Name: 리스테리아 단세포 유전자를 사용하여 감염된 마우스에 있는 문화와 심혼 식민지에 있는 심장 세포의 세균성 침략 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: 배우세요 Listeria monocytogenes 심장 세포 침입 평가 방법을 마우스 감염 모델과 세포 배양을 활용하여. 이 기술은 심근염 병원성 규명과 감염 진행 모니터링에 필수적입니다.

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저자는 경쟁 적인 재정적 이익을 보고하지 않습니다.

L. 단세포 유전자는 광범위하고 잘 특징인 인간 병원체, 다른 질병 표현의 다수를 일으키는 원인이 될 수 있는15. 박테리아는 이전에 중앙 신경계에 도달하고 식민지화하고 태아를 개발하기 위하여 혈액 두뇌 장벽 및 태반 태아 장벽과 같은 장벽을 가로질러 배분하는 기능에 대해 설명되었습니다. 이 조직을 식민지화하는 유기체의 생체 내 능력은 종종 표적 장기를 구성하는 배양에서 대표 세포를 침입하는 체외 능력에 의해 보완됩니다. 예를 들어, 코로이드 신경총에서 상피 세포의 침입은 CNS16을식민지화하는 유기체의 능력과 연관되어 있다; 그리고 사악한 열대 성소 이출은 모계 태아 장벽(17)을나타내는 데 사용되었습니다. 이 프로토콜에서, 방법은 간 및 비장의 식민지화에 비해 개별 격리에 대한 심장의 세균 성 식민지화의 비교뿐만 아니라 배양에서 심장 세포의 세균 적 침입을 평가하는 데 유용하다고 설명되었다.
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리스테리아 단세포 유전자는 노인, 임산부, HIV/AIDS를 가진 사람들 및 화학요법을 받는 사람을 포함하여 취약한 인구에 있는 가혹한 질병을 일으키는 원인이 될 수 있는 그람 양성 세포내병원체입니다 1. 이 인구에 있는 감염은 수시로 오염한 식품을 섭취의 결과이고, 대부분의 감염은 대규모 식품 매개 발발과 연관됩니다2,3. 인간과 다른 포유동물에서, L. monocytogenes는 소장의 상피 경계를 가로질러 배설할 수 있고, 그 후에 간4,5로이송된다. 동물 모델은 섭취한 박테리아가 장 내의 담악과 포털 정맥을 통해 간으로 이동하거나 혈류로 막대한 림프절을 통해 퍼지며 간 및 비장에 혈액 선서를 통해 혈액 류로 확산되는 것을 제안한다6,7. 간과 비장에서 박테리아는 전문 식세포뿐만 아니라 상주 한창 세포로 섭취를 중재 할 수 있으며 이러한 장기 내에서 신속하게 감염을 확립합니다. 세균성 하중이 증가함에 따라, 수많은 박테리아는 혈액으로 다시 분산되어 중추 신경계와 태반 (현재)을 포함하여 취약한 조직을 더 식민지화 할 수 있습니다. 이 사이트의 식민지는 뇌막염, 뇌염 및 태아 낙태2를포함하여 인간에서 리스테리오증의 일반적인 표현을 배제합니다.
L. monocytogenes의 선택된 하위 인구는 최근에 심장 조직8내에서 침략하고 복제하는 향상된 능력을 갖는 것으로 나타났습니다. 심장 참여의 증상은 다양하며 내막염과 복막염에서 부터 전도 이상으로 완성된 충만성 심근염에 이르기까지다양하다. L. monocytogenes 심장 케이스의 전반적인 수는 1 년에 낮습니다 그러나 감염의 이 면이 일반적으로 잘 인식되지 않기 때문에 추정될 수 있습니다. 병원체에 의한 심장의 식민지화는 종종 기존의 용기 손상 또는 인공 심장 판막과 같은 호스트 소인이 필요합니다. 그러나, 어떤 심장 손상 및/또는 이상이 없는 경우에 감염된 동물의 심혼을 식민지화하는 그들의 능력에 대해 주목할 만한 확인된 L. monocytogenes의 격리가있습니다 8.
본명에서 조직 배양뿐만 아니라 살아있는 동물 감염에 침입 적인 소심을 이용하여 감염된 동물 내의 심장 조직의 세균성 식민지화를 평가하기 위한 체외 및 생체 내 방법으로 기재된다. 이러한 방법은 감염된 동물의 심장 조직을 식민지화 할 수있는 잠재력을 가진 균주를 식별하는 데 유용할뿐만 아니라 심장 세포 침입을 강화하고 심장 병리학의 변화를 초래하는 세균 성 유전자 제품의 식별에 유용해야합니다. 이러한 방법은 여러 균주 사이의 심부전의 비교를 용이하게. 여기서 설명된 방법에 대해, L. monocytogenes 10403S는 비심혈성 균주를 잘 연구한 대표자로 사용되며 임상 분리 07PF0776은 심장영양균의 대표적인 예로 사용된다. 이 두 균주는 생체 내에서 감염된 마우스의 심장의 체외 및 식민지에서 심장 세포의 세균성 침입에대한 비교를 제공하기 위해 선택되었다. 분리07PF0776은 HIV+ 환자8에서치명적인 부정맥을 일으킨 간 농양에서 회복된 임상 격리이다. L. monocytogenes 분리그들의 독성 잠재력에 다를 수 있습니다., 그리고 리스테리아 면역 억제와 임산부를 감염 하는 성향을 감안할 때, 이러한 인구 내의 사람들은 다른 임상 격리를 평가 하는 동안 주의 행사 해야.

