Name: 조작 및 체외 성숙 아프리카 발톱 개구리 laevis의 난 모세포, 배아 발달을 연구하는 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: 배우세요 Xenopus laevis 난모세포 조작 및 체외성숙 기술로 모계단백질 녹다운과 유전자 과발현을 통해 초기 배아발달 메커니즘을 연구하는 방법을 익히세요.

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유용한 토론을 해준 Gurdon 연구실 구성원들에게 감사드립니다. K.M.은 Wolfson College의 연구원이며 Herchel Smith 박사후 연구원과 영국 사사카와 재단의 지원을 받고 있습니다. Gurdon 실험실은 Wellcome Trust(RG69899)와 MRC의 보조금으로 J.B.G.에 지원됩니다.

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<li>Heasman, J., Kofron, M., Wylie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-catenin+signaling+activity+dissected+in+the+early+Xenopus+embryo%3A+a+novel+antisense+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Beta-catenin signaling activity dissected in the early Xenopus embryo: a novel antisense approach.</a> Developmental biology. 222 (1), 124-134 (2000).</li>
<li>Oelgeschlager, M., Kuroda, H., Reversade, B., De Robertis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chordin+is+required+for+the+Spemann+organizer+transplantation+phenomenon+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+cell%22%5BJournal%5D)">Chordin is required for the Spemann organizer transplantation phenomenon in Xenopus embryos.</a> Developmental cell. 4 (2), 219-230 (2003).</li>
<li>Szenker, E., Lacoste, N., Almouzni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+developmental+requirement+for+HIRA-dependent+H3.3+deposition+revealed+at+gastrulation+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">A developmental requirement for HIRA-dependent H3.3 deposition revealed at gastrulation in Xenopus.</a> Cell reports. 1 (6), 730-740 (2012).</li>
<li>Heasman, J., Holwill, S., Wylie, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization+of+cultured+Xenopus+oocytes+and+use+in+studies+of+maternally+inherited+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Fertilization of cultured Xenopus oocytes and use in studies of maternally inherited molecules.</a> Methods in cell biology. 36, 213-230 (1991).</li>
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<li>Schneider, P. N., Hulstrand, A. M., Houston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization+of+Xenopus+oocytes+using+the+host+transfer+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Fertilization of Xenopus oocytes using the host transfer method.</a> J. Vis. Exp. (45), (2010).</li>
<li>Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+bi-allelic+mutation+rates+using+TALENs+in+Xenopus+tropicalis%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+open%22%5BJournal%5D)">Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis).</a> Biology open. 1 (12), 1273-1276 (2012).</li>
<li>Sakane, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+mutagenesis+of+multiple+and+paralogous+genes+in+Xenopus+laevis+using+two+pairs+of+transcription+activator-like+effector+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Development%2C+growth+%26+differentiation%22%5BJournal%5D)">Targeted mutagenesis of multiple and paralogous genes in Xenopus laevis using two pairs of transcription activator-like effector nucleases.</a> Development, growth & differentiation. 56 (1), 108-114 (2014).</li>
<li>Nakayama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+efficient+CRISPR%2FCas9-mediated+targeted+mutagenesis+in+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis.</a> Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).</li>
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</ol>

저자는 공개할 것이 없습니다.

