Name: 신경 질환의 연구에 대한 생성 및 사용 hiPSC 파생 NPC들에 가이드 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: 학습하세요 hiPSC에서 신경전구세포(NPC)를 분화시키는 방법을 통해 신경질환의 세포 및 분자 메커니즘을 연구하는 기술입니다. 이 프로토콜은 확장 가능한 NPC 집단을 생성하여 유전자 조작 및 다양한 세포 표현형 분석을 가능하게 합니다.

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Kristen Brennand는 뉴욕 줄기세포 재단(New York Stem Cell Foundation)의 Robertson 연구원입니다. 브레넌트 연구소는 Brain and Behavior Young Investigator Grant, National Institute of Health(NIH) 보조금 R01 MH101454 및 New York Stem Cell Foundation의 지원을 받습니다.

1. hiPSC 차별화 신경 전구 세포에 <ol><li> 성장과 인간 배아 줄기 세포에서 hiPSCs을 확장 (HES) 미디어 (표 1) 공동 배양 마우스 배아 섬유 아세포 (MEF) 큰 (그러나 subconfluent) 식민지가 배아 체 (EB) 중간 통해 신경 차별화를위한 준비가 될 때까지 세포층에 (그림 2). 루틴 hiPSC 배양 조건은 다른 웰 (16, 17) 기재되어 있고; 3 매 7 일마다 : 잠깐, 합류 할 때까지 MEF 피더 레이어에 HES 미디어에서 hiPSCs 성장, 후 효소 콜라게나 제 (DMEM에 1 ㎎ / ㎖)와 통로는 약 1 확장합니다. </li><li> 폴리 -L- 오르니 틴 (유리 표면에 50 ㎍ / ㎖) 플라스틱 표면에 대한 멸균 ㎖ / 10g과 폴리 -L- 오르니 틴 / 라미닌 코팅 플레이트, 코팅 플레이트를 준비하고, 3-24 시간 동안 RT에서 배양. 3-24 시간 동안 실온에서 멸균 PBS에 5g / ml의 라​​미닌과 멸균 후 코트에 한 번 이상 세척 할 것. 참고 : 플라스틱에 싸여 경우, 플레이트가 될 수 있습니다6 개월까지 -20 ºC 저장. </li><li> 1 일에, 효소 DMEM / F12에 1 ㎎ / ㎖ 콜라게나 제 IV를 사용하여 플레이트 큰 식민지에서 (예를 Matrigel에 TeSR 18 정의 미디어에서 재배 일반적으로 MEFs에 성장, 또는 hiPSCs) subconfluent hiPSCs를 들어 올립니다. 참고 : 37 ºC에서 배양 1-2 시간 후, 식민지는 접시에 떠있는 것입니다. </li><li> 조심스럽게 DMEM / F12, 2 ㎖ / 웰의 N2 / B27 미디어 (표 1)과 비 부착 6 잘 요리로 전송에 재현 탁과 1-2X를 (안 원심 분리, 침전에 의해) hiPSC 식민지를 씻어 (1으로 3 우물을 결합 - 음) 19. 참고 : 숙박, 식민지 부동 구형 클러스터를 형성 할 것이다 &quot;는 배아 체&quot;(사채)를 지칭. 상당한 세포 죽음을 기대합니다. </li><li> 그리고 2 일, 틸트 판에하는 사채가 정착 할 수 있습니다. 조심스럽게 미디어를 제거하고 이물질을 제거하는 DMEM / F12 한 번 씻는다. N2와 피드 / 듀얼 SMAD 억제제 (0.1M LDN193189 및 10M SB431542) (12)로 보충 B27 미디어를 </&gt; SUP. </li><li> 3-7 일에, neuralization 듀얼 SMAD 억제의 맥락에서 발생합니다; 사채 라운드 만 낭포 성이 아닌지 확인합니다. 사채 0.1M LDN193189과 10M SB431542 보충 N2 / B27 미디어를 격일로 공급. </li><li> 신경 로제트는 (apico - 기초 극성 neuroepithelial 세포의 원형 클러스터 특징 몇 일 이내에 나타나기 시작하는 일 7-14에서 코팅 된 플레이트 폴리 -L- 오르니 틴 / 라미닌에 사채의 도금 다음, 시야 현미경을 이용하여 확인; 그림 1). 부착 사채 0.1M LDN193189, 10M SB431542 및 1g / ㎖ 라미닌 보충 N2 / B27 미디어를 격일로 먹이를 계속합니다. </li></ol> 신경 근엽 2. 수확 참고 : 우리는 신경 근엽이 효소 신경 장미 선택 시약 (20) 또는 유사한 선택 시약을 사용하여 수확하는 것이 좋습니다. 