을 절단하기 위해 섭씨 영하 80도에서 싸서 보관할 수 있습니다.

14미크론 두께의 직렬 섹션으로 5개씩 직렬로 자릅니다. 슈퍼 프로스트 플러스 유리 슬라이드에서 각 5 개의 슬라이스 시리즈를 수집하십시오. 이 프로토콜에 대한 솔루션을 준비할 때는 새로 준비해야 하는 TNT 버퍼에 트윈 20을 천천히 추가해야 합니다.

그런 다음 용액을 천천히 위아래로 세척하여 혼합합니다. TNB 완충액을 준비할 때 교반하면서 차단 시약을 조금씩 천천히 첨가합니다. 그런 다음 수조를 사용하여 용액을 섭씨 55도까지 가열합니다.

용액은 유백색이 될 것입니다. 이제 조직에 대한 작업을 시작하려면 먼저 메스를 사용하여 조직 섹션을 둘러싼 과도한 OCT를 제거합니다. 그런 다음 팝 펜을 사용하여 각 섹션의 경계를 표시합니다.

슬라이드를 실온에 두십시오. 그런 다음 실온에서 하나의 XPBS 버퍼로 세척하고 각 세척은 5 분 동안 지속되어야합니다. 다음으로, 얼음처럼 차갑고 메탄올에 0.3%의 과산화수소를 담금질하여 슬라이드를 30분 동안 배양하여 내인성 과산화효소 활성을 억제합니다.

그런 다음 PBS에서 실온에서 세탁할 때마다 5분 동안 세 번 세탁합니다. 그런 다음 PBST에서 10분 동안 슬라이드를 배양하여 조직에 침투시킵니다. 이번에는 TNT로 슬라이드를 세 번 씻습니다.

이제 가습 챔버에서 각 슬라이드를 덮을 수 있을 만큼 충분한 TNB의 조직을 차단합니다. 블록을 실온에서 30분 동안 그대로 두십시오. 슬라이드가 마르지 않도록 하십시오.

차단 버퍼를 배출한 후 TNB의 1차 항체로 슬라이드를 완전히 덮어 추적자와 결합합니다. RT에서 2시간 동안 또는 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 1차 항체를 제거하려면 TNT로 슬라이드를 실온에서 세척할 때마다 5분씩 3회 세척합니다.

이 세척 중에는 약간 부드럽게 저어줍니다. 다음으로, 2차 항체 용액의 절편을 한 시간 동안 배양합니다. 나중에 실온에서 TNT를 세 번 세척하여 결합되지 않은 2차 항체를 제거합니다.

그런 다음 가습 된 챔버에서 TNT의 슬라이드를 세척하면서 실온에서 30 분 동안 TNB에 100 개의 벗겨진 havein 공액 마무 peroxidase의 조직을 배양합니다. 배양 후 TSA 용액을 새로 희석하십시오. 이제 갓 만든 TSA 희석액을 실온에서 정확히 10분 동안 조직에 바릅니다.

TSA 배양의 정확한 타이밍이 중요합니다. 따라서 한 번에 너무 많은 슬라이드를 처리하려고 하지 마십시오. 한 번에 최대 10개의 슬라이드를 처리할 수 있습니다.

추가 슬라이드는 또 다른 세척 후 처리될 때까지 TNT 세척 버퍼에서 대기할 수 있습니다. 1-500 Alexa floor 5 46 박리로 조직을 배양합니다. TNB에서 30분 동안 접합체에 넣으십시오.

실온에서 벗겨진 서식지 접합체를 TNT 수조를 3회 더 제거합니다. 그런 다음 핵 염색의 경우 실온에서 PBS에 5 % BIS 벤자 용액을 10 분 동안 적용하고 3 회 TNT 세척으로 BIS 벤조 얼룩을 제거합니다. 그런 다음 플루오로 마운트 G로 슬라이드를 장착하고 분석을 진행합니다.

기술된 프로토콜을 사용하여, R26 BIZ 및 R 26 GTT 대립유전자를 보유한 마우스에서 생식축을 조절하는 신경회로의 성숙을 분석하였다. 전이유전자의 발현은 키스펩틴 특이적 신조 드라이버 라인, 키스펩틴에 대한 키스펩틴에 대한 이중 면역형광을 사용하여 아치형 핵의 배아 키스펩틴 뉴런에서 신조 의존적 재조합에 의해 활성화되었고, 키스로부터 빨간색의 키스펩틴은 BL이었다. IC R 26 사업.

마우스는 KISS IC R 26 GTT에서 BL의 활성화를 보여주고, 마우스 이중 면역 형광은 KISSPEPTIN을 녹색으로, GTT는 Cree 드라이버에 의해 활성화됨을 빨간색으로 표시합니다. 이러한 진단과 다른 진단은 전이유전자가 E 18.5 실험 배아에서 기능한다는 것을 입증했습니다. 아치형 핵(arcuate nucleus)에 있는 그의 페핀 뉴런(pepin neuron)은 이미 GNRH와 소통하고 있는 것으로 밝혀졌습니다.

뉴런 결핍 Z는 키스펩틴 뉴런을 발현하는 CRE에 국한된 반면, BL은 상류 및 하류 뉴런으로 시냅스적으로 전달되었습니다. 일부이지만 전부는 아닙니다. GNRH 뉴런은 bl을 포함했습니다.

따라서 배아 GNRH 뉴런의 하위 집합만이 아치형 핵 키스펩틴 뉴런에 시냅스적으로 연결되어 있습니다. GNRH 뉴런에는 역행 추적자가 포함되어 있지 않았습니다. GTT는 이러한 뉴런이 키스펩틴 뉴런의 다운스트림에 있음을 보여줍니다.

이 기술을 숙달하면 이 절차에 따라 하루 만에 수행할 수 있습니다. 이중 면역형광과 같은 다른 방법을 사용하여 연결된 뉴런의 생화학적 특성을 식별할 수 있습니다. 이 기술은 신경 과학 및 발달 생물학 분야의 연구자들이 발달 과정과 성인 동물 모두에서 단일 세포 해상도로 신경 연결을 탐구할 수 있는 길을 열어줄 것입니다.

이 비디오를 시청한 후에는 마우스에서 신경 회로의 형성과 성숙을 시각화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.