Zebrafish의 각막 실질 세포의 Explants는 피부 상처 치유에 집단 셀 마이그레이션 및 재 상피화을 연구하는

이 절차의 전반적인 목표는 집단 세포 이동 및 상피 상처 치유 연구에 사용하기 위해 제브라피시 각막세포의 엑스플랜 배양을 확립하는 것입니다. 이것은 먼저 마취된 성인 제브라피시에서 상피 조직이 부착된 비늘을 제거함으로써 수행됩니다. 조직이 부착된 비늘을 배양 접시에 넣어 세포가 부착할 수 있도록 합니다.

그런 다음 실험 설계에 의해 표시된 모든 처리와 함께 배양 배지가 추가됩니다. 마지막으로, 세포를 배양하고 원하는 기간 동안 비디오 현미경으로 관찰합니다. 궁극적으로, 다양한 분석을 사용하여 이동 또는 세포 형태의 변화뿐만 아니라 시간 경과에 따른 단백질 또는 기타 마커의 발현을 입증할 수 있습니다.

형질전환 세포 배양 방법과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 외식 배양이 일차적이며 in vivo의 세포 특성과 밀접하게 재조립된다는 것입니다. 이 방법은 집단 이동의 역할 및 상피에서 중간엽으로의 전이와 같은 상피 상처 치유 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개체는 비늘이 성장 표면에 부착되지 않거나 주어진 배양 접시에서 자라지 못할 수 있기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.

이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 선임 연구원인 Jose Rap PanIN 의대생인 Chana TI와 Agnes Pasquale입니다. 이 실험을 준비하기 위해 상업용 탈염소제를 사용하거나 물을 24시간 동안 그대로 두어 약 1.5리터의 수돗물을 염소 처리한 다음 500밀리리터를 사용하여 1리터 비커 3개를 각각 채웁니다. 어떤 절차를 밟기 전에 물고기를 잡기 위한 비커 하나와 세 번째 비커로 회수하기 위한 두 번째 비커에 라벨을 붙입니다.

트리카 밀리리터당 100마이크로그램을 추가합니다. 생선을 마취시키려면 얕은 쟁반에 얼음을 채웁니다. 배양 배지를 실온으로 데우고 깨끗한 보석상 핀셋을 모으십시오.

팁을 70% 에탄올에 담그고 분젠 버너에 통과시켜 핀셋을 청소하여 에탄올이 타도록 합니다.원하는 수의 물고기를 잡고 보관 비커에 넣습니다. 물고기 한 마리를 마취 비커로 옮깁니다.

텍스트 프로토콜에 따라 물고기를 마취한 후 얼음으로 옮기고 꼬리가 핀셋을 잡고 있는 손을 향하도록 수평으로 놓습니다. 비늘을 제거하려면 핀셋을 물고기와 평행하게 놓습니다. 끝을 비늘 가장자리에 놓고 핀셋의 평평한 면을 물고기 옆으로 약간 눌러 비늘이 물고기 몸체에서 올라오도록 합니다.

핀셋을 사용하여 저울을 잡은 다음 뽑아서 뒤집지 않고 조직 배양 접시에 넣습니다. 절차를 반복하여 큰 성인에서 최대 12개의 비늘을 제거하고 아가미 영역, 측선 및 지느러미를 피합니다. 물고기를 회복 비커에 넣고 마취 효과에서 회복되었는지 확인합니다.

그런 다음 물고기를 개별 수조로 옮기고 물고기가 21일 동안 회복되도록 하여 완전한 스케일 재생이 가능하도록 합니다. 실험에 따라 플라스틱당 최대 20개의 저울을 놓습니다. 35mm 조직 배양 처리 접시 또는 유리당 4-6 개의 저울.

바닥 접시, 각 배양 접시에 1.2ml의 완전한 배지를 부드럽게 추가하기 전에 비늘이 접시에 부착되도록 합니다. X explan 배양물을 섭씨 28도에서 원하는 기간 동안 배양하여 현미경 검사를 수행하기 위한 처리 유무에 관계없이 수행합니다. 인큐베이터에서 세포 시트가 들어 있는 접시를 꺼낸 후 현미경 스테이지에 놓습니다.