우리는 여기에 세부 산모의 요인을 고갈하거나 수정하기 전에 외생 적 요인을 과발현하는 새로운 방법. 이 시스템은 두 microinjections 필요하지만, 대신에 호스트 전송 방법에 사용 7,17 개구리 수술을 건너 뛴다. 그것은 동물 보호의 관점에서 개구리 수술 단계를 제거하는 최적이다. 또한, 우리는 우리가 실험의 성공에 영향을 미치는 하나의 생물학적 요인을 제거 할 수 있다는 것을 의미, 전송 실험에 대한 호스트 여성 개구리의 품질을 고려 할 필요가 없습니다. 따라서이 시스템에 PMSG 감작 개구리에서 얻은 난자의 질이 성공적으로 실험을위한 핵심 주요 생물학적 요인이다. 난자의 품질은 난소 또는 후 defolliculation의 수집 후 판단 할 수있다. 어떤 이상이 이러한 단계에서 관찰되는 경우, 새로운 개구리에서 다른 난소를 수집하는 최적이다. 당신이 난자의 품질을 확인하는 또 다른 점은 난자의 성숙 후입니다. progesteron의 경우 80 % 미만전자 처리 된 난자가 성숙의 징후를 보여, 당신은 더 분석을위한 배아의 충분한 수를 얻을 수없는 경우가 있습니다. 효소 defolliculation 대​​신 수동 defolliculation의 사용은 또한 defolliculation 필요한 시간을 삭감하는 본 시스템의 또 다른 장점이다. 그러나, 수동 defolliculation 효소 처리가보다 나은 개발을 줄 수 있다는 것을 여전히 가능하다. 도 3에 도시 된 바와 같이, 시험 관내에서의 거의 10 %가 수영 올챙이 스테이지에 도달 할 수 난자 성숙. 이 자료는 8 및 새로운 주입 실험에서보고 된 13 개의 독립적 인 실험에서 수집됩니다. 호스트 전사 방법은 전사 난자 30-60 %의 neurula 스테이지 (17)에 도달 할 수 있기 때문에 의미있는 데이터를 얻기위한 각 난자 75-150 치료를 필요로한다. 우리의 방법은 일반적으로 절단 배아의 약 40-60%가 도달 할 수 있기 때문에 각 실험군에서 200 ~ 300 난자로 시작근육 응답 무대. 이러한 데이터는 두 가지 방법이 합리적인 개발 속도를 지원하는 것이 좋습니다. 우리는 지금까지이 방법은 변형을 통해 개발을 지원하는 것을 나타내는,이 기술을 사용하여 제어 mRNA의 주입 및 제어 안티센스 올리고 주입 된 난자에서 10 살아있는 개구리를 얻었다. 우리 난자 조작-ICSI 방법 곧 수정 후, 초기 배아 발달 동안 모체 인자의 역할을 테스트 할 수있는 기회를 제공한다. 또한, 수정 전에 염색질 수정 인자의 과발현은 가능한 개발에 필요한 산모의 염색질 상태를 이해하기위한 수정하기 전에 산모의 염색질을 개조 할 수 있습니다. 이 전략은 또한 이들도 수정하기 전에 표현 될 수 있기 때문에 전사 활성제와 같은 이펙터 클레아 제 (TALEN) 18, 19 및 CRISPR / CAS9 (20, 21)로 현재 유전자 편집 시스템과 잘 작동 할 수 있습니다. 따라서, 우리의 새로운 접근 방식은 potenti가알은 미래 많은 응용에 사용될 수있다.

