Name: 자동화 된 이미지 처리 방식을 사용하여 마우스 사교성의 실험 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: 학습하세요 자동화된 영상 분석을 이용한 마우스 사교성 정량화 방법을. 자폐 스펙트럼 장애 연구에서 약물 선별 효율성을 높이고 정확한 행동 평가를 가능하게 합니다.

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이 연구는 버지니아의 연방 건강 연구위원회에서 교부금에 의해 지원되었다.

1) 실험 과정과 2) 자동 분석 : 설명의 편의를 위해 프로토콜은 두 부분으로 나누어 져있다. 모든 동물은 실험 동물 (15)의 관리 및 이용에 대한 안내에 따라 처리하고, 모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 1. 실험 절차 <ol><li> nonsocial 사회, 중성 중간 구획 (그림 1) : 검은 비 반사 유리 야 직사각형 상자 세 구획으로 나누어 (52 × 25 X 23cm 3)이다 케이지를 설정합니다. 세션에서 최종 구획의 각 반전 와이어 컵을 놓고 I (아래 설명) II 및 세션 II 동안 자극 마우스를 수용. </li><li> 케이지는 시야를 채우는 방식으로 카메라를 설정합니다. 조명이 마우스의 동작을 방해 할 수 있기 때문에,에서 간접 광에서 오는 케이지 안에 이하 3.5 룩스의 휘도를 유지백열 전구 및 상향 방향의 카 바닥에 측정 하였다. 또한 감지 할 수 있지만, 카메라를 검출 할 수있는 쥐 적외선 광원을 사용한다. 720 × 480 표준 해상도의 모든 동영상을 기록합니다. </li><li> (이하 &quot;기준 프레임&quot;이라고합니다) 나중에 이미지 처리를위한 빈 케이지의 단일 프레임을 기록하고 그레이 스케일 이미지로 저장합니다. </li><li> 세션 I은 : 새장에 테스트 마우스를 소개하고 세션의 시작 (자동 분석 비교) 나타내는 케이지 위에 손을 흔들어. 10 분 동안 기록 영화. 10 분의 끝에서, 원래의 케이지에 다시 넣어 마우스. </li><li> 세션 II는 : 반전 컵 중 하나에 자극 마우스를 착용 할 것 (카운터). </li><li> 자극 마우스 왼쪽 또는 오른쪽에 반전 컵에 반전 컵에 있는지 여부를 선택하기 위해 &quot;사회 왼쪽&quot;또는 &quot;사회적 권리&quot;버튼을 사용합니다. 참고 : 자극 마우스로 반전 컵은 다른 반면은 &quot;사회 컵&quot;라고합니다컵 &quot;nonsocial 컵&quot;. 있는 사회 컵 사회적 구획라고하는 구획의 nonsocial 한잔과 함께 함은 nonsocial 구획하고, 중간 칸은 &quot;중립 함&quot;입니다. </li><li> 새장에 테스트 마우스를 소개합니다. 케이지 위에 웨이브 손 세션의 시작을 표​​시한다. 10 분 동안 기록 영화. 중요한 것은, 세션 III를 시작 반전 컵을 제거하기 전에 사교성 장치에서 쥐를 유지합니다. </li><li> 세션 III :, 반전 컵을 제거 모두 쥐를 해제하고 테스트 및 자극 쥐가 서로 자유롭게 상호 작용할 수 있습니다. 케이지 위에 웨이브 손 세션의 시작을 표​​시한다. 10 분 동안 기록 영화. 10 분의 끝에서 다시 각 케이지 모두에 마우스를 넣어. </li></ol> 2. 자동 분석 주 : (2)의 명령은 그래픽 사용자 인터페이스를 통해 발행되는 콘 (도 2 참조)우리의 소프트웨어를 trols. 여기에서 우리는 우리의 소프트웨어가 있습니다 단계별 처리를 설명; 또한이 소프트웨어는 사용자 입력없이 배치 모드에서 분석을 수행 할 수있다. <ol><li> 모든 영화의 경우, 다음의 처리 단계를 실행 : <ol><li> 로드 무비 (Load 버튼을 클릭). </li><li> 분석 프로그램을 케이지 경계 구획 경계 위치와 컵의 위치를​​ 알려주 케이지 구성을 선택한다. 네 저장된 구성 중 하나를 선택하거나 수동으로 모든 좌표를 조정합니다. 참고 : 구성은 일반적으로 한 실험에서 다음에 변경되지 않으므로 재사용 할 수 있습니다. </li><li> 동영상의 각 프레임에 대해, 다음의 처리 단계 (2.1.3.1-2.1.3.6)을 수행한다. <ol><li> 은 &quot;그레이 스케일&quot;버튼을 클릭하여 그레이 스케일로 프레임을 변환합니다. </li><li> 디지털 &quot;빼기&quot;버튼을 클릭하여 그레이 스케일의 참조 프레임을 (단계 1.3 참조) 뺍니다. 주 :이 단계의 목적은 화소 VA 만드는 것이다매우 가까운 프레임의 역병은 마우스의 위치를​​ 제외하고 모든 곳에서 제로입니다. </li><li> 블랙에 특정 임계 값 레벨 아래의 모든 픽셀을 설정하여 프레임을 이진화, 흰색에 그 수준 위의 모든 픽셀 (이하 &quot;이진화&quot;버튼을 클릭). 주 : 아이디어는 마우스의 화소는 일반적으로 나머지 픽셀보다 더 높은 값을 가질 수 있기 때문에, 마우스 화소가 흰색과 다른 모든 픽셀 검정 될 것이라는 것이다. 최적 임계치 레벨은 조명 조건에 의존하고, 영화에 걸쳐 마우스 형상을 평가함으로써 결정될 수있다. 임계 값이 너무 낮게 선택되면, 마우스가 너무 크게 나타나고, 마우스에 속하지 않는 화소가 백색 착색 될 수있다. 임계 값이 너무 높은 경우, 마우스가 작아 져 끊어 조각으로 분해 할 수있다. 기록 영화에서 최적의 임계 값은 20과 35 사이 (0 ~ 255 규모에) 항상 있었다. </li><li> ERO 진수 화 사진 전자 번, 그 다음 다음 13 2E 번 팽창 (13) 침식드 다시 전자 번 버튼 &quot;EROD / DIL을&quot;밀어. 