<table><tbody><tr><td>Difco</td><td>BHI 육수 베이스</td><td>237200</td><td>뇌 심장 주입 분말 2kg(한천 제외)</td></tr><tr><td>Difco</td><td>한천</td><td>214510</td><td>과립 한천 2kg</td></tr><tr><td>Difco</td><td>BHI 한천</td><td>241810</td><td>7.5% 한천 함유 뇌 심장 주입 분말 2kg</td></tr><tr><td></td><td>LB 육수 베이스</td><td>12975-084</td><td>루리아 육수 베이스 분말 2kg(한천 제외)</td></tr><tr><td>피셔</td><td>글라스 커버슬립</td><td>12-545-80</td><td>12mm 유리 커버슬립</td></tr><tr><td>Falcon</td><td>24웰 조직 배양 플레이트</td><td>35-3047</td><td>24웰, 플라즈마 처리 조직 배양 플레이트</td></tr><tr><td>Falcon</td><td>14mL 폴리스티렌 튜브</td><td>352051</td><td>14ml 폴리스티렌 튜브</td></tr><tr><td>Falcon</td><td>96웰 U-바닥 플레이트</td><td>35-3077</td><td>비조직 배양 처리된 96웰 플레이트</td></tr><tr><td>Corning</td><td>0.05% 트립신, 0.53mM EDTA(1X)</td><td>25-052-CI</td><td>조직 배양을 위한 트립신 EDTA 원액</td></tr><tr><td>Corning</td><td>DMEM(High glucose, High Pyruvate)</td><td>15-013-CU</td><td>FBS, 글루타민 또는 항생제가 없는 DMEM 배지</td></tr><tr><td>Corning</td><td>Pen/Strep/Glut 용액</td><td>30-009-CI</td><td>조직 배양을 위한 페니실린, 스트렙토마이신 및 L-글루타민의 원액</td></tr><tr><td>혼합물 Corning</td><td>Gentamicin</td><td>30-005-CR</td><td>조직 배양을 위한 겐타마이신 50mg/ml 스톡 용액</td></tr><tr><td>Cellgro(Corning)</td><td>L-글루타민</td><td>25005197</td><td>항생제가 없는 스톡 L-글루타민 솔루션</td></tr><tr><td>Denville</td><td>75cm^2 플라스크</td><td>T1225</td><td>75 cm2 조직 배양 처리 플라스크</td></tr><tr><td>Denville</td><td>1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>2013004</td><td>1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브</td></tr><tr><td>ATCC</td><td>H9c2 심장 근아세포</td><td>CRL-1446</td><td>쥐 심장 근아세포</td></tr><tr><td>Hyclone</td><td>소 태아 혈청</td><td>SH30070.63</td><td>소 태아 혈청</td></tr></tbody></table>