신경 로제트 수동 6 자 폴리 -L- 오르니 틴 / 라미닌 코팅 플레이트, 생에 뽑힐 수 있지만의 방법론은 더 NPC들에 대한 풍부하고 비 신경 세포 유형을 고갈 하루 20 따기의 두 번째 라운드가 필요할 수 있습니다, 사용자의 기술에 의존, 마스터에 광범위한 교육을 받아,. <ol><li> 14 일에 신경 로제트의 효소 선택, 접착 사채에서 흡인 미디어는 6 웰 플레이트에 잘 당 신경 장미 선택 시약 1 ㎖를 추가합니다. 1 시간 37 ºC에서 품어. </li><li> P1000의 pipetman으로, 부드럽게 각 우물에서 효소를 제거합니다. 씻어 잘 당 DMEM / F12 1 ML을 추가합니다. </li><li> P1000과 함께, DMEM / F12의 1 ㎖의를 수집하고 신속 따라서 판에서 로제트를 분리, 우물에 다시 DMEM / F12을 추방. 팔콘 튜브에 로제트를 수집합니다. </li><li> 피펫 다른 한 DMEM / F12 ml의 신속 남은 로제트를 분리하기 위해 같은 우물에 추방. (씹다하지 마십시오. 장미 집계를 나누는 않도록한다). 같은 팔콘 튜브에 신경 로제트를 수집합니다. </li><li> 단계를 반복하여 필요에 따라 2.4. 로제트가 쉽게 분리되지 않는 경우, 미주리 추가효소를 다시하고 같은 과정을 반복 (2.1-2.4 단계) </li><li> 3 분 동안 300 XG에서 세포를 스핀. 기음 세척 및 NPC 미디어 (표 1) 2 ㎖에 로제트를 다시 일시 중지합니다. 전송 세포 (1 : 1)로 폴리 -L- 오르니 틴 / 라미닌로 6 웰 플레이트를 코팅. </li><li> 일 15-21에서 신경 근엽은 확장됩니다; 공급 로제트 NPC 미디어와 격일. </li><li> 신경 로제트의 품질을 평가하고 평평한 섬유 아세포와 같은 세포가 문화 내에서 확장되지 않도록. 참고 : 비 로제트가 지속되면, NPC 문화 때때로 Accutase에 집어 근엽 만 최선을 선택, 수동 따기에 의해 회수 할 수있다. 37 ºC에서 15 분을 떼어 놓다. 펠렛, 세척 및 NPC의 미디어 판 (24) 웰 폴리 - L - 오르니 틴 / 라미닌 코팅 된 판에. </li></ol> 신경 전구 세포의 3. 확장 참고 : hiPSC의 NPC Matrigel- 또는 폴리 -L- 오르니 틴 / 라미닌 코팅 된 플레이트 중 하나에 성장시킬 수있다. 우리는 일반적으로 Matrige를 사용L 플레이트들이보다 신속하게 준비하고 저렴한 비용으로 할 수있다. <ol><li> 빨리, 마트 리겔 코팅 된 플레이트를 준비 해동 24 ml의 마트 리겔의 1mg의 냉동 나누어지는을 재현 탁 차가운 DMEM / F12을 즉시 2 ~ 6 웰 플레이트의 각 웰에 2 ㎖를 배포합니다. 37 ºC에서 적어도 1 시간 동안 품어. 참고 : 마트 리겔은 사용하기 직전에, 세척하지, 흡입 될 필요가있다. </li><li> 격일의 NPC를 공급하고 매우 높은 밀도로 유지하거나 자발적으로 신경 세포로 분화됩니다. 참고 : 비록 더 설립의 NPC는 일반적으로 1 분할 : 2로 자주으로 2 주에 1 회 : 매주 4, 매우 낮은 통로의 NPC 1을 분할 할 수있다. </li><li> 분할 먼저 대기음 미디어와 6 웰 플레이트의 웰 당 1 ml의 따뜻한 Accutase (1X)를 추가합니다. 10 ~ 15 분 동안 37 ºC에서 품어. </li><li> 부드럽게 가능한 적은 기계적 스트레스 DMEM / F12를 함유하는 15 ㎖의 튜브에 분리 된 세포를 옮긴다. 효소에있는 동안 세포를 적정하지 마십시오. spinni에 의해 펠렛 세포5 분 동안 1,000 XG에 ng를. </li><li> 세척을 대기음, 원래 잘 당 ~ 1 ml의 NPC 미디어에서 NPC가 다시 중단의 6 자. 참고 : 6 잘 접시의 합류 우물 5-10000000 세포를 가지고 기대; 이것은 종래 hematocytometer를 재 도금을 이용하여 세포의 분취 량은 10L를 카운팅함으로써 확인 될 수있다. </li><li> NPC의 신경 세포 또는 neurosphere를 같이 다시 정지, 재 판 NPC가 다음. 6 웰 플레이트의 웰 당 약 1-2000000 세포를 플레이트, 엔피씨을 유지합니다. neurosphere 형성의 효율은 실험 세포주 사이에서 다양하지만, 200,000 내지 1,000,000 세포를 미부착 된 6- 웰 플레이트의 웰 당 시딩하는 경우 가장 일반적으로 발생할 수있다; neurosphere를의 응집이 발생하는 경우, 시드 세포의 수를 감소시킨다. 