참고 :이 절차 목적은 꼬리를 제거하는 것입니다. 사용 된 해상도 (× 480 720), 대한 전자 = 3은 모든 상황에서 일했다. 주 : 소프트웨어가 사진의 손의 존재를 자동으로 검사 (영화 등의 기록시 손이 세션의 시작을 표​​시하는 화상을 흔들며된다). 손이 있으면 손을 마우스에 비해 훨씬 크기 때문에, 이진화 된 프레임에서 비정상적으로 많은 흰색 픽셀이있을 것이다. 손의 존재를 조건은 치화 프레임 10,000 이상의 백 화소가 있다고한다. 소프트웨어는 I, II 및 III, 손 움직임이 발생하는 프레임의 범위를 검출하여 세션의 시작을 결정한다. </li></ol></li></ol></li><li> 다음과 같은 세션에서 I과 II, 계속 : <ol><li> 흰색 픽셀 세트의 가장 큰 연결된 구성 요소를 감지 ( &quot;LComp&quot;를 클릭). 참고 : 목적 O를(F)이 단계는 마우스, 예를 들어, 세션 II의 자극 마우스의 움직임에 의해 야기 속하지 않는 흰색 픽셀을 제거한다. 가장 큰 연결된 구성 요소는 거의 모든 프레임 마우스입니다. </li><li> &quot;엔드 찾기&quot;를 클릭하여 (마우스의 &quot;끝&quot;이라고 함)이 가장 먼 흰색 픽셀을 결정합니다. 주 : 소프트웨어가 첫 번째 프레임에 양단 각각에 대해, 즉 양단의 연속성을 확립 그들이 속한 후속 프레임의 단부의 어느 것이다. 일반적인 생각은 프레임이 고속으로 기록되므로, 단부는 한 프레임에서 다음 프레임까지 이동할 수없는, 그래서 그 다음에 하나의 프레임의 단부의 정확한 지속에 대한 거리의 합을 최소화하는 것을하다 끝은 이동합니다. 자세한 세부 사항에 대한 설명을 참조하십시오. </li><li> 코입니다 마우스하는 쪽을 결정합니다. <ol><li> 방향을 결정하는 관찰하여 마우스 이동 방법 무게 중심 (COG)프레임으로부터 변경 (톱니 바퀴의 움직임이 마우스의 모든 화소들의 합 모션이다) 프레임한다. 주 : 화소 P (1)의 일련의 COG는, ..., 좌표 값 (P) n을 1, ..., Xn에은으로 정의되고, X : <img alt="식 (1)" src="/files/ftp_upload/52508/52508eq1.jpg" /> 마우스는 일반적으로 (자신의 코를 향해, 즉) 앞으로 이동합니다. 수백 프레임의 섹션에서 헤드 / 테일 검출에 매우 높은 신뢰성은 항상있다. 참고 : 소프트웨어가 자동으로 감지 어떤 방향으로 마우스가 이동 종료 결정한다 이를 코로 확인하고 영화에 빨간색 원으로 표시됩니다. 검출 노즈 프레임마다 적색 동그라미로 표시 될 때, 사용자가 검색의 품질을 검사 할 수있다. </li></ol></li></ol></li><li> 다음과 같이 세션 III에서, 계속 : <ol><li> 흰색 픽셀이 가장 큰 구성 요소를 감지합니다. <ol><li> 모두 오전 허용 크기 인 경우여러개 중력 그 중심 (톱니)은 이전 프레임의 마우스 톱니이 두 구성 요소를 두 마우스 고려와 호환된다. </li><li> 이 거리는 다음 (그들이 이전 프레임 이후 20 % 이상 변화하지 않은 경우, 마우스는 허용 가능한 크기를 고려하고, 그 차이가 마우스 프레임 사이의 시간에 이동할 수있는 거리보다 크면 호환 같이 연속하는 2 프레임의 톱니 고려 여러 개별 마우스의 움직임을 분석함으로써 실험 시리즈의 제제의 일부로서 결정될 수있는 최대 마우스 속도에서 (I 및 II 세션에서와 같이). 주 :이 큰 구성 요소가 마우스 허용되지 않는 크기, 또는 톱니가 이전 프레임의 것과도 다른 경우, 가장 큰 두 성분으로 허용 크기까지 소프트웨어가 자동 치화 임계 값을 증가시키고, 그 톱니와 호환 이전 프레임들. </li></ol></li><li> 에서 테스트 마우스를 클릭첫번째 프레임. 세션 III의 모든 프레임 테스트 및 자극 마우스 모두를 식별하기 위해 2.3.1의 분석을 사용합니다. </li><li> 하나의 마우스가 사회적으로 다른 접근하는 세션 III에서 프레임을 확인합니다. 주 : 소프트웨어가 자동으로 마우스 사이의 거리가 마우스의 전형적인 상호 작용 거리보다 작다는 것을 확인하여이 단계를 구현 (우리는 2cm 사용). </li><li> 소프트웨어가 사용자 검출 방법과 동영상의 짧은 세그먼트를 재생하는 경우,이 방법은 시험 마우스 또는 어느 것에 의해서도 시험 마우스 사회적 회피하여 사회적 접근 자격 여부를 지시하는 버튼을 클릭한다. 참고 :이 테스트 마우스 인 마우스 알려진 경우 단계 2.3.4은이 자동화 할 수 있습니다. 이 정보는 마우스는 서로 너무 가까워 질 때 손실 (또는 서로의 위에 올라) 및 우리가 이후 아직 우리의 소프트웨어에 의해 확실하게 검출 수행 할 수있는 방식으로 마우스를 라벨 할 수있는 방법을 발견하지 얻는다 때문에 자신의 행동에 영향을 미치지, 우리는에 복귀했다지금은 수동 분류. </li></ol></li><li> 로드 버튼을 사용하여 처리 영화,로드 무비를 알아보고자 하였다. <ol><li> 세션 1의 첫 번째 프레임을 표시 세션 시작 1을 클릭 (또는 세션 2의 첫 번째 프레임을 표시 세션 2를 시작합니다). </li><li> 동영상을 재생 및 중지 재생 / 정지를 클릭합니다. 참고 : 처리 된 영화는 다르게 색 원으로 표시 머리와 꼬리와 마우스를 표시합니다. 모든 사교성 조치가 화면에 표시되고 동영상이 재생으로 업데이트됩니다. </li><li> &quot;내보내기&quot;를 클릭하여 Excel 형식으로 내보내기 사교성 데이터. </li><li> 하나의 엑셀 파일로 폴더에있는 모든 영화의 모든 데이터를 컴파일 &quot;컴파일 데이터&quot;를 클릭합니다. </li></ol></li></ol>