리스테리아 단세포 유전자를 사용하여 감염된 마우스에 있는 문화와 심혼 식민지에 있는 심장 세포의 세균성 침략 평가

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

리스테리아 단세포 유전자는 면역 손상 환자, 노인 및 임산부에서 심각한 침습적 감염을 일으킬 수있는 그램 양성 성 세포 내 병원균입니다. 인간에 있는 listeriosis의 일반적인 표현은 뇌막염, 뇌염 및 태아 낙태를 포함합니다. 침략적인 L. monocytogenes 감염의 중요하지만 훨씬 적게 문서화된 속편은 심혼을 관련시킵니다. 심장 병에서 죽음 비율은 처리에도 불구하고 최대 35%까지 일 수 있습니다, 그러나 아주 거의 심장 조직 및 그것의 결과병학의 L. monocytogenes 식민지에 관하여 알려져 있습니다. 또한, 최근 L. 단세포 유전자의 하위 인구가 심장 조직 내에서 침입하고 성장할 수 있는 향상된 용량을 가지고 있다는 것이 명백해졌습니다. 이 프로토콜은 L. monocytogenes 분리의 심폐소생학을 평가하는 데 사용할 수있는 생체 외 및 생체 내 방법에 대해 자세히 설명합니다. 방법은 H9c2 쥐 심장 근막의 감염뿐만 아니라 감염된 마우스의 심장의 세균 식민지의 결정에 대해 제시된다. 이러한 방법은 감염된 동물의 심장 조직을 식민지화 할 수있는 잠재력을 가진 균주를 식별하는 데 유용할뿐만 아니라 심장 세포 침입및 / 또는 심장 병리학의 변화를 촉진하는 역할을하는 세균 성 유전자 제품의 식별을 용이하게 할 수 있습니다. 이러한 방법은 또한 다중 L. monocytogenes 균주 사이 심혈 성 부속의 직접적인 비교를 제공.

L. monocytogenes의 선택된 분리는 세포 배양및 감염의 마우스 모형에서 심장 세포의 강화한 침략을 전시합니다. 도 1은 한천 매체에서 현탁액의 현탁액을 반점 도금 한 다음 세균성 식민지가 어떻게 나타날 수 있는지를 보여주는 예입니다. 이 방법을 사용하면 많은 수의 천 미디어 플레이트를 사용하지 않고 샘플 내에서 CFO를 정확하게 평가할 수 있습니다. 도 2는 긴장07PF0776의 심장 세포를 침범하는 균주 10403S의 능력을 비교하는 조직 배양 기반 분석의 예를 나타낸다. 10403S에 감염된 세포에 비해 젠타미신 치료에 따른 감염된 H9c2 심장 세포로부터 2배 이상 많은 07PF0776세균CFU를 회수할 수 있다. 2 ~ 4 배의 차이는 이 분석기를 사용하여 심장 tropic 긴장에 대해 일상적으로 관찰됩니다. 도 3은 감염 후 3일 동안 간, 비장 및 감염된 마우스의 심장으로부터 박테리아가 회복된 예를 나...

리스테리아 단세포 유전자는 취약한 인구에 있는 임산부및 뇌막염에 있는 태아 감염을 일으키는 원인이 됩니다. 박테리아의 하위 인구는 심장 조직을 식민지화 할 수 있습니다, 환자와 실험실 동물에 심근염을 일으키는. 여기에서 우리는 감염된 동물에 있는 체외 및 심장 식민지에 있는 L. monocytogenes 심장 세포 침략을 평가하는 방법을 설명하는 프로토콜을 제시합니다.