신경 매체와 NPC 미디어를 교체 6 웰 플레이트의 웰 당 신경 세포로 분화하는, 판 약 20 만 세포. </li><li> 면역 조직 화학 염색 모든 설립 NPC 라인을 확인합니다. 일단 충분한 세포 물질이있다 EXPAN네 스틴 및 SOX2에 대한 항체 DED, 라벨의 NPC. 검증 NPC 라인도 4-6주에 대한 신경 세포로 분화, 및 III-튜 불린과 MAP2AB에 대한 항체로 표시되어야합니다. <ol><li> 10 분 동안 4C으로 PBS 중의 4 % 파라 포름 세포를 고정. PBS 중 1.0 % 트리톤 15 분 동안 RT에서의 NPC를 Permeabilize 하시려면 다음 실온에서 30 분 동안 0.1 % 트리톤으로 5 % 당나귀 혈청 차단. </li><li> 밤새 4C에서 0.1 % 트리톤 (Triton)와 5 % 당나귀 혈청 차 항체로 품어. 참고 : 우리는 다음과 같은 항체를 추천 : 염소 항 - SOX2, 1 : 200; 마우스 항 인간 네 스틴, 1 : 200; 토끼 항 - 튜 불린 βIII, 1 : 500; 마우스 항 - 튜 불린 βIII, 1 : 500; 마우스 항 MAP2AB, 1 : 200. (그림 2). </li><li> 실온에서 1 ~ 2 시간 동안 0.1 % 트리톤과 5 %의 당나귀 혈청, 300 : PBS로 세척 후, 1 염소, 마우스 또는 토끼에 대한 적절한 결합 된 이차 항체와 이차 항체 세포를 배양한다. 0.5 ㎍ / ㎖의 DAPI (4 &#39;와 핵, 얼룩 세포를 시각화, 6 diamidino -2- 페닐 인돌 다음)과 Vectashield에 마운트합니다. </li></ol></li></ol> 4. NPC 형질 도입 <ol><li> 형질 감염된 세포 (21)의 비율을 증가시키는 (1 시간 동안 1,000 XG에서 바이러스의 존재하에 세포 배양 판을 원심 분리)을 사용 spinfection. NPC 미디어에 희석 감염 원하는 다중성 (일반적으로 1 ~ 10) (MOI)에 titered 대기음 매체와 관련 과발현 (또는 제어) 렌티 바이러스 (또는 레트로 바이러스)로 교체합니다. 1.5 ml의 6 웰 플레이트의 웰 당 볼륨 (또는 조직 배양 접시의 다른 유형에 대한 적절한 규모의 볼륨)를 사용합니다. 1000 XG에 스핀과 접시 원심 분리기에서 1 시간 37 ºC. 참고 : 이상적으로, 분할 1 ~ 2 일 이내에 렌티 바이러스 또는 레트로 바이러스 벡터와 NPC의 형질 도입. 상업적 또는 실험실 준비 바이러스를 사용하든, 적절 용액을 희석하여 사전에 바이러스의 배치를 역가하는 것이 도움이 될 수 있습니다. (그림 3). </li><li> CEL을 줄이기 위해하여 세포 죽음, spinfection의 8 시간 내에서 미디어를 교체합니다. 참고 : 바이러스 성 통합 및 유전자 발현은 리포터 유전자 형광 24 시간 이내에 검출 할 수 있어야합니다. (바이러스가 형광 기자 부족하면,이 평가하기 어렵다; 성공적으로 형질이 가장 과발현 제품에 대한 면역, 면역 조직 화학 또는 qPCR에 의해 검증 될 수있다.) 전체 표현 3-7 일이 소요될 수 있습니다; 추가적인 바이러스 반복 spinfections는 형질 감염된 세포의 백분율을 증가시키기 위해 필요할 수있다. 재발 spinfections 매일 발생할 수 있지만, 너무 자주 할 필요는 없다. 이상적으로, 형광 기자를 사용하는 경우,&gt; 세포의 80 %가 표시되어야합니다. </li></ol> 5. Neurosphere 마이그레이션 분석 참고 : 엔피씨의 효소 분해 다음 자발적으로 neurosphere를 양식 - 세포 NPC 미디어에 정지에서 배양하는 경우, (NPC 확장에 사용되는 것과 동일한 방식으로는 3.3-3.6 단계). <ol><li> 간단히, 해리 성장neurosphere를 생성하기 위해 비 접착 성 판에서 48 시간 동안 NPC 미디어에서 D의 NPC. (그림 4). </li><li> neurosphere 마이그레이션의 경우, 96 웰 플레이트에, 오히려 DMEM보다 따기 neurosphere하기 전에 1-2 시간을 초기 NPC 미디어를 사용하여 신선한 마트 리젤 판을 준비합니다. 우물에서 마트 리젤을 대기음하지 마십시오. </li><li> 원래 배아 줄기 세포 유래 neurosphere를 22 용으로 제작 된 바와 같이, 수동으로 세포 파편을 제거하기 위해 NPC 미디어에 한 번 세척 후, 현미경으로 NPC 파생 neurosphere를을 선택합니다. 