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</ol>

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찍고 마우스 및 자동 동영상 분석을 결합함으로써, 우리는 저렴한 가격, 신뢰성이 높은 처리량 스크리닝 기술을 만들었습니다. 자동 분석의 정확도는 100 개 이상의 영화 매뉴얼 분석의 결과와 비교 하​​였다. 프레임의 프레임들의 대다수 (&gt; 99 %)에서의 마우스의 코 양호한 정밀도로 식별된다. 영화의 약 80 %는 임의의 수정이 필요하지 않도록 (소수) misdetections보다도, 사교성 측정에 영향을 미치지 않는다. 지금까지 가장 일반적인 문제는 머리와 꼬리가 혼란, 그래서 우리는 소프트웨어에서 영화 세그먼트에 대해 머리와 꼬리를 전환 할 수있는 간단한 방법을 포함했다는 점이다, misdetections를 포함 할 그 영화. 영화를 확인하고 모두 misdetections를 해결하기위한 본 경우에도 평가 시간이 매우 짧게 유지되도록,이 검사는 약 3 배 실시간 속도로 수행 될 수있다. 영화의 섹션실린더 중 하나가 더...

장애인 사교성은 자폐증 스펙트럼 장애 (의 ASD) 1, 2를 포함하는 신경 발달 장애의 범위의 기본 증상 도메인 중 하나입니다. 그것은 심각한 관계를 개발하는 환자의 능력을 제한하고 크게 환자, 가족, 보호자 2,3 영향을 미칩니다. 더 나은 치료를 손상 사교성 기초가되는 메커니즘을 이해하고 개발하기위한 노력의 일환으로 여러 마우스 모델 1,4-9을 연구 하였다. 그러한 변형은 BALB / C 마우스, ASD5 8-12 환자에서 본 기능을 닮은, 현저하게 낮은 사교성을 나타내는 타고난 변형이다. 예를 들어, BALB / C 마우스는 사회적 접근과 스위스 웹스터 비교 균주 (10)보다 자극 마우스 (예를 들어, 사회 회피)에 의한 사회적 접근에 일반적으로 부정적인 응답의 낮은 주파수를 표시합니다. 제안 된 치료가 effectiv 있는지 여부를 테스트하려면사교성을 높이는 전자는 객관적 조치가 필요하다. 널리 받아 워크 세 구획되어있는 표준 장치에서 사교성를 분석하는 것이다 (도 1 참조). 왼쪽과 오른쪽 구획 각각은 사회적으로 두드러진 자극 마우스를 수용 반전 와이어 컵이 포함되어 있습니다. 시험 마우스 세에서 10 분 간격으로 (세션 I-III)하기위한 장치로 방출된다 세션 II 및 III 시험 마우스의 사교성의 다양한 측면을 평가하는 동안 세션 나는 시험 마우스의 운동 활성을 평가합니다. 세션 I에서, 시험 마우스 장치에 적응시킨다. 이 세션에서, 시험 마우스가 다른 구획 사이하게 전이의 수를 측정한다. 중요한 것은, 사교성 측정은 표준 3 구획에있어서 운동 활성에 의존 얻어진 감소 된 운동 활성의 SOCi 해석을 혼동 할능력 데이터. 세션 II, 시험 마우스 자유롭게 이동하고 자극 마우스 반전 컵 중 하나에 배치된다 (카운터). 자극 마우스는 4 주령 이계 수컷 ICR 마우스, 나이와 성별 일치 테스트 마우스에 있습니다. 자극 마우스는 사회 구획으로 지정 측면에서 거꾸로 컵에 동봉하고, 빈 반전 컵은 nonsocial 구획으로 지정 측면에 배치됩니다. 세션 II, 시험 마우스의 사교성은 (는) (이하 2cm 거리)는 &quot;nonsocial&quot;거꾸로 컵 근처에 소비 한 시간 대 &quot;사회&quot;거꾸로 컵 근처에 소비 한 시간을 비교하여 정량화하고, 시간을 기준으로한다 그것은이 nonsocial 실에서 소비 한 시간 대 사회 구획에 보낸다. 스위스 웹스터 마우스 비교기 사회적 구획 및 사회에 대한 유의적인 환경을 보여주지 BALB / c 마우스에 비해 사회적 반전 컵 근방 훨씬 많은 시간을 소비거꾸로 컵 또는 사회적 실 (12). 세션 III에서, 테스트 및 자극 마우스 (반전 컵이 제거) 자유롭게 상호 작용할 수 있습니다. 구획 사이의 사교성의 조치에 박힌 행동과 전환을 안정적으로 테스트 및 자극 마우스와 분석 간의 자유로운 상호 작용의 세 번째 10 분 세션에서 얻을 수있다. 이 보고서에서 테스트 마우스의 사교성은이 조치를 통해 정량화 : 그것은 사회적 접근이 자극 마우스를 향해 (코 첫번째) 전진으로 정의 자극 마우스,으로 만드는 사회적 접근 방법 1) 수를되도록 코는보다 2cm 떨어진 자극 마우스에서이다; 2) 자극 마우스에 의한 사회적 접근의 avoidances의 수. 이 켜거나 자극 마우스에서 멀리 이동하거나 일시적으로 자극 마우스 후 ( &quot;행동을 동결&quot;) 이동 중지 된 경우 테스트 마우스를 접근 한 경우 테스트 마우스는 접근 방식을 피하는 것으로 간주됩니다. BALB /c 마우스 스위스 웹스터 비교기 10 균주에 비해 자극 마우스 자극 마우스에 의한 사회 접근법 부정적인 응답의 수가 증가 향해 이루어지는 사회적 접근법의 수의 감소를 나타낸다. 행동 영화의 평가는 전통적으로 (아마도 감소 속도) 신중 영화를보고 마우스 특정 구획 또는 반전 된 컵 (10)의 하나의 근처에 소비하는 시간을 스톱워치를 활성화함으로써, 즉 수동으로 수행되었다. 이 방법은 따라서 반복 동영상의 시청 요구이며, 아주 시간 소모적. 또한, 정밀도가 마우스 반전 컵 2cm 내에 있는지 여부를 인식하는 스톱워치 및 측정 능력 평가자의 반응 시간에 의해 제한된다. 최근 작업이 화합물에서 (D 세린과 D-시클로 세린)가 BALB / c 마우스 9,10,12에 사교성을 복원하는 효과가 입증되었다. 그것은 두 구성 요소의 MODU 것으로 알려져있다늦은 공지 된 NMDA 수용체는 사회적 행동 2,12에서 중심적인 역할을한다. 화합물의 대규모 어레이는 잘 정의 된 다양한 방식으로 NMDA 수용체 활성을 조절하는 것으로 알려진 한 ASD 처리의 침투의 잠재력이 화합물 우선 매우 바람직한 평가를위한 빠른 자동있어서의 신속한 평가를하게된다. 아래에서 설명하는 마우스 사교성의 평가를 위해 개발 한 자동 분석 절차입니다. 이는 마우스 나 마우스의 위치를​​ 식별하는 마우스 영화의 모든 프레임의 화상 처리 방법을 사용한다. I 및 II 세션에서, 상기 코 위치를 검출하고 사교성 측정을 계산하는 데 사용한다. 세션 III에서는 자동으로 모든 접근을 감지하지만, 수동 분류 (사회적 접근, 사회적 회피, 또는 기타)가 필요합니다.