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

이 절차의 전반적인 목표는 심장 군집화 및 심장 세포 침투의 in vivo 및 in vitro 모델을 사용하여 심장 세포의 미생물 감염을 평가하는 효율적인 방법을 제공하는 것입니다. 이는 먼저 박테리아 배양물을 성장시키고, 박테리아 세포를 수집, 세척 및 인산염 완충 식염수에 재현탁함으로써 수행됩니다. 다음으로, 유리 커버슬립에서 배양된 심장 세포 단층에 박테리아 현탁액을 감염시키거나, 꼬리 정맥 주사를 통해 마우스에 박테리아 현탁액을 접종합니다.그 다음, 세포 외 박테리아를 제거하기 위해 Gentamycin 존재 하에 심장 세포를 배양한 후, 세포를 용해하여 회수합니다. 박테리아 또는 감염된 동물은 감염 후 2~3일 동안 건강 상태를 모니터링한 뒤, 표적 장기를 적출하기 위해 희생시킵니다. 마지막으로, 세포 및 장기 현탁액을 희석하고 스팟 플레이팅(spot plating)법을 사용하여 도말함으로써 세포 또는 표적 장기에 연관된 생존 박테리아 수를 결정합니다.최종적으로, 조직 배양에서 성장시킨 세포의 심장 세포 침입 효율이나 동물에서의 심장 감염 효율 및 정도를 결정하기 위해 agar 배지에서 세균 콜로니 수를 측정합니다. 이 방법은 다양한 임상 및 환경 분리 listeria monocytogenes 균주가 침습성 심장 질환을 일으킬 가능성을 조사하는 데 사용될 수 있습니다. 또한 심장 조직을 표적으로 할 수 있는 다른 미생물 병원체에도 적용할 수 있으며, 프로토콜을 수정하여 관심 있는 다른 장기나 조직을 조사하는 데 사용할 수도 있습니다. 침입 분석을 수행하기 전날, H nine C two 세포가 담긴 24-well 플레이트를 준비하고 본문 프로토콜에 설명된 대로 멸균된 BHI 배지에 원하는 listeria 균주를 접종합니다.PBS에 테스트할 세균 균주를 현탁시킨 후, 24-웰 플레이트의 각 웰에 PBS 세균 용액을 최소 20 µL씩 분주합니다. 플레이트를 부드럽게 흔들어 각 웰에 샘플이 고르게 퍼지도록 한 다음, 37 °C, 습도 95%, 5% CO2 조건에서 45분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 생물안전작업대(biosafety cabinet)로 옮겨 흡입 피펫을 사용하여 각 웰의 배지를 제거합니다.그 후, 커버슬립을 세척하기 위해 각 웰에 따뜻하게 데운 PBS 1 mL를 추가합니다. 마지막으로, 흡입 장치가 연결된 피펫을 사용하여 웰에서 PBS를 제거합니다. 다음으로, Gentamycin이 포함된 DME

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

리스테리아 monocytogenes는 생쥐에서 세균을 세포에 면역 반응과 유전 자화율을 연구를위한 모델 생물이다. 이 방법은 박테리아 부하를 측정하고 리스테리아 감염으로 인한 면역 세포의 변화를 결정하는 외과 분석을위한 생쥐의 간 및 비장의 단일 셀 suspensions를 생성하는 하나 있습니다.

감염된 마우스에 세균 하중과 면역 응답 측정 리스테리아 monocytogenes</em

출처: McMullen, P. D., Freitag, N. E. 리 스테리아 모노사이토제네를 이용한 감염 생쥐의 심장 세포 배양 내 박테리아 침범 및 심장 정착 평가. J. Vis. 경험 (2015)이 영상은 쥐의 꼬리정맥에 리스테리아 모노사이토제네스 를 주입하여 전신 감염을 확립하는 과정을 시연합니다. 이 영상은 박테리아 순환, 장기 정착, 그리고 조직 균질 처리, 연속 희석, 플레이트 부착을 통한 심장 내 박테리아 부하 정량화를 보여줍니다.

리스테리아 모노사이토제네스 꼬리정맥 주입 후 마우스 심장 내 박테리아 부하 정량화

이 비디오는 감염 전파를 연구하기 위해 태반 조직에 감염 모델을 설정하는 방법을 보여줍니다. 체외 태반 장기 배양은 통성 세포 내 기생충인 Listeria monocytogenes에 감염되어 있습니다. 박테리아는 외부 영양막아세포(EVT)에 침입하여 태반 조직에 들어간 다음 세포 간 확산을 통해 다른 세포로 증식합니다.