아프리카 발톱 개구리 laevis의 개발 1 연구 널리 사용되는 강력한 모델 생물이다. 제노 푸스 달걀 풍부한 (포유 동물 대응 물에 비해 약 0.1 mm 인에 약 1.2-1.4 mm) 비정상적으로 큰 때문이다. 계란 (4,000-8,000 세포 단계 8-8.5에서 발생, MBT) 중간 포배 전이 될 때까지 배아 발달을 구동하기에 충분하다 모계 합성 및 저장 구성 요소가 포함되어 있습니다. MBT이어서 발전 지시 배아 유전자 산물을 생산 접합체 게놈 활성화를 수반한다. 많은 연구 개발을위한 중요한 산모 요인을 파악하는 것을 목표로. 많은 연구는 단백질의 경우 모계 저하 스테이지 낭배 2-4에서 관찰 될 수있는 수정 된 배아에 모르 폴리 노 올리고 뉴클레오티드를 포함 안티센스 올리고 뉴클레오티드 (올리고)의 주입에 의존한다. 대안 적으로,이 수정 된 mRNA를 주입하여 EMbryos 유전자 기능을 방해하거나 과발현 단백질의 운명을 추적. 그러나, 하나의 세포 단계 배아 내로 주입 정상적으로 MBT 전에 초기 배아 단계에서 모체 단백질의 발현 수준에 영향을 미치지 않는다. 와일리 Heasman 및 5는이 문제를 극복하기 위해 호스트 전송 방법을 확립. 이들 방법에서, 수동 defolliculated 난자 안티센스 올리고으로 주입되고, 호스트 (6)에 전송 암컷. 초기 배아 발달의 하향 조절 단백질의 역할을 조사 할 수 있도록 단백질을 하향 조절되기 전에 수정된다. 7에서 평가로서이 모체 공핍있어서, 모체 단백질의 몇몇 독특한 역할 발달 식별되었다. 수정 이전의 mRNA의 모성 결핍 또는 과잉 발현이 매뉴얼 defolliculation 및 호스트 전송없이 달성되는이 보고서, 우리는 세부 사항 우리의 최근에 개발 된 방법에서,8. 수동 defolliculation 시간과 호스트의 전송은 종종 많은 따라서 임산부 공핍 방법의 빈번한 사용을 방해하는, 숙련 된 기술과 동물의 수술 별 라이선스를 필요로 요구한다. Defolliculation 및 호스트 전송은 각각 효소 defolliculation 9, 10 및 세포질 내 정자 주입 (ICSI) 11 ~ 13로 치환된다. 계란 ICSI 원래 형질 개구리 (12)를 제조 하였다. 정자와 배아 핵은 체외 성숙 양서류의 난자 11,14,15에 이식했다. 여기, 우리가 있었던 체외 성숙 난자에 정자를 주입하는 단계별 방법을 보여 안티센스 올리고 또는 ​​mRNA의 사전을 주입.

<table><tbody><tr><td>임산부 암말 혈청 성선 자극 호르몬 (PMSG)&nbsp;</td><td>MSD Animal Health</td><td>Vm 01708/4309</td><td>PMSG-Intervet 5000iu 주입 용액 용 분말 및 용제</td></tr><tr><td>에틸 3- 아미노 벤조 에이트 메탄 설포 네이트 염 (MS222)</td> <td>시그마</td><td>A5040</td><td>마취 용</td></tr><tr><td>Liberase TM 연구 학년</td><td>Roche</td><td>05 401 127 001</td><td>난모 세포 혈관 형성. -20&nbsp;에서 저장 &#176;씨.</td></tr><tr><td>Drummond Nanoject</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-205/206</td><td>마이크로인젝</td></tr>션 <tr><td>유리 캐필러리용&nbsp;</td><td>알파 연구소</td><td>7" Drummond #3-000-203-G/XL</td><td>마이크로인젝</td></tr>션 <tr><td>마이크로피펫 풀러&nbsp;</td><td>SUTTER 계기</td><td>모델 D-97</td><td>마이크로주입용</td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td>in vitro 성숙 및 ICSI</td></tr><tr><td>14 ml 초투명 원심분리기 튜브용&nbsp;</td><td>Beckman Coulter United Kingdom Ltd</td><td>344060</td><td>정자 정화용</td></tr><tr><td>OptiPrep Density Gradient Medium (Iodixanol)</td><td>Sigma</td><td>D1556</td><td>정자 정화용</td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma</td><td>D141</td><td>세포 투과화 시약</td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Hybaid&nbsp;</td><td>HB-SHK-1</td><td>난모 세포 defolliculation</td></tr><tr><td>해부 현미경 (스테레오 줌 현미경)</td><td>ZEISS</td><td>Semi SV6</td><td>난모 세포 수집 및 미세 주입</td></tr><tr><td>50 &mu; m pore filter</td><td>CellTrics</td><td>04-0042-2317</td><td>정자 정화용</td></tr><tr><td>초원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima L-100XP</td><td>정자 정제용</td></tr><tr><td>50ml 원심분리기 튜브</td><td>Cellstar Greiner Bio-One</td><td>227261 또는 210261</td><td>난자 세포 수집 및 혈관</td></tr> 반응 <tr><td>15ml 원심분리기 튜브</td><td>FALCON</td><td>352097</td><td>정자 정화용</td></tr><tr><td>90mm 페트리 요리&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>101VR20/C</td><td></td></tr><tr><td>Easy-Grip 세포 배양 접시, 60&nbsp; 엑스&nbsp; 15mm</td><td>FALCON</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>Easy-Grip 세포 배양 접시, 35&nbsp; 엑스&nbsp; 15mm</td><td>팔콘</td><td>351008</td><td></td></tr></tbody></table>