마트 리겔 - 코팅 된 96- 웰 플레이트의 각 웰에 하나 neurosphere 전송. </li><li> 각 96 웰 플레이트에 neurosphere를에, 차가운 NPC 미디어에 희석 추가로 0.5 mg의 마트 리젤을 추가합니다. </li><li> 수동 웰 피펫 팁을 사용하는 도중에 각 neurosphere 중앙. 주 : 결과에 변동을 감소시키기 위해, 유사한 크기를 neurosphere를 선택하는 것이 중요하다. </li><li> 마이그레이션이 48 시간 동안 발생하고 w 세포를 고정 할 수 있도록 허용원하는 면역 마커 번째 4 % 파라 포름 알데히드와 얼룩. </li><li> 방사상 이동은 완전히 4X 현미경 대물 렌즈를 사용하는데, 사진 neurosphere를 결정해야하는 경우. 우물의 가장자리 또는 분석에서 두 번째 neurosphere 연락 어떤 neurosphere를 제외. 참고 : 마이그레이션 이상 48 시간 동안 발생하는 경우, 결과 방사형 마이그레이션 가능성이 4 배 목표를 사용하여 이미지에 너무 큰 것입니다. </li><li> NIH ImageJ에 소프트웨어 (그림 5)를 사용하여 각 neurosphere에서 평균 이동을 측정한다. 이는 후술하는 분석 방법 중 하나를 사용하여 수행 할 수있다 : <ol><li> 방사형 마이그레이션 : <ol><li> 수동 후 얻어진 도형의 면적을 계산하기 위해 측정 (Ctrl 키 + M) 함수를 사용하여 자유 선택 도구를 사용하여 마이그레이션 먼 셀 가장자리를 추적. 측정하기 전에 지역은 면적이 분석 탭에서 볼 수있는 설정 측정 창에서 선택되어 있는지 확인합니다. 사용면적 측정과 원 (A = πr 2)의 영역에 대한 방정식의 값은 반경 (외부)을 결정합니다. </li><li> 원래의 에지 neurosphere 추적 면적을 측정하고 같은 방법으로 반경 (내측)을 계산한다. 외부 및 내부 반경 사이의 차이로서 총 방사상 이동을 계산한다. </li></ol></li><li> 최고의 휴대 마이그레이션 : <ol><li> 측정 (Ctrl 키 + M) 함수 다음에 직선 선택 도구를 사용하여 내부 neurosphere의 가장자리로부터 먼 다섯 셀로 이동 거리를 측정한다. </li></ol></li></ol></li></ol>

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<li>Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cerebral+cortex+development+from+pluripotent+stem+cells+to+functional+excitatory+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses.</a> Nat Neurosci. 15, 477-486 (2012).</li>
<li>Espuny-Camacho, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyramidal+neurons+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+integrate+efficiently+into+mouse+brain+circuits+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo.</a> Neuron. 77, 440-456 (2013).</li>
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우리는 NPC들에 hiPSCs는 신경 세포의 종류가있는 hiPSC 유래 신경 세포의 유전자 서명의 상당 부분이 보존되고 그 잠재적으로 질병의 발병 기전 (8)에 기여하는 발달 경로에 대한 프록시 역할을 할 수있다 구별하는 기준에 방법을 설명했다 (11). 우리가 자세히 것처럼 또한, NPC가 우리가 질병 소인의 분자 생화학 적 연구에 적합 할 수있다 생각 견고 복제 성 쉽게 형질 신경 인구입니다. 우리가 분화하는 상세한 방법 및 배양 전뇌 무늬의 NPC를 갖지만, 그들은 쉽게 다른 세포 운명으로 패터닝의 NPC를 생성하도록 구성 될 수있다. 예를 들어, 부동 사채 먼저 NPC 미디어의 확장과 20 ng의 보충 신경 미디어에서 차별화 할 수 있습니다 0.5 ㎎ / ㎖의 DKK1, 10 mM의 SB431542, 0.5 ㎎ / ㎖ 소량과, 해마의 NPC가 생성됩니다 1mM의 cyclopamine로 치료하는 경우 / ㎖ WN...