생체 외 장기 배양에서 박테리아 감염 모델을 확립하는 기술

이 비디오는 리스테리아 모노사이토제네스에 감염된 관류된 쥐 뇌의 감염성 박테리아 부하를 정량화하는 방법을 보여줍니다.

리스테리아 모노사이토제네스 감염에 따른 쥐 뇌의 박테리아 집락화 평가

이 논문은 사용하는 마우스의 경구 감염에 대한 새로운 방법을...

경구 전송<em&gt; 리스테리아</em&gt; 오염 된 음식의 섭취를 통해 마우스의

리스테리아 균은 자주 세포 내 기생의 연구를위한 주요 모델로 사용되는 그람 양성 세균 병원체이다. 후반 L. 이미징 소 간섭 RNA 화면의 문맥 내 감염 단계 모노 사이토 겐은 표적 숙주 세포의 세균 감염에 필요한 세포 경로의 글로벌 학습을 허용한다.

세균성 병원체에 의해 세포 감염을 조사하기 위해 InlC 분비 이미징<em&gt; 리스테리아</em

연쇄상구균 폐렴은 심장에 별개의 비화농성 현미경 병변을 형성합니다. 요약된 것은 심장 미세 병변 형성의 쥐 모델에 대한 프로토콜입니다. 현미경을 사용한 미세 병변 시각화, 초기 미세 병변과 후기 미세 병변 구별, 회복기 동물의 심장에서 심장 리모델링을 감지하는 방법에 대한 지침이 제공됩니다.

시각화<em&gt; 폐렴 구균</em&gt; 심장 Microlesions 및 후속 심장 리모델링 내

이 프로토콜은, 리스테리아의 EGD 균주 (L. 모노 사이토 겐)을 C57BL / 6J 마우스에 접종하고, 자연 살해 (NK) 세포, 자연 살해 T (NKT) 세포에 의한 인터페론 - γ (IFN-γ) 응답을 측정하는 방법을 설명 적응 T 포스트 감염 림프구. 이 프로토콜은 또한 병원균의 수정 된 LD (50) 투여로 감염 후 쥐에서 생존 연구를 수행하는 방법에 대해 설명합니다.

와 실험 감염<em&gt; 리스테리아</em&gt; 호스트 인터페론-γ 응답 유학을위한 모델로

Enterohemorrhagic 생물 발광 표시 된 박테리아를 사용 하 여 대장균 (EHEC) 식민지에 대 한 마우스 모델의 자세한 프로토콜 제공 됩니다. 비-침략 적 vivo에서 이미징 시스템 라이브 동물에 의해 이러한 발광 박테리아의 탐지 EHEC 식민의 우리의 현재 이해를 미리 수 있습니다.

생물 발광 시스템 비-침략 적 비보에 의해 Murine 호스트에서 Enterohemorrhagic 대장균 식민지의 검출

감염, 동안 Listeria monocytogenes 는 두뇌를 식민지로 혈액 뇌 장벽을 교차 수 있습니다. 이 프로토콜, 쥐의 감염에 따라 장기의 세균성 식민지를 평가 하는 방법을 보여 줍니다. 뇌 실질에 세균 숫자의 특정 결정에 대 한 전체 기관 살포를 수행 하는 절차를 제공 합니다.

Listeria monocytogenes 뇌의 감염

우리 둘 다 생체 외에서 그리고 vivo에서 감염 분석 호스트 인코딩 요인의 활동을 분석 하는 데 사용할 수 있습니다 설명 합니다.

셀룰러 및 Organismic 수준 호스트 응답 세균성 병원 체 프로브를 사용 하 여

배우세요 Listeria monocytogenes 심장 세포 침입 평가 방법을 마우스 감염 모델과 세포 배양을 활용하여. 이 기술은 심근염 병원성 규명과 감염 진행 모니터링에 필수적입니다.

리스테리아 단세포 유전자를 사용하여 감염된 마우스에 있는 문화와 심혼 식민지에 있는 심장 세포의 세균성 침략 평가

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