조작 및<em&gt; 체외</em의&gt; 성숙<em&gt; 아프리카 발톱 개구리 laevis의</em세포질 내 정자 주입에 이어&gt; 난 모세포, 배아 발달을 연구하는

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

양서류 알은 배아 발달을 연구하는 데 널리 사용되어 왔습니다. 초기 배아 발달은 난자 형성 동안 축적된 모계에 저장된 요인에 의해 주도됩니다. 초기 배아 발달에서 이러한 모계 요인의 역할을 연구하기 위해서는 배아 발달 초기부터 그 기능을 조작하는 것이 바람직합니다. 기존의 유전자 간섭 방법은 안티센스 올리고뉴클레오티드(올리고) 또는 mRNA를 수정란에 주입하여 특정 단백질의 과소 발현 또는 과발현을 각각 가능하게 합니다. 그러나, 이러한 방법은 일반적으로 단백질 발현이 영향을 받을 때까지 몇 시간 이상이 걸리므로, 초기 배아 단계에서는 유전자 기능의 간섭이 효과적이지 않습니다. 여기에서는 수정 전에 모계 단백질의 발현 수준을 변경할 수 있는 실험 시스템을 소개합니다. 난소에서 얻은 Xenopus laevis 난모세포는 효소로 배양하여 혈관을 형성합니다. 안티센스 올리고 또는 mRNA는 생식 소포(GV) 단계에서 혈반이 형성된 난모세포에 주입됩니다. 이 난모세포는 중기 II(MII) 단계에서 난자로 체외에서 성숙한 후 세포질 내 정자 주입(ICSI)을 거칩니다. 이러한 방식으로 ICSI 배아의 최대 10%가 수영하는 올챙이 단계에 도달할 수 있으므로 특정 유전자 녹다운 또는 과발현에 대한 기능 테스트가 가능합니다. 이 접근법은 초기 배아 발달에서 모계에 저장된 요인의 역할을 연구하는 유용한 방법이 될 수 있습니다.