4x 대물렌즈를 사용하여 초기에 초점을 맞추면 시간이 지남에 따라 이미지를 쉽게 촬영할 수 있습니다. 스테이지에서 각 셀 시트의 위치 및/또는 접시의 방향을 표시합니다. 실험 프로토콜에 따라 다양한 시점에서 세포 시트를 촬영하고, 실험에 정지 이미지만 필요한 경우 인큐베이터에 다시 넣습니다.

면역형광 현미경 검사용 샘플을 고정하려면 실온에서 용액을 준비하고 예열합니다. 형광 하에서 OSE 부위를 보려면 이 비디오의 앞부분에서 설명한 대로 유리 바닥 35mm 접시 배양 접시를 사용하여 가지를 재배하고 배양 배지를 제거하지 않고 각 접시에 1.1 XPBS에 0.8ml의 4%파라알데히드를 추가합니다. 실온에서 5분 동안 배양합니다.

그런 다음 용액을 흡입합니다. 각 접시에 0.8ml의 고정제를 추가로 추가하고 두 번째 5분 배양 후 용액을 흡입합니다. 외부 리간드 또는 에피토프를 사용하지 않는 한, 5분 동안 XPBS 배양 1회에 0.2%TRITTON X 100 0.5ml를 추가하여 세포를 투과합니다.

용액을 제거하기 전에 XPBS 1개에 0.5ml의 1%BSA를 첨가하고 배양 후 하룻밤 동안 실온에서 1시간 또는 섭씨 4도에서 배양한 후 용액을 흡인하고 항체 염색을 진행합니다. 또는 XPBS 1개에 1-2mL의 1%BSA를 첨가하고 섭씨 4도에서 3-4주 동안 보관합니다. 면역 형광을 실시합니다.

여기에 설명된 텍스트 프로토콜에 따르면, 각막 세포의 시트가 EXPLAN 배양을 확립한 후 몇 시간 이내에 스케일 아래에서 이동하는 것을 관찰할 수 있습니다. 때때로, 집단적으로 이동하는 시트에서 떨어져 나온 개별적으로 이동하는 각질 세포가 관찰될 수 있습니다. 시트 진행의 초기 속도는 매우 빠르지만, 배양의 첫 48시간 동안 세포가 확산됨에 따라 이 속도가 빠르게 느려집니다.

형광 EDU로 24시간 동안 표지한 후 약 10%의 세포가 형질전환된 세포주에서 볼 수 있는 것보다 훨씬 낮은 세포 분열의 증거를 보여주기 때문에 급격한 증가는 세포 증식과 관련이 없습니다. X 엑스플랜이 확립될 때 치료가 추가되면 일부 화합물은 집단 세포 이동을 변경합니다. 예를 들어, 여기에서 볼 수 있듯이 일부 MMP 억제제는 24시간 후에 세포 시트 면적을 감소시킵니다.

배양에서 펩타이드를 함유한 용해성 RGD를 배양 배지에 첨가하여 접착 형성을 방해하면 시트의 앞쪽 가장자리에 있는 절름발이가 급격히 줄어들고 이어서 시트의 앞쪽 가장자리가 분리 및 수축되고 시트 내 또는 리터 및 팔로워 세포 내에서 단백질의 국소화를 평가하는 데 2분 미만이 소요됩니다. 이 그림과 같이 전체 시트를 고정하고 염색 할 수 있습니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행되면 10-15분 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안, 이 절차를 따라 cyte가 배양 접시에 부착될 시간을 허용한 후에만 prewarm culture media를 추가하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

QPCR과 같은 다른 방법은 시간 및/또는 치료 조건과 관련된 유전자 발현의 변화와 같은 추가 질문에 답하기 위해 수행할 수 있습니다. 이 절차를 보고 나면 다양한 절차에서 사용할 IDE explan culture를 설정하는 방법을 훨씬 더 잘 이해할 수 있을 것입니다.