우리 (1)에 의해 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs)에서 시험 관내에서 차별화 된 신경 세포 등, 3의 유전자 발현 연구는 hiPSC 신경 세포가 태아보다는 성인 뇌 조직을 닮은 것을 나타냅니다. 현재, hiPSC 기반 모델은 오히려 늦은 기능, 신경 학적 질병보다에 경향의 연구에 더 적합 할 수있다. 우리는 이전의 NPC 분열증 한 기여 분자 경로를 연구하는데 유용한 세포 유형이 될 수 있다는 것을 나타내는, 정신 분열증 hiPSC 유래 신경 세포의 유전자 서명의 상당 부분이 정신 분열증 hiPSC 유래 신경 전구 세포 (NPC들)에 보존되었다고보고했다 . 우리와 다른 비정상적인 이주 증가 산화 스트레스 및 반응성 산소 종, 서브 - 임계 환경 스트레스 및 정신 분열증에서 미토콘드리아 기능 부전의 NPC hiPSC 1,4-6 민감도뿐만 아니라 C를 감소 신경 신고되었습니다연 결 성 및 정신 분열증 hiPSC 신경 5,7-10에서 시냅스 기능. 정신 분열증 hiPSC의 NPC에서 벗어난 마이그레이션 및 / 또는 산화 스트레스에 기여하는 분자 요인 또한 정신 분열증 hiPSC 유래 신경 세포의 감소 된 신경 세포의 연결을 기초 경우, NPC의 질병을 담당하는 메커니즘을 연구하는과 강력하고 매우 복제 성 신경 인구 수 있습니다. 하나는 신속하게 많은 수의 세포를 생성 할 수 있습니다 및 신경 세포의 성숙을 위해 몇 주 또는 몇 달을 기다릴 필요가 있기 때문에 또한, NPC 기반의 분석은 큰 환자 코호트 연구에 적합하며 높은 처리량 검사에 더 의무가 있습니다. 우리는 이미 정신 분열증 1 헌팅턴 병 (11) 등 다양한 질환에서 입증 된 바와 같이 hiPSC의 NPC, 잠재적으로 질병의 발병에 기여하는 발달 경로에 대한 프록시 역할을 할 수 있다고 생각합니다. hiPSCs에서 초기 신경에서의 NPC를 구분하기 위해duction 듀얼 SMAD 억제 (위하여 0.1mM LDN193189 및 10 mM이 SB431542) (12)에 의해 달성된다. 이러한 작은 분자 신호 BMP 및 TGF 반감으로 내배엽과 중배엽 사양은 신경 세포의 분화를 가속화하고 도금의 1 주일 이내에 볼 신경 로제트의 형성을 선도 차단됩니다. 신경 패터닝 아마도 그 후 즉시 신경 로제트 형성 및 기간 동안, 초기에이 과정에서 발생한다. 다른 단서가없는 경우, 이들 신경 원시 세포는 전뇌 전방 형상 (13)의 운명을 가정한다. 즉시 신경 로제트 형성을 다음과 NPC 확장에 걸쳐 진행, 전뇌의 NPC FGF2 8, 14 배양한다. 그들은 이중 혈통 잠재력을 가지고 70~80% III-tubulin에 양성 신경 세포와 20 ~ 30 % glial fibrillary 산성 단백질 (GFAP) 양성 성상 세포 (그림 1)의 신경 인구로 구분 될 수있다. 전뇌 hiPSC 뉴런의 대부분 VGLUT1 양성신경 세포의 약 30 %가 GAD67 양성 (GABA 성) 있지만, 그래서, 아마도 글루탐산이다 (8). NPC가 일상적으로 일관된 차별화 프로파일을 유지하고, 염색체 이상을 축적하지 않고있는 동안, 시험관 내에서 10 배 이상 계대. 그룹 계대 엔피씨 (15)는, 그러나, 우리 10 구절을 넘어, 엔피씨가 성상 세포 분화 경향이 커지고있다 찾을보다 40 배 신고되었습니다. NPC의 여러 동결 해빙을 잘 견딜 단순히 비 접착 성 판에서 배양하여 neurosphere를로 성장으로 전환 할 수 있습니다. NPC가 효율적 생화학 연구를 위해 충분한 물질을 수득 신속한 유전 섭동 분자 세포의 평가 결과, 쉽게 확장을 가능 바이러스 벡터로 형질 도입된다. 또한, 때문에 바이러스 벡터는 허용 강력한 과발현 제어 또는 환자 파생 neur 중 및 / 또는 질병 관련 유전자의 최저,알 세포는 하나의 이러한 유전 적 조작에 대한 배경의 영향을 테스트하기 위해이 플랫폼을 사용할 수있다. 시냅스 또는 성숙한 뉴런을 필요로하는 활동 기반의 분석에 적합하지 않지만, NPC의 환자 유래 신경 세포의 많은 간단한 분자 또는 생화학 적 분석을위한 실용적인 대안이 될 수있다.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>#11330</td><td>HES 매체용</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>#10565</td><td>신경 매체용</td></tr><tr><td>KO-Serum Replacement</td><td>Life Technologies</td><td>#10828</td><td>로트 테스트 필요</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>#35050</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Life Technologies</td><td>&nbsp;#11140</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Life Technologies</td><td>&nbsp;#17502-048</td><td>로트 테스트 필요</td></tr><tr><td>B27-RA</td><td>Life Technologies</td><td>&nbsp;#12587-010</td><td>로트 테스트 필요</td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Life Technologies</td><td>#13256-029</td><td>Resuspend in PBS + 1% BSA</td></tr><tr><td>LDN193189</td><td>Stemgent</td><td>#04-0074</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Stemgent</td><td>#04-0010</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Peprotech</td><td>#450-02</td><td>PBS + 0.1% BSA</td></tr><tr><td>GDNF에서</td> 