체외 성숙 난자에 사용 ICSI 배아의 배아 개발 (그림 3A)를 조사 하였다. MII 단계에 GV 난자의 성숙 속도는 가변적 크게 난자의 품질에 따라 달라집니다. 좋은 실험에서, GV 난자의 거의 100 %가 마침내 MII 단계에서 계란되고, 난자의 성숙의 프로게스테론과 쇼 징후에 응답합니다. 모든 성숙 된 난자는 ICSI를 실시하고 주입 절단 계란의 약 25 % (그림 3A, N = 제어 (13)는 올리고 주입 난 모세포를 스크램블 N = 더 올리고 주입 난 모세포 7) 하였다. 약 60 % 또는 제어 올리고 주입 난 모세포 또는 비 - 주입 난 모세포로부터 생성 된 절단 배아의 80 %는 각각, 포배 / 스테이지 낭배 도달. 포배 / 낭배 배아의 82 %를 n에 좋은 품질의했다 반면 포배 / 낭 배기 배아 중 올리고 주입 시료에서 배아의 약 절반 (이상 분열 및 세포 사멸의 거의 흔적) 좋은 품질했다에 주입 된 샘플 (도 3A). 비 주입 시료에서 60 % 및 절단 배아의 29 %는 (그림 3A)를 한 동안 마지막으로, 41 % 및 올리고 주입 시료에서 절단 배아의 11 %는 각각 근육 반응과 수영 올챙이 단계에 도달했다. 이 ICSI 배아는 정상 및 비정상 배아 (그림 3B)의 혼합물이다. 그들 중 일부는 변형을 거쳐 개구리 8 성숙 개발한다. 이러한 결과는 IVM과 ICSI 다음 GV 난자에 안티센스 올리고 뉴클레오티드의 주입, 효율적인 초기 배아 발달을 허용하는 것이 좋습니다. 안티센스 올리고 자체의 주입 배아 개발을 감소하지만, 우리는 여전히 성장 발달 검사로 많은 실험을 위해 충분한 배아를 획득 할 수 있으며, RT-PCR, 등등 웨스턴 블롯합니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52496/52496fig1highres.jpg" /> 무화과<html> 우레 1 : 아프리카 발톱 개구리의 전형적인 예는 체외 성숙 실험을위한 좋은 품질 또는 나쁜 품질의 난자를 laevis의. (A) 나쁜 품질 난자의 예. 예를 들어, 곳곳에 색소 침착을 보여주는 난자 후속 실험에 사용되지 않습니다. 각 Xenopus의 난자는 직경 약 1.2-1.4 mm이다 laevis의. (B) 부분 defolliculated 난자. 난자의 우측 절반은 혈관의 존재에 의해 식별 될 수있는 모낭 세포에 의해 덮여있다. 화살표는 모낭 세포의 자유와 주사 바늘이 주입된다되는 영역을 도시한다. (C)의 동일한 크기이며 동물 반구 및 식물성 반구 사이에 명확한 명암 고르게 착색 동물 반구 표시 양질 난자의 예. 2496 / 52496fig2highres.jpg &quot;/&gt; 그림 2 :. Xenopus의 전과 후 성숙 난자를 laevis의 난자 성숙 후, 분명 흰색 반점 동물 반구 모낭 세포의 상단에 나타납니다 박리된다. 각 아프리카 발톱 개구리 laevis의 난자는 직경이 약 1mm이다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52496/52496fig3highres.jpg" /> 그림 3 : 체외 성숙 난자에에서 생산 ICSI 배아의 개발. 각 단계에 ICSI 배아의 (A) 개발이 요약되어있다. 컨트롤이 IVM과 ICSI 다음 안티센스 올리고 뉴클레오티드 (제어 올리고 주입) 또는 주입 (비 주입)을하지 않고, 스크램블와 난 모세포가 주입되었다. 각 단계에서 배아의 해당 번호는 바 위에 표시됩니다. ± SEM이 표시됩니다 의미. N = 4-13 독립적 인 실험 / 다른 Females. (B) ICSI 배아 생존의 예. 이러한 tailbud 단계 배아 약 200 난자 출발 물질로서 사용 된 하나의 실험 제작 하였다.

Xenopus laevis 미성숙 난모세포를 조작하는 방법, 난자에서 난자로의 체외 성숙 및 세포질 내 정자 주입을 설명합니다. 이 프로토콜은 일부 모계 단백질의 분해와 수정 시 관심 유전자의 과발현을 허용하므로 초기 배아 발달에서 특정 요인의 역할을 연구하는 데 가치가 있습니다.