<table><tbody><tr><td>플렉시 글라스 케이지</td><td>Norva Plastics, Norfolk, VA</td><td>맞춤 제작</td><td>원고에 설명 된 치수 및 레이아웃, 필요에 따라 조정할 수 있습니다 . 이미지 처리를 용이하게하기 위해 비 반사 플렉시 글라스를 사용하십시오</td></tr><tr><td>와이어 컵</td><td>주방 플러스</td><td>315</td><td>자극 마우스를 수용하기 위해 하나, 빈</td></tr><tr><td>비디오 카메라</td><td>소니</td><td>HDR-PJ790</td><td>다음과 같은 모든 카메라로 교체 가능 비교 가능한 사양</td></tr><tr><td>OpenCV(이미지 처리 라이브러리)</td><td>Willow Garage</td><td>N/A</td><td>모든 최신 이미지 처리 라이브러리 사용할 수 있습니다.</td></tr></tbody></table>

자동화 된 이미지 처리 방식을 사용하여 마우스 사교성의 실험 평가

Experimental Assessment of Mouse Sociability Using an Automated Image Processing Approach

마우스 사교성을 높이기위한 약물을 시험하기위한 바람직한 모델 생물이다. 우리 실험 마우스 표준화기구에 배치되어 해당 동작은 세 가지 세션 (호출 세션 I, II 및 III)을 평가하는 마우스 사교성을 정량하는 방법을 제시한다. 장치는 세 개의 구획 (그림 1 참조)이, 왼쪽과 오른쪽 구획 ( &quot;경기 부양 마우스&quot;라고 함) 마우스를 수용 할 수있는 반전 컵이 포함되어 있습니다. 세션 I에서, 시험 마우스 케이지에 넣고 그 이동성 구획간에 천이의 수에 의해 특징된다. 세션 II에서, 자극 마우스 반전 컵 중 하나에 배치되어 상기 테스트 마우스 사교성은 그것이 비어 반전 컵 대 동봉 자극 마우스를 포함하는 컵 근방 보내는 시간의 양에 의해 정량화된다. 세션 III에서, 반전 된 컵이 제거<html> D 두 마우스는 자유롭게 상호 작용합니다. 세션 III의 시험 쥐의 사교성은 그 자극 마우스 향해 접근하게 사회의 숫자로하고 자극 마우스에 의한 사회 접근을 방지하는 횟수에 의해 정량화된다. 영화의 자동화 평가 세션 I과 II의 모든 설명 사교성 조치의 결정 수있는 테스트 마우스의 코 검출 (세션 III에를 접근은 자동으로 식별하지만 수동으로 분류된다). 코를 찾으려면 빈 케이지의 화상 디지털 동영상의 각 프레임으로부터 감산되고, 결과적인 이미지는 마우스 픽셀을 식별 치화된다. 마우스 꼬리는 자동으로 제거되고, 나머지 마우스의 두 개의 가장 먼 점들이 결정된다; 이러한 코와 꼬리의 기지 가까이에 있습니다. 마우스의 움직임을 분석하여 연속 인자를 사용함으로써, 코 식별된다. <img alt="&lt;/ HTML">&quot;그림 1&quot;SRC = &quot;/ 파일 / ftp_upload / 52508 / 52508fig1.jpg&quot;/&gt; 3 세션 동안 사교성 그림 1. 평가 세션 I (상) :.. 케이지에 테스트 마우스의 적응도 세션 II (가운데). 자극 마우스를 거꾸로 컵에 동봉되는 동안 테스트 마우스가 케이지에서 자유롭게 이동 세션 III (아래) : 테스트 마우스와 자극 마우스 모두 서로 자유롭게 이동과 상호 작용을 할 수있다.

