신경 질환의 연구에 대한 생성 및 사용 hiPSC 파생 NPC들에 가이드

본 절차의 전반적인 목표는 신경계 질환의 원인이 되는 세포 및 분자적 기전을 연구하기 위한 플랫폼으로서, 인간 유도만능줄기세포(hiPSCs)로부터 신경 전구세포(NPCs)를 생성하는 것입니다. 이는 먼저 dual SMAD 억제제를 사용하여 hiPSCs를 신경 로제트(neural rosettes)로 분화시킴으로써 수행됩니다. 두 번째 단계에서는 이러한 신경 로제트를 수확하여 확장 가능한 NPC 집단으로 성장시키는 것입니다.

다음으로 스핀 감염(spin infection)을 통한 렌티바이러스 형질전환을 진행합니다. 유전자 발현을 조절하기 위해 효율을 높이는 단계가 사용됩니다. 마지막 단계는 NPC를 부유 배양하여 자발적으로 신경구(neurospheres)를 형성하도록 하는 것입니다.

궁극적으로, 이 플랫폼은 다양한 세포 표현형을 분석하는 데 사용될 수 있습니다. 예를 들어, 유전자 조작이 신경 세포 이동에 미치는 영향을 측정하는 것이 가능합니다. 이러한 방법을 통해 세포 이동과 같은 세포 메커니즘에 대한 통찰을 얻을 수 있습니다.

또한 이는 복제, 산화적 스트레스, 세포 사멸 및 신경 돌기 성장과 같은 다른 생물학적 과정을 연구하는 데에도 적용될 수 있습니다. 인간 유도만능줄기세포 또는 고효율 PSC의 분화는 가시적인 신경 로제트의 형성으로 이어지며, 이는 14일 차에 신경 로제트를 효소적으로 선택하기 위한 정단-기저 극성을 가진 신경 상피 세포의 둥근 클러스터로 특징지어집니다. 부착된 배아체(ebs)에서 배지를 흡입하여 제거하고, 6웰 플레이트의 웰당 1 mL의 신경 로제트 선택 시약을 추가한 후 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다.

1시간 후, P 1000 피펫을 사용하여 각 웰에서 효소를 조심스럽게 제거하고 웰당 1 mL의 D-M-E-M-F 12를 첨가합니다. 로제트를 세척하려면, 1 mL의 D-M-E-M-F 12를 수집한 다음 다시 웰로 빠르게 분사하여 플레이트에서 로제트를 분리합니다.

로제트를 팰콘 튜브에 수집합니다. D-M-E-M-F 12 1 mL를 추가로 피펫팅하여 동일한 웰에 빠르게 분사함으로써 남은 로제트들을 떼어냅니다. 이때 트리투레이션을 하지 않도록 하며, 로제트 응집체가 깨지지 않도록 주의하십시오. 신경 로제트를 동일한 팰콘 튜브에 수집합니다.

모든 신경 로제트(neural rosettes)를 수집한 후에도 로제트가 쉽게 분리되지 않는 경우, 효소를 더 추가하고 이 과정을 반복할 수 있습니다. Falcon 튜브를 300 G에서 3분 동안 원심 분리합니다. 세척액을 흡입하여 제거하고 재현탁합니다.

로제트를 2 mL의 신경 전구 세포 배지에 현탁합니다. 세포를 poly L ornithine 라미네이트 코팅된 6웰 플레이트로 옮기고 37 °C에서 일주일 동안 배양합니다. 본 실험실에서는 신경 전구 세포(NPC)를 matrigel 플레이트에서 배양하며, 이틀마다 배지를 교체하고 매우 높은 밀도로 유지합니다.

NPC를 분할하기 위해, 먼저 배지를 흡입하여 제거한 다음 6-well 플레이트의 well당 37°C로 데운 accutane 1 mL를 첨가하고 37°C에서 10~15분 동안 배양합니다. 기계적 스트레스를 최소화하면서 분리된 세포를 DMEM/F12가 담긴 15 mL 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 효소가 들어있는 동안 세포를 트리톤(tritrate)하지 마십시오. 1000 ×g에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다. 원심분리 후, 상층액을 흡입하여 제거하고 NPC를 재부유시킵니다.

6-웰 플레이트의 원래 웰당 약 1 mL의 NPC 배지에서, 재현탁 및 세포 계수 후 합류(confluent)된 6-웰 플레이트의 웰당 500만에서 1,000만 개의 세포가 예상됩니다. NPC를 유지하려면 6-웰 플레이트의 웰당 약 100만에서 200만 개의 세포로 NPC 플레이트를 교체하십시오. 신경구(neurosphere) 형성 효율은 실험 및 세포주마다 다르지만, 일반적으로 비부착성 6-웰 플레이트의 웰당 20만에서 100만 개의 세포를 분주했을 때 가장 잘 형성됩니다. 응집이 발생하는 경우 분주하는 세포 수를 줄이십시오. 이상적으로는 분할 후 1~2일 이내에 수행하십시오.