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

다음 실험의 목적은 개구리 알의 수정 시점에 난자에 저장된 모성 단백질을 넉다운(knock down)하거나 관심 단백질을 과발현시키는 것입니다. 이는 효소적으로 탈조절된 미성숙 난자에 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 mRNA를 주입하여 특정 단백질을 분해하거나 과발현시킴으로써 수행됩니다. 두 번째 단계로, 난자를 프로게스테론이 포함된 배지로 옮겨 난자가 난자로 성숙하도록 유도합니다.다음으로, 넉다운(knockdown) 또는 과발현(overexpression)이 배아 발달에 미치는 영향을 관찰하기 위해 체외 성숙된 난자에 정자를 주입합니다. 궁극적으로, 올리고(oligo)가 주입된 난자가 헤엄치는 올챙이로 발달하는 과정이 유전자 넉다운 또는 과발현의 기능적 테스트가 됩니다. 기존의 호스트 전이(host to transfer)와 같은 방식에 비해 이 기술이 갖는 주요 장점은 표준 프로토콜을 사용하여 개구리 수술 과정을 생략할 수 있다는 점입니다.MBS와 ps가 포함된 9cm 페트리 접시에 건강한 세포가 포함된 SAC 상층액을 수집합니다. 그런 다음 난소를 1~2cm 너비의 정사각형 조각으로 떼어냅니다. 세포가 포함된 분리된 난소 약 5mL를 새로운 50mL 튜브에 수집합니다.그런 다음 조직을 MBS plus PS로 몇 번 헹구고, 15 milliliters의 신선한 MBS plus ps에 알을 수집합니다. 이제 현탁액에 7 units의 탈엽 효소를 첨가하고, 최소한 부분적으로 탈엽될 때까지 부드럽게 식생시키며 현탁액을 배양합니다. 배양 후 최소 한 시간이 소요됩니다.반응을 중단시키기 위해 MBS와 Ps가 혼합된 용액으로 튜브를 채웁니다. 용액을 세포에 직접 붓지 말고 튜브 벽면을 따라 흘려보내십시오. 조직이 가라앉을 때까지 기다린 후, 상층액과 처리제를 제거합니다.크기가 작고 미성숙한 세포들은 부유하므로 이들 또한 제거해야 합니다. 세척 후 이 세척 단계를 총 10회 반복하십시오. 세포들을 MBS plus ps가 담긴 9cm 디쉬로 옮깁니다.디쉬를 해부 현미경으로 옮기고, 이후부터는 세포를 가급적 16에서 18 °C로 유지하십시오. 유리 피펫을 사용하여 Dumont 분류법에 따라 양질의 6단계 세포를 선택하고, 이를 MBS plus ps가 담긴 새 디쉬에 수집하십시오. 양질의 세포는 동물극의 색소가 균일해야 하며, 동물극과 식물극 사이의 구분이 뚜렷해야 합니다.또한 모든 세포의 크기가 지름 1.2에서 1.4 mm 사이로 거의 동일해야 합니다. 주입 1회당 약 200~300개의 세포를 수집하여, 실험당 약 1000개의 세포를 준비합니다. O site의 품질이 성공의 핵심입니다.준비 과정 중 난소에 이상이 발견되면, 다른 개체에서 난소를 채취하여 다시 시작하는 것을 권장합니다. antisense oligo 주입을 준비하기 위해, 마이크로 인젝터의 금속 플런저를 가장 낮은 위치로 설정하고 오일이 채워진 유리 모세관을 금속 플런저에 삽입하십시오. 해부 현미경 하에서 소형 수술용 가위를 사용하여 바늘의 끝부분을 절단하십시오.최대한 작은 팁을 만드십시오. 다음 레이저 단계입니다. 현미경 스테이지 위에 파라필름 조각을 올리고, 그 위에 1 µg/µL 농도의 핵산 용액 3 µL를 분주하십시오.이를 사용하여 바늘 끝부분을 채웁니다. 공기가 갇히는 경우에는 개구부를 더 넓게 만들어야 합니다. 이제 주사 바늘 끝에서 약 0.5 mm 떨어진 지점에 눈에 띄는 표시를 합니다.