그림 3은 빈 케이지와 행동 영화의 컬러 프레임을 보여줍니다. 마우스는 아직 케이지에 도입되지 않았습니다. (사회적 nonsocial) 컵 및 구획 경계의 위치는 중첩된다. 도 4에 도시 된 참조 프레임으로 사용 된 비어있는 케이지의 색 프레임은 8 비트 그레이 스케일로 변환된다. 기준 프레임은 캡쳐 된 동영상의 모든 다른 프레임으로부터 감산된다. 그림 5는 중첩 구획 경계와 컵의 위치를 다시, 세션 I 동안 영화에서 프레임 중 하나를 보여줍니다. 참조 프레임을 차분 프레임이라고 샘플 프레임 결과로부터 감산되어,도 6에 도시된다. 도 7은 상기 차분 프레임의 진화 버전이다. (섹션 2.1.3.3 참조). 그림은 또한 코 (빨간색 원)의 위치와 TA의 기본을 보여줍니다김정일 (...

이 프로토콜은 마우스 사교성을 정량하는 방법을 설명한다. 그들이 이동하고 특별한 케이지에서 상호 작용하는 마우스는 녹화됩니다. 동영상 처리가 뛰어난 정확성과 신뢰성 사교성의 자동화 된 정량화 수 있습니다.

Mouse is the preferred model organism for testing drugs designed to increase sociability. We present a method to quantify mouse sociability in which the ...