재현탁;<td>Peprotech</td><td>&nbsp;#450-10</td><td>PBS에서 재현탁 + 0.1% BSA</td></tr><tr><td>Dibutyryl cyclic-AMP</td><td>Sigma</td><td>&nbsp;#D0627</td><td>PBS에서 재현탁 + 0.1% BSA</td></tr><tr><td>L-아스코르브산</td><td>Sigma</td><td>#A0278</td><td>H20에서 재현탁</td></tr><tr><td>STEMdiff Neural Rosette Selection</td><td>Reagent Stemcell Technologies</td><td>&nbsp;#05832</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT-104</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>Life Technologies</td><td>#17104019</td><td></td></tr><tr><td>CF1 mEFs</td><td>Millipore</td><td>#PMEF-CF</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Ornithine</td><td>Sigma</td><td>P3655</td><td></td></tr><tr><td>Laminin, Natural Mouse 1 mg</td><td>Life Technologies</td><td>#23017-015</td><td></td></tr><tr><td>BD Matrigel</td><td>BD#</td><td>354230</td><td>차가운 DMEM에서 10 mg/ml로 얼음에 재현탁, 두 개의 6-웰 플레이트 등가물당 1 mg을 사용하십시오</td></tr><tr><td>. 조직 배양 처리된 6-웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>초저 첨부 6-웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>염소 anti-Sox2&nbsp;</td><td>산타 크루즈</td><td>sc&shy; 17320</td><td>1:200</td></tr><tr><td>마우스 안티 휴먼 Nestin</td><td>Millipore</td><td>MAB5326</td><td>1:200</td></tr><tr><td>토끼 안티 -&베타에서 사용; III-튜불린</td><td>코밴스</td><td>PRB&shy; 435P</td><td>1:500</td></tr><tr><td>마우스 안티 베타에서 사용; III-튜불린</td><td>Covance</td><td>MMS&shy; 435P</td><td>1:500</td></tr><tr><td>마우스 anti-MAP2AB</td><td>Sigma</td><td>M1406</td><td>1:200</td></tr><tr><td>플레이트 원심분리기</td><td>Beckman Coulter Beckman Coulter</td><td>Allegra X-14 (SX4750 플레이트 캐리어 포함)</td><td></td></tr></tbody></table>

신경 질환의 연구에 대한 생성 및 사용 hipsc 파생 npc들에 가이드

A Guide to Generating and Using hiPSC Derived NPCs for the Study of Neurological Diseases

신경 질환에 대한 사후 검사는 많은 질병이 증상이 나타나기 전에 장기간 질병이 진행되기 때문에 질병 시작의 근본적인 원인을 확인하는 데 이상적이지 않습니다. 환자와 건강한 대조군의 섬유아세포는 인간 유도 만능 줄기세포(hiPSC)로 효율적으로 재프로그래밍될 수 있고, 이후 이러한 질병 연구를 위해 신경전구세포(NPC)와 뉴런으로 분화될 수 있기 때문에 이제 환자의 증상이 나타나기 전에 발생한 발달 과정을 요약할 수 있습니다. 우리는 hiPSC를 NPC로 효율적으로 분화할 수 있는 방법을 제시하며, NPC는 기능적 뉴런으로 추가로 분화할 수 있을 뿐만 아니라 강력한 계대, 동결-해동 또는 전이되어 신경구로 성장할 수 있으며, 신속한 유전자 스크리닝을 통해 복제, 이동, 산화 스트레스 및/또는 세포사멸을 포함하여 세포 표현형에 영향을 미치는 분자 요인을 식별할 수 있습니다. 환자 유래 hiPSC NPC는 유전자 발현 조작의 세포 또는 분자 결과의 경험적 테스트에 이상적인 고유한 플랫폼입니다.

신경 로제트는 apico - 기초 극성 (그림 1)와 neuroepithelial 세포의 원형 클러스터로서의 특성 외관에 의해, 시야 현미경을 사용하여, 형태 학적으로 식별 할 수 있습니다. NPC가 매우 높은 세포 밀도에서 일반적으로 배양 있지만, 바로 계대에 따라 약간 피라미드 모양의 소마와 바이폴라 신경 돌기 구조는 볼 (그림 1D)입니다. III-tubulin의 얼룩은 NPC들 중 일부 비율이 지속적으로 문화 (그림 1 층)에서 신경 세포의 분화를 시작하는 것을 나타내는 모든 NPC 인구도 볼 수 있지만 검증의 NPC, 세포의 대부분에 네 스틴 및 SOX2을 표현한다. 이러한 LMX1A 및 FOXA2으로 중뇌 마커 (그림 1G-I)하지 않는 상태에서 이러한 SOX2 및 PAX6, 및 TBR2 같은 전뇌 신경 전구 세포 등의 신경 줄기 세포의 마커는, 또한, NPC들로 표현된다. 크고 평평한 섬유 아세...

이 프로토콜은 많은 신경 질환에서 질병 발병에 기여하는 발달 경로를 식별하는 데 사용할 수 있는 강력하고 복제적인 신경 세포 집단을 생성하기 위해 신경 전구 세포를 인간 유도 만능 줄기 세포와 구별할 수 있는 방법을 설명합니다.

신경 질환의 연구에 대한 생성 및 사용 hiPSC 파생 NPC들에 가이드

Post-mortem studies of neurological diseases are not ideal for identifying the underlying causes of disease initiation, as many diseases include a long ...