그런 다음 세포 주입을 진행하며, 먼저 하나의 세포를 주입하기 위해 바늘이 통과할 수 있는 난포 세포가 없는 영역을 찾습니다. 생식포 아래의 중심점을 겨냥하여 적도 경계선을 따라 팁을 삽입하십시오. 동시에, 반대편에서 핀셋으로 세포를 고정하여 안정시킵니다.이제 풋 스위치 제어를 사용하여 용액을 분사하며, 4.6~9.2 nanograms의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 250 picograms~13.8 nanograms의 messenger RNA를 분사합니다. 모든 세포에 주입한 후, 배양 배지로 옮겨 며칠 동안 배양하여 프로테아좀 내에서 변화가 일어날 수 있도록 합니다.이후, 최소량의 배지를 사용하여 세포들을 5~8 mL의 성숙 배지가 들어 있는 6 cm 코팅 아그로 접시(agros coated dishes)로 옮깁니다. 그런 다음, 정자를 주입하기 전 16시간 동안 이 배지에서 세포를 배양합니다. 이 프로토콜을 위해 냉동 정자 스톡이 준비되어 있어야 합니다.성숙을 위해 16시간 동안 배양한 후 텍스트 프로토콜을 참조하십시오. MBS plus PS가 들어있는 6cm egg gross 코팅 디쉬로 세포를 매우 조심스럽게 옮겨 세척하십시오. 세포를 잘못 다룰 경우, ixy 이전에 자발적으로 활성화될 수 있습니다.이제 성숙한 세포의 수를 세고, 세포의 장핵(germinal vesicle)이 붕괴되었음을 나타내는 백색 반점이 있는지 확인하십시오. 양호한 세포가 80% 미만인 경우, ixy 시술을 견딜 만큼 충분히 건강하지 않은 것으로 간주합니다. 계속 진행하십시오.새한 배양 접시에 주입 배지를 채우고 30분 후에 모든 세포를 접시로 조심스럽게 옮깁니다. 올리고머에 대해 설명한 것과 동일한 인젝터 준비 과정을 거쳐 성숙한 세포에 정자 용액을 주입합니다. 이상적으로는 주입 용액 4.6 nanoliters당 1~2마리의 정자가 포함되어야 합니다.이 주입 용액을 테스트하려면, mL당 0.3 µg의 DPI 용액 방울들을 만들고 그 방울들에 4.6 nL를 주입하십시오. 그런 다음 형광 현미경으로 각 방울 내의 정자 수를 세십시오. 정자 농도를 확인한 후, 세포에 4.6 nL의 정자 용액을 주입하십시오.용액 주입에 소요되는 시간이 일정하게 유지되도록 하고, 주입 간의 일시 정지를 최소화하여 난자에 꾸준히 주입하십시오. 100회 주입할 때마다 정자 용액을 교체하십시오. 성숙한 모든 난자에 주입이 완료되면, 배양 접시를 4~5시간 동안 배양한 후 검사하십시오.분열이 일어난 배아의 경우, 분열구(cleavage furrows)가 정상 수정 배아만큼 뚜렷하지 않을 수 있으므로 모든 분열 배아를 배양액으로 옮겨 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 생존한 배아를 0.1 XMMR로 옮겨 ixy 배아의 배아 발달을 관찰합니다. 체외 성숙 난자를 이용한 실험 결과, 생식소포(germinal vesicle) 난자의 거의 100%가 프로게스테론에 반응하여 성숙 징후를 보였습니다.약 25%가 난할을 거쳤습니다. 난할된 배아의 60~80%가 포배 및 낭배 단계에 도달했으며, 그 중 약 3분의 1이 헤엄치는 올챙이 단계에 도달했습니다. ixy 배아는 정상 배아와 비정상 배아가 혼재되어 있었으며, 이는 생식 소낭 세포에 antisense sogo를 주입한 후 IVM 및 Dixie를 처리해도 초기 배아 발달이 가능하다는 것을 보여주었습니다.이 영상을 시청한 후에는 요인화 전 모체 단백질을 조작하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