자동 분석과 결합된 이러한 행동 실험의 전반적인 목표는 생쥐의 사회성을 시간 효율적인 방식으로 정량화하는 것입니다. 이 방법은 자폐 스펙트럼 장애가 검증된 생쥐 모델에서 사회성을 증가시키는 약물을 신속하게 스크리닝하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 자동 분석을 도입함으로써 얻는 주요 장점은 분석 프로세스를 가속화하여 스크리닝 효율성을 높인다는 점입니다.후보 화합물의 단일 용량에 대한 실시간 시각적 스크리닝에 50시간 이상이 소요되기 때문에 마우스 사회적 행동을 평가하기 위한 자동화된 방법의 필요성이 제기되었습니다. 영상 후반부에서 저의 대학원생인 Frency Varghese가 자동 분석 방법을 시연할 것입니다. 우선 3구획의 검은색 벽 케이지를 설정하는 것부터 시작하십시오.첫 번째 세션을 위해 케이지의 각 끝단 구획에 빈 와이어 컵을 거꾸로 뒤집어 배치하십시오. 이제 케이지를 위에서 내려다볼 수 있도록 비디오 카메라를 준비하십시오. 세 개의 구획이 모두 최소 720 x 480 픽셀의 해상도로 보여야 합니다.그런 다음 케이지 내부 바닥에서 측정했을 때 3.5 Lux 이하가 되도록 간접 백열등으로 조명합니다. 또한 카메라가 감지할 수 있는 수준으로 적외선을 조사하여 케이지를 비춥니다. 참조용으로 빈 케이지의 단일 프레임 이미지를 촬영합니다.첫 번째 세션을 위해 테스트용 마우스를 케이지에 넣습니다. 그런 다음 비디오의 자동 분석을 시작하기 위해 케이지 위로 손을 한 번만 흔들어 줍니다. 마우스가 10분 동안 테스트 케이지를 탐색하도록 둡니다.그런 다음 마우스를 원래의 케이지로 돌려보냅니다. 두 번째 세션에서는 자극 마우스를 두 개의 뒤집힌 컵 중 하나 아래에 둡니다. 컵의 선택은 균형 설계(counterbalance) 방식으로 결정합니다.소프트웨어에서 자극 쥐(stimulus mouse)가 놓인 컵을 지정하십시오. 명명 규칙에 따라, 쥐가 들어 있는 컵은 사회적 컵(social cup)이며, 다른 컵은 비사회적 컵(nonsocial cup)입니다. 구획(compartment) 또한 이와 유사한 방식으로 명명합니다.첫 번째 세션과 마찬가지로 손을 흔들어 두 번째 세션의 시작을 알립니다. 두 번째 세션이 끝나면 뒤집어 놓은 컵을 제거하여 두 번째 마우스를 방출합니다. 다시 한번 손을 흔들어 세 번째 세션의 시작을 알리고, 두 마우스가 테스트 케이지 내에서 10분 동안 상호작용하도록 둡니다.10분 후 두 마리의 생쥐를 모두 홈 케이지로 돌려보냅니다. 이 섹션에서는 사용자 인터페이스를 사용하여 동영상을 처리하는 방법을 설명합니다. 하지만 사용자 입력 없이 빠르게 분석할 수 있는 일괄 처리 모드 분석도 가능합니다.Load 버튼을 사용하여 영상을 불러오는 것으로 시작하십시오. 그런 다음 케이지 구성을 선택합니다. 분석 프로그램이 케이지 경계, 구획 및 컵의 위치를 찾습니다.네 가지 사전 설정 구성 중 하나를 선택하거나 좌표를 수동으로 조정하십시오. 이제 동영상의 각 프레임에 대해 다음 처리 단계를 수행합니다. 먼저 프레임을 그레이스케일로 변환합니다.둘째로, 준비 과정에서 생성한 그레이스케일 참조 프레임을 감산하여 마우스 위치를 제외한 모든 영역의 픽셀 값을 0으로 만듭니다. 셋째로, 임계값 이상의 밝기를 가진 모든 픽셀은 흰색으로, 나머지는 검은색으로 설정하여 프레임을 이진화합니다. 조명 조건에 맞게 이 설정을 조정하십시오.이제 Erode/Dilate 함수를 사용하여 이미지에서 꼬리 부분을 제거합니다. 먼저 이진화된 이미지를 세 번 침식(erode)시킵니다. 그 다음 프레임을 여섯 번 팽창(dilate)시킵니다.그런 다음 프레임을 세 번 더 침식시킵니다. 이는 다른 픽셀 해상도를 사용하는 경우 조정이 필요할 수 있습니다. 손의 움직임은 흰색 픽셀 부피의 거대한 도약으로 쉽게 식별됩니다.이를 통해 세션 시작과 세션 순서를 자동으로 감지할 수 있습니다. 