셀 특정 부분 집단에서 RNA 분리 빠른 Immunolabeling과 결합 레이저 캡처 이외에 Microdissection을 사용하여
2015년 4월 11일
특정 조직에서 세포의 서브 세트의 유전자 발현 분석가 중대한 과제이다. 이 문서에서는 레이저 캡처 미세 절제와 빠른 immunolabeling 방법을 결합하여 특정 세포 집단에서 고품질의 총 RNA를 분리하는 방법에 대해 설명합니다.
이 절차의 전반적인 목표는 샘플의 RNA 무결성을 유지하면서 레이저 캡처 미세 해부 또는 LCM으로 분리된 마우스 뇌 세포 집단의 신속한 면역 라벨링을 수행하는 방법을 보여주는 것입니다. 이것은 먼저 절개된 뇌 조직을 급속히 동결시킴으로써 이루어진다. 그런 다음 뇌를 RNA가 없는 유리 현미경 슬라이드에 얇은 부분으로 절단하고 빠른 면역 염색으로 처리합니다.
마지막으로, 관심 세포 집단은 LCM을 사용하여 분리됩니다. 궁극적으로, 레이저 캡처 미세해부에 이은 빠른 염색을 통해 실험 세포 샘플에서 관심 유전자 발현의 변화를 식별할 수 있습니다. 형광 활성화 세포 분류와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 우리의 기술을 사용하면 공간 해상도가 유지되어 주변 조직에서 ES의 특정 세포를 해결할 수 있다는 것입니다.
일반적으로 이 스미스 세포를 처음 접하는 사람들은 이 절차에는 샘플에서 RNA 무결성을 유지하기 위해 신속하게 작업해야 하는 몇 가지 중요한 단계가 포함되어 있기 때문에 원을 그릴 것입니다. 절편을 위해 샘플을 준비하기 위해, 희생 제물 후 2분 이내에 얼음처럼 차가운 L 15 배지에서 출생 후 첫날 마우스의 뇌를 해부합니다. 다음으로 뇌를 절편을 위한 적절한 방향으로 매립 주형에 넣고 주형에 동결 조직을 채우고 매립 매체를 채웁니다.
그런 다음 즉시 표본을 액체 질소에 동결하고 급속 냉동 후 30초 이내에 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 이제 표면 RNA 오염 제거로 멤브레인 코팅된 유리 슬라이드를 처리하여 미량의 RNA를 제거합니다. DEPC 물로 헹구고 슬라이드가 건조되면 자연 건조시키십시오.
저온 유지 장치 챔버 온도를 섭씨 영하 20도로 설정하고 냉동 샘플을 저온 유지 장치로 옮깁니다. 각 샘플에 대해 얼어붙은 블록을 시편 클램프에 장착하고 10미크론 두께로 시편을 슬라이스하여 멤브레인 코팅된 슬라이드에 섹션을 수집합니다. 섹션을 최소 10분 동안 건조시킨 후 소수성 차단 펜을 사용하여 조직을 둘러쌉니다.
약 10초 후 갓 준비한 차가운 고착 용액에 슬라이드를 섭씨 영하 20도에서 5분 이상 두지 마십시오. 이제 슬라이드를 표면 RNA 오염 제거 용액으로 전처리된 깨끗한 트레이로 옮깁니다. 먼저 슬라이드를 한 번 흔들어 여분의 고정액을 제거하고 D-E-P-C-P-B-S에서 슬라이드를 6-8 번 빠르게 담그십시오.
과도한 D-E-P-C-P-B-S를 제거하려면 각 섹션에 200마이크로리터의 기본 항체 용액을 추가합니다. 실온에서 10분 후 D-E-P-C-P-B-S에 빠르게 세 번 담그고 슬라이드를 한 번 튕겨 여분의 세척 용액을 제거합니다. 그런 다음 6분 후 실온에서 200마이크로리터의 2차 항체 용액에 샘플을 배양합니다.
방금 시연한 대로 D-E-P-C-P-B-S에서 슬라이드를 세척하고 새로 준비된 BC 용액에서 4분 동안 배양한 후 새로 준비된 D-E-P-C-P-B-S 세척 후 196마이크로리터의 DAB와 4마이크로리터의 RNA 억제제를 혼합합니다. 섹션에 솔루션을 추가하기 직전에 DAB가 1-2분 동안 현상되도록 한 다음 A-D-E-P-C-P-B-S 세척을 수행합니다. 그런 다음 절대 에탄올에서 몇 초 동안 배양하여 섹션을 탈수하고 슬라이드를 건조시켜 LCM으로 진행합니다.
다음으로 RNA 추출 키트에서 수집 튜브 캡으로 50마이크로리터의 용해 완충액을 주입합니다. 그런 다음 샘플 면이 캡을 향하도록 현미경 아래에 슬라이드 하나를 놓습니다. 샘플에 가장 적합한 배율을 선택하고 초점을 조정하여 관심 세포를 확인합니다.
그런 다음 절단 영역을 정의하고 레이저로 절단을 시작합니다. 수집 튜브에 절개된 물질을 모으고, 수집된 세포를 섭씨 42도에서 30분 동안 캡을 씌웁니다. 이 기간 동안 RNA 추출 키트에서 250마이크로리터의 컨디셔닝 버퍼로 RNA 정제 컬럼을 전처리합니다.