manipulation-vitro-maturation-xenopus-laevis-oocytes-followed

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

Xenopus Laevis의 Oocytes의 Microinjection

의 수정 Xenopus의 oocytes 호스트 전송 방법을 사용하여

Xenopus 배아 상피 조직은 상피 morphogenesis 동안 극성 개발 및 형태의 변화와 같은 세포 행위를 연구하는 이상적인 모델 시스템입니다. 고정 샘플 전통 조직학 점점 라이브 셀 이미징 공촛점에 의해 보완되고있다. 여기 개구리 조직을 분리 및 라이브 세포 공촛점 현미경을 사용하여 라이브 상피 세포 및 cytoskeleton을 시각화하는 방법을 보여줍니다.

라이브 셀 이미징 및 배아 상피 세포의 정량 분석 Xenopus laevis</em

우리는 창고 기의 미 수정 난자에 여기 mRNA의 주입 후 형광 단백질의 강력하고 효율적인 표현을보고합니다. 이 기초 척색에 미세 주입 기술의 개발은,이 새로운 모델 시스템에서 기술 혁신을 광범위한 생체 내 이미징 및 유전자 특이 조작을 포함하여있는 길을 만들어 줄 것입니다.

형광 단백질의 발현에 창고 기 미 수정 난자에 mRNA의 주입에 의한

원고는 여기 Xenopus의에서 찬란 태그 리간드의 분비 및 확산을 분석하는 방법의 간단한 세트를 제공합니다. 이는 리간드 분포를 수정하는 다른 단백질의 능력을 시험하고 morphogen 기울기 조절 메커니즘에 대한 통찰력을 제공 할 수 있도록 실험을위한 컨텍스트를 제공한다.

공 촛점 분석을 사용하여<em&gt; 아프리카 발톱 개구리 laevis의</em&gt;의 Wnt 및 쉬 Morphogen 그라디언트의 변조기를 조사하기 위해

제노푸스 배아에서 배반구의 지붕에 있는 세포는 만능이며 다양한 조직을 생성하도록 프로그래밍할 수 있습니다. 여기에서는 양서류 배반구 지붕 외식을 분석 시스템으로 사용하여 초기 신경 발달의 주요 생체 내 및 체외 기능을 조사하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

줄기 세포처럼<em&gt; Xenopus의</em&gt; 배아의 Explants는 초기 신경 발달의 특징을 연구하는<em&gt; 체외</em&gt; 및<em&gt; 생체</em

우리는 유능한 외배엽에서 반응을 유도할 수 있는 유전자의 발현을 위한 Xenopus 난모세포 및 동물 캡 시스템을 설명하고 이러한 유전자의 후속 분석을 위한 기술에 대해 논의합니다. 이 시스템은 광범위한 유전자 산물의 기능적 식별에 유용합니다.

를 사용하여 기능성 복제<em&gt; Xenopus의</em&gt; 난자 발현 시스템

모체 유전자 산물의 조작에 사용 제브라 난자의 체외 성숙에 최적화 프로토콜은 여기에 제시된다.

사용 모성 유전자 제품의 기능 조작<em&gt; 체외</em제브라 피쉬&gt; 난자의 성숙

이 프로토콜은 vasculature를 시각화하고 Xenopus tropicalis 의 복잡성을 정량화하기위한 형광 기반의 방법을 보여 줍니다 . 혈관은 생체 내에서 심혈관 질환 발달을 연구하기 위해 유전 적 및 / 또는 약리학 적 조작 후 배아의 박동 심장에 형광 염료를 주입 한 후 수분 내에 영상화 될 수있다.

의 배아 혈관 신생에 대한 시각화 및 정량 분석<em&gt; Xenopus tropicalis</em

우리는 Xenopus laevis 1세포 배아로부터 미니 배아를 만드는 물리적 수축 방법을 설명합니다.

Xenopus mini 배아를 생성하기 위한 신체 조작

이 프로토콜은 마우스 난자의 시험관 내 성숙, 시험관 수정, 그리고 배아를 배반포 단계까지 배아 배양하는 절차를 설명합니다.

생쥐 난자 내 시험관 성숙, 수정 및 착상 전 배아의 배양

배우세요 Xenopus laevis 난모세포 조작 및 체외성숙 기술로 모계단백질 녹다운과 유전자 과발현을 통해 초기 배아발달 메커니즘을 연구하는 방법을 익히세요.

조작 및

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