각 세션 내에서 L/Comp 명령을 사용하여 흰색 픽셀의 가장 큰 구성 요소를 감지하십시오. 이렇게 하면 마우스에 해당하지 않는 픽셀이 제거됩니다.그런 다음 Find Ends 기능을 사용하여 흰색 픽셀의 가장 큰 컴포넌트 내에서 가장 멀리 떨어진 두 픽셀을 결정합니다. 이 픽셀들이 각각 코와 꼬리에 해당합니다. 소프트웨어는 흰색 픽셀 객체의 무게 중심(COG)을 결정하고, 프레임 간의 이동 방향을 계산합니다.두 마리의 마우스가 포함된 세션의 경우 두 개의 객체를 추적해야 합니다. 동일한 명령 세트를 사용하여 가장 큰 두 개의 흰색 픽셀 객체를 선택하고 방향을 설정하십시오. 소프트웨어가 프레임별로 무게중심(COG)을 자동으로 확인합니다.어느 한 객체의 크기가 20% 이상으로 변하거나 무게 중심(COG)이 생쥐가 이동할 수 있는 거리보다 더 멀리 이동하는 경우, 이러한 기준이 충족될 때까지 이진화 임계값이 자동으로 증가합니다. 소프트웨어는 프레임 간의 무게 중심을 자동으로 확인합니다. 어느 한 객체의 크기가 20% 이상으로 변하거나 무게 중심이 생쥐가 이동할 수 있는 거리보다 더 멀리 이동하면, 이러한 기준이 충족될 때까지 이진화 임계값이 자동으로 조정됩니다.객체 간의 거리가 2cm 이내일 때 상호작용이 자동으로 감지됩니다. 이러한 세그먼트들이 사용자 입력물을 위해 재생됩니다. 각 세그먼트에 대해 테스트 마우스의 관점을 사회적 회피(Social avoidance), 사회적 접근(Social approach) 또는 해당 없음(Neither) 중 하나로 표시하십시오.자동 분석을 검증하려면 Load 버튼을 사용하여 영상을 불러오십시오. 그런 다음 Start Session 1을 클릭하여 해당 세션의 첫 번째 프레임을 표시합니다. Play/Stop 명령을 사용하여 재생을 제어하십시오.처리된 영상에서는 각 마우스의 머리와 꼬리에 서로 다른 색상의 원이 표시됩니다. 또한 사회성 측정 수치가 화면에 표시되며 재생 중에 업데이트됩니다. 자동 분석 과정에서 발생한 오류를 수정하십시오.가장 흔한 오류는 머리와 꼬리가 뒤바뀌는 현상으로, 인터페이스의 도구를 사용하여 수정할 수 있습니다. 이러한 오류는 비디오의 약 20%에서 발생합니다. 드문 경우로 더 복잡한 오류가 발생하면, 특정 일련의 비디오 프레임 전체에서 마우스의 코 위치를 수동으로 지정함으로써 대개 해결할 수 있습니다.검증이 완료되면 내보내기(Export) 기능을 사용하여 사교성 데이터를 스프레드시트 형식으로 내보내십시오. 여러 영상의 데이터를 하나의 스프레드시트로 내보내려면 영상들이 하나의 폴더에 묶여 있어야 하며, 데이터 컴파일(Compile Data) 기능으로 해당 작업을 수행합니다. 첫 번째 세션에서는 4주 된 BALB/c 테스트 마우스가 10분 동안 구획 사이를 59회 이동하는 것을 추적하였습니다.각 구획에서 보낸 시간은 사회적 자극이 없는 상태에서의 구획 선호도에 대한 기저선으로 간주됩니다. 두 번째 세션에서는 4주 된 ICR 마우스가 숨겨진 사회적 컵과 비사회적 컵이 제시되었습니다. 사회적 구획에서 시간을 보내는 뚜렷한 편향이 관찰되었습니다.구체적으로 마우스는 비사회적 컵보다 사회적 컵과 더 많은 시간을 보냈습니다. 세 번째 세션에서는 컵을 들어 올려 마우스들이 상호작용할 수 있게 하였습니다. 10분 동안 총 35회의 사회적 접근이 이루어졌습니다.이 기술이 개발됨에 따라, 검증된 자폐 스펙트럼 장애 마우스 모델에서 사회성 저하라는 핵심 증상 영역을 개선하기 위한 유망한 약물들의 더욱 신속한 스크리닝이 가능해졌습니다. 자동화된 처리 과정은 다양한 케이지 설계 및 종에 맞게 조정될 수 있습니다. 신뢰성 있게 감지할 수 있는 알고리즘만 개발된다면 관심 대상이 되는 어떠한 행동이라도 평가할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Behavior

