형광 단백질 분해 효소 보호를 사용하여 막 단백질 토폴로지를 결정 (FP​​P)

이 절차의 전반적인 목표는 적분 막 단백질의 토폴로지를 결정하는 것입니다. 이것은 녹색 형광 단백질 또는 GFP와 막의 아미노 또는 카르복실 꼬리 사이의 단백질인 삼출액의 발현에 의해 달성됩니다. 세포에서 관심 단백질을 조절하기 위해 RFP와 같은 가용성 형광 단백질을 발현할 수 있습니다.

다음으로, 원형질막은 선택적 투과의 대상이 됩니다. 세제 굴착기를 사용하면 용해성 형광 단백질은 세포 밖으로 나가는 반면 막으로 결합된 형광 단백질은 세포 내에 남아 있습니다. 마지막 단계는 perme cell에 protease를 적용하고 형광 신호의 보유 또는 손실을 결정하는 것입니다.

궁극적으로, 형광 현미경 이미징을 사용하여 관찰된 형광 강도의 변화는 일체형 막 단백질의 토폴로지와 방향을 보여주는 데 사용됩니다. 에피토프 매핑과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 절차에 많은 특수 장비나 구하기 어려울 수 있는 다양한 시약이 필요하지 않다는 것입니다. 이 방법은 세포질 내에 통합 막 단백질의 어떤 도메인이 위치할 수 있는지, 그리고 소포체, 금 G 또는 엔도솜과 같은 소기관의 내강 내에 위치할 수 있는 도메인과 같은 막 단백질 생물학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 형광 단백질 KY의 생성 및 검증으로 이 절차를 시작합니다. 그런 다음 일시적 또는 안정적인 발현을 생성하기 위해 지질, 바이러스 또는 전기천공법 기반 기술을 포함한 표준 고효율, 저독성 형질주입 방법을 사용하여 형광 단백질 KY를 인간 배아 신장 세포 또는 HEK 2 93 세포에 transfection한 다음 세포를 폴리리신으로 코팅된 커버 슬립에 도금합니다. 이산화탄소가 가능한 조직 배양 인큐베이터에서 섭씨 37도의 적절한 조직 배양 배지에서 5-48시간 동안 세포를 유지합니다.

epi 형광 현미경 검사법을 사용하여 GFP 융합 단백질의 발현을 위한 세포를 감시하고, GFP 형광 신호의 고유한 형광 신호는 보통 24에서 72 시간 안에 최대를 도달합니다. 형질주입 후. 형광 신호가 최대 수준에 도달할 때 세포를 사용하여 단백질 발현을 모니터링할 수도 있으며, 관심 단백질 또는 GFP 부분에 대한 항체를 사용하여 면역 블롯 분석을 통해 단백질 발현을 모니터링할 수도 있습니다.

먼저 세포 치료를 위한 중력 공급 관류 시스템을 설정합니다. 폴리에틸렌 튜브가 있는 용액을 위한 50밀리리터 주사기를 준비하고, 이 튜브는 독립적인 저장소와 수조의 단일 배출구가 있는 매니폴드에 연결됩니다. 흡입 피펫을 배치하여 일정한 수조 부피를 유지하고 원형질막 투과를 위해 관류 저장소 사이를 수동으로 전환하여 용액 교환을 달성하십시오.

먼저 세포에서 세포 배양 배지를 제거합니다. 세포를 각각 1분씩 3회 세척합니다. KHM buffer에서 cover slips를 형광 현미경 스테이지에 놓고 대조 불투과성 이미지를 나타내는 첫 번째 이미지를 수집하여 원형질막을 선택적으로 투과합니다.

KHM 버퍼의 digit toin을 셀에 추가하고, 10-60초 동안 분당 5ml의 속도로 버퍼와 digit-toin으로 셀을 관류합니다. 원형질막이 적절하게 투과되어 있는지 확인하는 것은 용해성 GFP 또는 RFP 분자의 발현에 의해 쉽게 수행되며, 이는 막을 따라 세포 밖으로 쉽게 확산됩니다. 그런 다음 투과를 통해 원형질막의 digon 및 투과에 따른 형광 신호의 세포 보유를 확인하여 관심 있는 GFP 단백질 chimer가 membrane integration된 membrane임을 확인합니다.

다음으로, 텍스트 프로토콜에 언급된 대로 미토콘드리아 단백질과 같은 장기 특이적 형광 단백질을 발현합니다. 이전과 같이 최적의 발현 조건을 결정합니다. 발굴 및 농도가 사용된 세포 유형에 적합한지 확인하여 세포 내 장기 운하의 형태가 장기간 노출되어도 일정하게 유지되도록 합니다.

땅을 파다. KHM 완충액에서 세포를 세척한 후 세포에 직접 프로테아제를 첨가합니다. 분당 5ml의 유속으로 세포를 정독하고 중력 공급 관류 시스템을 사용하여 제제를 지속적으로 목욕시킵니다.

다음으로, 형광 신호가 지속되는지 또는 저하되는지 여부를 확인합니다. 컴퓨터로 제어되는 형광 현미경의 비디오 이미지 캡처 기능을 사용하여 적절한 필터 세트에서 형광 현미경 이미지를 수집합니다. 형광 신호 강도를 배양 조건의 함수로 정량화합니다.

개별 셀을 둘러싸고 있는 관심 영역 내의 평균 픽셀 강도를 구합니다. 30-60초에 걸쳐 초기 신호 강도의 90% 이상의 손실은 GFP 단백질 ky의 단백질 분해와 일치합니다. 용해성 형광 신호의 완전한 소실은 손가락 적용 후 10-60초 이내에 발생해야 합니다.

관심 단백질이 세포 내 소기관과 연관되어 있다는 확인은 digon 및 permeation 후 형광 신호의 유지를 기록함으로써 달성됩니다. 막이 고정된 키나아제 LTK 2의 카르복실 꼬리는 GFP에 융합되어 일시적으로 형광 ltk를 발현했습니다. proteinase K를 첨가한 후 2개의 GFP 신호가 빠르게 손실되었는데, 이는 ltk 2의 카르복실 말단의 위치가 세포질 내에 있음을 나타냅니다.

Cavi 및 GFP는 세포질 도메인에 부착된 GFP 부분이 있는 원형질막 단백질입니다. LTK 2와 마찬가지로, cavi 및 GFP의 신호는 디곤 투과 후 시토크롬 C 산화효소의 미토콘드리아 표적 서열에 융합된 적색 형광 단백질을 인코딩하는 프로테아제 DS 적색 미토의 후속 첨가와 단백질 분해 효소 K의 추가에 민감합니다. DS 적색 미토와 관련된 형광은 안정적으로 유지됩니다. 이것은 Fluor four가 세포질에 노출되지 않는 미토콘드리아에 있는 것과 일치합니다.

GPI에서와 같이 막 단백질에 부착된 형광 부분이 세포 외부를 향하고 있을 때, 노란색 형광 단백질에 부착된 GPI 고정 프리온 단백질. proteinase 처리는 예상대로 dig imp permeation에 대한 사전 요구 없이 형광 신호를 신속하게 소멸해야 합니다. proteinase 처리 후, 이 구조체를 발현하는 세포에서 세포외 형광 신호가 빠르게 사라졌습니다.

이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 1-2시간 안에 수행할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 관심 있는 막 단백질의 토폴로지를 결정하는 방법을 더 잘 이해하게 될 것입니다.