그런 다음 50마이크로리터의 에탄올을 컬럼의 용해된 세포에 로드하고 16, 000G 및 실온에서 2분 동안 컬럼을 원심분리한 다음 세척 버퍼로 두 번 헹굽니다. 마지막으로, RNA의 품질을 테스트하기 위해 2마이크로리터를 남겨두고 최소 권장 부피인 11마이크로리터의 RNA 자유수로 RNA를 용리합니다. 이 신속한 면역 라벨링 절차를 통해 실험용 RNA 무결성을 유지하면서 관심 세포를 시각화할 수 있습니다.
실험에 따라 LCM을 사용하여 단일 세포 또는 더 큰 관심 영역을 분리할 수 있습니다. 분해된 RNA는 다운스트림 분석의 품질에 상당한 영향을 미칩니다. 따라서 각 샘플은 방금 시연된 바와 같이 분리된 RNA의 무결성을 정량화하고 검증할 수 있도록 마이크로플루이드 X 기반 플랫폼 바이오분석기에서 추가로 처리됩니다.
예를 들어, 여기에서 일반적인 바이오분석기는 품질이 저하된 결과와 양호한 결과를 모두 보여줍니다. RNA 샘플이 표시됩니다. 실제로, 디지털 겔 및 전기 페로 그램은 RNA를 보호하기 위해 각 용액에서 rase 억제제를 사용하는 것의 중요성을 보여줍니다.이 절차에 따라, 고품질 RNA는 RNA 시퀀싱 MICROARRAY 또는 Q-R-D-P-C-R을 포함한 다운 스트림 응용 프로그램을 위해 추가로 처리 될 수 있습니다, 예를 들어, 이러한 그래프에서, 중간 뇌 절편에 대한 마이크로 해부 샘플에서 TH 및 A A DC 유전자 발현에 대한 평균 농축은 170 배 이상으로 결정되었습니다.
이 절차를 시도하는 동안 RNA가 없는 물질로 작업을 매우 빠르게 기억하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 조직에서 특정 세포 집단을 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
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개요
이 기사는 마우스 뇌 조직의 특정 세포 집단에서 고품질의 총 RNA를 분리하는 방법을 보여줍니다. 빠른 면역 표지와 레이저 캡처 마이크로해체(LCM)를 결합함으로써 연구자들은 유전자 발현 변화를 식별하면서 RNA 무결성을 유지할 수 있습니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 세포 생물학
- 유전자 발현 분석
배경
- 특정 세포 집단에서 RNA를 분리하는 것은 어렵습니다.
- 정확한 유전자 발현 분석을 위해서는 RNA 무결성을 유지하는 것이 중요합니다.
- 기존 방법은 공간 분해능을 손상시킬 수 있습니다.
- LCM은 주변 조직에서 세포를 정밀하게 분리할 수 있습니다.
연구 목적
- 뇌 세포에 대한 빠른 면역 표지 기술을 보여주기 위함입니다.
- 분리 과정 중 RNA 무결성을 유지하기 위함입니다.
- 특정 세포 집단에서 유전자 발현 변화를 식별하기 위함입니다.
사용된 방법
- 해부된 뇌 조직의 빠른 동결.
- RNA 슬라이드에 뇌를 얇게 자르기.
- 섹션에 빠른 면역 염색.
- LCM을 사용한 표적 세포 집단의 분리.
주요 결과
- 특정 뇌 세포 집단으로부터 RNA의 성공적인 분리.
- 다른 방법과 비교하여 공간 분해능을 유지했습니다.
- 실험 샘플에서 유전자 발현 변화를 식별했습니다.
- 빠른 면역 표지 기술의 장점을 입증했습니다.
결론
- 복합 기술은 유전자 발현 연구를 위한 RNA 품질을 향상시킵니다.
- 정확한 분석을 위해서는 공간 분해능을 유지하는 것이 중요합니다.
- 이 방법은 신경과학 연구에서 다양한 세포 집단에 적용할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Isolating high-integrity RNA from specific cell subpopulations enables precise target validation and mechanistic de-risking in early discovery. This approach supports phenotypic screening and assay development by providing disease-relevant systems with spatial resolution. It enhances predictive confidence in lead identification by linking gene expression changes to defined cellular contexts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in defined dopaminergic cell populations.
- Operational Value: Provides biologically de-risked target validation through spatial isolation of cells of interest.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by linking gene expression changes to specific cell types with >170-fold enrichment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream RNA-seq, microarray, or qRT-PCR applications.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through rapid immunolabeling and LCM isolation.
- Scalability: Enables reliable compound evaluation by maintaining RNA integrity and spatial resolution.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery through preclinical validation using disease-relevant brain tissue models.
- Biomarker Alignment: Supports translational biomarker development via quantified RNA integrity and expression profiling.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions based on RNA quality and target engagement in isolated subpopulations.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation to lead identification by enabling mechanistic de-risking through spatially resolved gene expression analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification in dopaminergic cell populations.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs for compound screening campaigns.
- Analytics: Provides RNA integrity measurements and gene expression readouts for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through disease-relevant mouse brain models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for isolating any cell population across tissues.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of RNA isolation workflows.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on subpopulation-specific data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in histology, immunolabeling, and laser capture microdissection.
- Needs cryostat, LCM system, RNA-free slides, and RNA inhibition reagents.
- Demands cross-team standardization for rapid processing to maintain RNA integrity.
- Requires adaptation considerations for different tissue types and cell markers.
- Limited by RNA degradation risk if procedural timing is not maintained.