본 절차의 전반적인 목표는 신경계 질환의 원인이 되는 세포 및 분자적 기전을 연구하기 위한 플랫폼으로서, 인간 유도만능줄기세포(hiPSCs)로부터 신경 전구세포(NPCs)를 생성하는 것입니다. 이는 먼저 dual SMAD 억제제를 사용하여 hiPSCs를 신경 로제트(neural rosettes)로 분화시킴으로써 수행됩니다. 두 번째 단계에서는 이러한 신경 로제트를 수확하여 확장 가능한 NPC 집단으로 성장시키는 것입니다.다음으로 스핀 감염(spin infection)을 통한 렌티바이러스 형질전환을 진행합니다. 유전자 발현을 조절하기 위해 효율을 높이는 단계가 사용됩니다. 마지막 단계는 NPC를 부유 배양하여 자발적으로 신경구(neurospheres)를 형성하도록 하는 것입니다.궁극적으로, 이 플랫폼은 다양한 세포 표현형을 분석하는 데 사용될 수 있습니다. 예를 들어, 유전자 조작이 신경 세포 이동에 미치는 영향을 측정하는 것이 가능합니다. 이러한 방법을 통해 세포 이동과 같은 세포 메커니즘에 대한 통찰을 얻을 수 있습니다.또한 이는 복제, 산화적 스트레스, 세포 사멸 및 신경 돌기 성장과 같은 다른 생물학적 과정을 연구하는 데에도 적용될 수 있습니다. 인간 유도만능줄기세포 또는 고효율 PSC의 분화는 가시적인 신경 로제트의 형성으로 이어지며, 이는 14일 차에 신경 로제트를 효소적으로 선택하기 위한 정단-기저 극성을 가진 신경 상피 세포의 둥근 클러스터로 특징지어집니다. 부착된 배아체(ebs)에서 배지를 흡입하여 제거하고, 6웰 플레이트의 웰당 1 mL의 신경 로제트 선택 시약을 추가한 후 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다.1시간 후, P 1000 피펫을 사용하여 각 웰에서 효소를 조심스럽게 제거하고 웰당 1 mL의 D-M-E-M-F 12를 첨가합니다. 로제트를 세척하려면, 1 mL의 D-M-E-M-F 12를 수집한 다음 다시 웰로 빠르게 분사하여 플레이트에서 로제트를 분리합니다.로제트를 팰콘 튜브에 수집합니다. D-M-E-M-F 12 1 mL를 추가로 피펫팅하여 동일한 웰에 빠르게 분사함으로써 남은 로제트들을 떼어냅니다. 이때 트리투레이션을 하지 않도록 하며, 로제트 응집체가 깨지지 않도록 주의하십시오. 신경 로제트를 동일한 팰콘 튜브에 수집합니다.모든 신경 로제트(neural rosettes)를 수집한 후에도 로제트가 쉽게 분리되지 않는 경우, 효소를 더 추가하고 이 과정을 반복할 수 있습니다. Falcon 튜브를 300 G에서 3분 동안 원심 분리합니다. 세척액을 흡입하여 제거하고 재현탁합니다.로제트를 2 mL의 신경 전구 세포 배지에 현탁합니다. 세포를 poly L ornithine 라미네이트 코팅된 6웰 플레이트로 옮기고 37 °C에서 일주일 동안 배양합니다. 본 실험실에서는 신경 전구 세포(NPC)를 matrigel 플레이트에서 배양하며, 이틀마다 배지를 교체하고 매우 높은 밀도로 유지합니다.NPC를 분할하기 위해, 먼저 배지를 흡입하여 제거한 다음 6-well 플레이트의 well당 37°C로 데운 accutane 1 mL를 첨가하고 37°C에서 10~15분 동안 배양합니다. 기계적 스트레스를 최소화하면서 분리된 세포를 DMEM/F12가 담긴 15 mL 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 효소가 들어있는 동안 세포를 트리톤(tritrate)하지 마십시오. 1000 ×g에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다. 원심분리 후, 상층액을 흡입하여 제거하고 NPC를 재부유시킵니다.6-웰 플레이트의 원래 웰당 약 1 mL의 NPC 배지에서, 재현탁 및 세포 계수 후 합류(confluent)된 6-웰 플레이트의 웰당 500만에서 1,000만 개의 세포가 예상됩니다. NPC를 유지하려면 6-웰 플레이트의 웰당 약 100만에서 200만 개의 세포로 NPC 플레이트를 교체하십시오. 신경구(neurosphere) 형성 효율은 실험 및 세포주마다 다르지만, 일반적으로 비부착성 6-웰 플레이트의 웰당 20만에서 100만 개의 세포를 분주했을 때 가장 잘 형성됩니다. 응집이 발생하는 경우 분주하는 세포 수를 줄이십시오. 이상적으로는 분할 후 1~2일 이내에 수행하십시오.형질전환된 세포의 비율을 높이기 위해 NP NPC에 렌티바이러스 또는 레트로바이러스 벡터를 형질도입해야 합니다. 스핀 감염법을 사용하십시오. 