형질전환된 세포의 비율을 높이기 위해 NP NPC에 렌티바이러스 또는 레트로바이러스 벡터를 형질도입해야 합니다. 스핀 감염법을 사용하십시오. 각 웰에서 배지를 흡입하여 제거하고, 원하는 감염다중도로 희석하여 타이터(titer)를 맞춘 해당 과발현 또는 대조군 렌티바이러스 또는 레트로바이러스로 교체하십시오.

NPC 배지에서 6-웰 플레이트의 웰당 1.5 milliliters를 사용하며, 플레이트 원심분리기를 이용해 상온에서 1000 G로 1시간 동안 원심분리합니다. 원심분리 후, 세포 사멸을 줄이기 위해 플레이트를 다시 인큐베이터에 넣습니다. 원심분리 감염 후 8시간 이내에 배지를 교체합니다.

NPC 유래 NEUROSPHERES를 NPC 배지로 한 번 세척하여 세포 잔해를 제거함으로써 이 절차를 시작하십시오. 플레이트를 45도 각도로 기울여 뉴로스피어가 가라앉도록 한 다음, 뉴로스피어가 흡입되지 않도록 주의하며 배지를 최대한 제거하십시오. 이후 신선한 배지로 교체하십시오.

다음으로, P 200 피펫을 사용하여 현미경 하에서 NPC 유래 NEUROSPHERES를 수동으로 분리하여, Matrigel이 코팅된 96웰 플레이트의 각 웰에 neurosphere를 하나씩 옮깁니다. 결과의 변동성을 줄이기 위해 비슷한 크기의 neurosphere를 선택하는 것이 중요합니다. 각 96웰 플레이트의 neurosphere에 차가운 NPC 배지로 희석한 Matrigel 0.5 milligrams를 추가로 첨가합니다.

피펫 팁을 사용하여 각 개별 뉴로스피어(neurosphere)를 웰의 중앙에 수동으로 배치합니다. 뉴로스피어의 이동이 일어날 수 있도록 48시간 동안 배양합니다. 원하는 면역조직화학 마커로 세포를 고정 및 염색한 후, Forex 현미경 대물렌즈를 사용하여 뉴로스피어 전체를 촬영합니다. 방사형 이동을 측정하려면 Image J 소프트웨어를 사용하십시오.

올가미 선택 도구를 사용하여 가장 멀리 이동한 세포의 가장자리를 수동으로 따라 그립니다. Analyze 탭에 있는 측정 설정 창에서 해당 영역이 선택되었는지 확인하십시오. 그런 다음 측정 기능을 사용하여 결과 도형의 면적을 계산합니다.

면적 측정값과 원의 면적 공식을 사용하여 동일한 방식으로 외경 반지름을 결정하고, 원래 뉴로스피어(neurosphere)의 가장자리를 추적하십시오. 면적을 측정하고 내경 반지름을 계산하십시오. 외경 반지름과 내경 반지름의 차이를 전체 방사형 이동 거리로 계산하십시오.

이 이미지들은 고분화능 줄기세포(high PSC)에서 배아체, 신경 로제트, 신경 전구세포(NPC), 그리고 신경세포로 이어지는 고분화능 줄기세포의 신경 분화 단계를 보여줍니다. 검증된 NPC는 대부분의 세포에서 NPC 마커인 nesting과 신경 줄기세포 전사 인자인 SOX two를 발현합니다. 모든 NPC 집단에서 Beta three tubulin 염색 또한 확인할 수 있습니다. 또한 NPC는 신경 줄기세포 전사 인자인 PAC six와 전뇌 전구세포 마커를 발현합니다.

TBR2는 발현하지만 LMX1A 및 FOXA2와 같은 중뇌 마커는 발현하지 않는 고품질 PSC 유래 NPC는 초록색으로 표시된 beta III tubulin 양성 뉴런으로 70~80%, 빨간색으로 표시된 glial fibrillary acidic protein 양성 성상교세포로 20~30% 분화할 수 있습니다. 고품질 NPC는 대부분의 세포에서 nestin과 SOX2를 발현하는 반면, 저품질 NPC는 SOX2 음성 및 nestin 음성 세포가 일부 구역에서만 나타납니다. 고품질 NPC에서 분화된 4주 차 뉴런은 MAP2 AB와 beta III tubulin을 발현합니다.

고역가의 렌티바이러스 또는 레트로바이러스 벡터로 성공적으로 형질전환시키면, 세포의 80% 이상이 형광 리포터로 표지됩니다. 벡터에 포함된 신경구(neurosphere) 생성 기전은 상대적으로 크기가 균일한 신경구 집단을 생성하며, 이들은 배양 상태에서 약 일주일 동안 건강하게 유지될 수 있습니다.

정기적으로 배양액을 공급하면, matrigel 형성 후 48시간의 이동 전후를 보여주는 이 명시야 이미지에서 알 수 있듯이 건강한 뉴로스피어(neurosphere)에서 신경구 이동이 활발하게 일어납니다. 이 기술은 조현병 분야의 연구자들이 인간 유도 다능성 줄기세포 유래 NPC에서 신경 이동을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 레트로바이러스를 사용하는 작업은 잠재적으로 위험할 수 있으며, 바이러스가 존재할 가능성이 있는 모든 조직 배양 작업은 BL2+ 조건에서 수행되어야 함을 잊지 마십시오.