행동

여기 크롤리의 사교성과 사회 노벨티 테스트를위한 환경 설정을 사용하여 생쥐에서 사교성의 시험에 대한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 결과의 올바른 해석에 중요한 중요한 세부 사항을 포함하여이 절차에 대한 장점과 가능한 응용 프로그램을 설명합니다.

사회적 상호 작용 동작 평가

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통합 행동 역으로 설치류 질병 모델의 행동 표현형 (INBEST)

우리는 쥐를 대상으로 간단하고 편견 없는 후각 테스트를 제시합니다. 이 프로토콜을 사용하면 물과 비교되는 새로운 냄새에 대한 후각적 구별, 선호도, 회피 및 민감도를 단일 행동 세션으로 평가할 수 있습니다. 이 방법은 단일 실험자에 대해 표시되며 분석은 컴퓨터 지원 비디오 처리를 기반으로 합니다.

간단하고 컴퓨터 지원 마우스에 대한 후각 테스트를

Mouse 초음파 발성은 신경 정신 질환에 대한 마우스 모델에서 음성 의사소통 결핍의 유전적 기반을 모델링하기 위한 프록시로 사용됩니다. 본 프로토콜은 새끼(발달 전반에 걸쳐)와 성체 마우스(동성 상호 작용, 수컷-발정 암컷 상호 작용)에서 초음파 발성을 안정적으로 유도하는 세 가지 실험 컨텍스트를 설명합니다.

마우스 초음파 발성을 녹화 사회 커뮤니케이션을 평가하는

이 프로토콜은 공간 학습 및 반 즈 미로 사용 하 여 메모리를 측정 합니다. 새로운 계 집 아이-에서-조 난 패러다임 쥐에서 prosocial 동작과 운동 활동을 평가 하는 데 사용 됩니다.

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마우스에서 별도로 측정 능동 및 수동 Tameness

여기에 설명된 새로운 자동화 된 실험 시스템은 3 챔버 테스트에 대한 대안을 제공하고 또한 몇 가지 주의 사항을 해결합니다. 이 시스템은 사회적 선호도 및 사회적 신규성 선호도 테스트 중에 작은 설치류 행동 역학을 엄격하게 분석할 수 있는 여러 행동 매개 변수를 제공합니다.

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신경 정신 장애의 병인에 있는 최근에 발견된 질병 관련 유전자의 역할은 모호하게 남아 있습니다. 자궁 전기 기화 기법에서 수정된 양자간은 뉴런의 큰 인구에서 유전자 전송을 허용하고 사회적 행동에 대한 유전자 발현 변화의 원인 효과의 검사를 허용한다.

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학습하세요 자동화된 영상 분석을 이용한 마우스 사교성 정량화 방법을. 자폐 스펙트럼 장애 연구에서 약물 선별 효율성을 높이고 정확한 행동 평가를 가능하게 합니다.

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