각 웰에서 배지를 흡입하여 제거하고, 원하는 감염다중도로 희석하여 타이터(titer)를 맞춘 해당 과발현 또는 대조군 렌티바이러스 또는 레트로바이러스로 교체하십시오.NPC 배지에서 6-웰 플레이트의 웰당 1.5 milliliters를 사용하며, 플레이트 원심분리기를 이용해 상온에서 1000 G로 1시간 동안 원심분리합니다. 원심분리 후, 세포 사멸을 줄이기 위해 플레이트를 다시 인큐베이터에 넣습니다. 원심분리 감염 후 8시간 이내에 배지를 교체합니다.NPC 유래 NEUROSPHERES를 NPC 배지로 한 번 세척하여 세포 잔해를 제거함으로써 이 절차를 시작하십시오. 플레이트를 45도 각도로 기울여 뉴로스피어가 가라앉도록 한 다음, 뉴로스피어가 흡입되지 않도록 주의하며 배지를 최대한 제거하십시오. 이후 신선한 배지로 교체하십시오.다음으로, P 200 피펫을 사용하여 현미경 하에서 NPC 유래 NEUROSPHERES를 수동으로 분리하여, Matrigel이 코팅된 96웰 플레이트의 각 웰에 neurosphere를 하나씩 옮깁니다. 결과의 변동성을 줄이기 위해 비슷한 크기의 neurosphere를 선택하는 것이 중요합니다. 각 96웰 플레이트의 neurosphere에 차가운 NPC 배지로 희석한 Matrigel 0.5 milligrams를 추가로 첨가합니다.피펫 팁을 사용하여 각 개별 뉴로스피어(neurosphere)를 웰의 중앙에 수동으로 배치합니다. 뉴로스피어의 이동이 일어날 수 있도록 48시간 동안 배양합니다. 원하는 면역조직화학 마커로 세포를 고정 및 염색한 후, Forex 현미경 대물렌즈를 사용하여 뉴로스피어 전체를 촬영합니다. 방사형 이동을 측정하려면 Image J 소프트웨어를 사용하십시오.올가미 선택 도구를 사용하여 가장 멀리 이동한 세포의 가장자리를 수동으로 따라 그립니다. Analyze 탭에 있는 측정 설정 창에서 해당 영역이 선택되었는지 확인하십시오. 그런 다음 측정 기능을 사용하여 결과 도형의 면적을 계산합니다.면적 측정값과 원의 면적 공식을 사용하여 동일한 방식으로 외경 반지름을 결정하고, 원래 뉴로스피어(neurosphere)의 가장자리를 추적하십시오. 면적을 측정하고 내경 반지름을 계산하십시오. 외경 반지름과 내경 반지름의 차이를 전체 방사형 이동 거리로 계산하십시오.이 이미지들은 고분화능 줄기세포(high PSC)에서 배아체, 신경 로제트, 신경 전구세포(NPC), 그리고 신경세포로 이어지는 고분화능 줄기세포의 신경 분화 단계를 보여줍니다. 검증된 NPC는 대부분의 세포에서 NPC 마커인 nesting과 신경 줄기세포 전사 인자인 SOX two를 발현합니다. 모든 NPC 집단에서 Beta three tubulin 염색 또한 확인할 수 있습니다. 또한 NPC는 신경 줄기세포 전사 인자인 PAC six와 전뇌 전구세포 마커를 발현합니다.TBR2는 발현하지만 LMX1A 및 FOXA2와 같은 중뇌 마커는 발현하지 않는 고품질 PSC 유래 NPC는 초록색으로 표시된 beta III tubulin 양성 뉴런으로 70~80%, 빨간색으로 표시된 glial fibrillary acidic protein 양성 성상교세포로 20~30% 분화할 수 있습니다. 고품질 NPC는 대부분의 세포에서 nestin과 SOX2를 발현하는 반면, 저품질 NPC는 SOX2 음성 및 nestin 음성 세포가 일부 구역에서만 나타납니다. 고품질 NPC에서 분화된 4주 차 뉴런은 MAP2 AB와 beta III tubulin을 발현합니다.고역가의 렌티바이러스 또는 레트로바이러스 벡터로 성공적으로 형질전환시키면, 세포의 80% 이상이 형광 리포터로 표지됩니다. 벡터에 포함된 신경구(neurosphere) 생성 기전은 상대적으로 크기가 균일한 신경구 집단을 생성하며, 이들은 배양 상태에서 약 일주일 동안 건강하게 유지될 수 있습니다.정기적으로 배양액을 공급하면, matrigel 형성 후 48시간의 이동 전후를 보여주는 이 명시야 이미지에서 알 수 있듯이 건강한 뉴로스피어(neurosphere)에서 신경구 이동이 활발하게 일어납니다. 이 기술은 조현병 분야의 연구자들이 인간 유도 다능성 줄기세포 유래 NPC에서 신경 이동을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 레트로바이러스를 사용하는 작업은 잠재적으로 위험할 수 있으며, 바이러스가 존재할 가능성이 있는 모든 조직 배양 작업은 BL2+ 조건에서 수행되어야 함을 잊지 마십시오.

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신경 질환의 연구에 대한 생성 및 사용 hiPSC 파생 NPC들에 가이드

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