셀 특정 부분 집단에서 RNA 분리 빠른 Immunolabeling과 결합 레이저 캡처 이외에 Microdissection을 사용하여

이 절차의 전반적인 목표는 레이저 캡처 미세 절단(laser capture micro dissection, LCM)으로 분리한 마우스 뇌 세포군의 신속한 면역 표지 방법을 시연하는 동시에 샘플의 RNA 무결성을 유지하는 것입니다. 이는 먼저 절단된 뇌 조직을 급속 냉동함으로써 달성됩니다. 그 후 뇌 조직을 RNA free 유리 현미경 슬라이드 위에 얇은 절편으로 잘라내어 신속 면역 염색을 처리합니다.

마지막으로, LCM을 사용하여 관심 있는 세포 집단을 분리합니다. 결과적으로, 신속한 염색 후 레이저 캡처 미세해부법을 통해 실험 세포 샘플 내 관심 유전자의 발현 변화를 확인할 수 있습니다. 형광 활성 세포 분류법과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 공간 해상도가 유지되어 주변 조직으로부터 ES의 특정 세포를 분리해 낼 수 있다는 점입니다.

일반적으로 이 스미스 셀(smith cell)을 처음 접하는 사람들은 이 과정에서 샘플의 RNA 무결성을 유지하기 위해 신속하게 작업해야 하는 몇 가지 중요한 단계가 포함되어 있으므로 주의 깊게 살펴봅니다. 절편 제작을 위한 샘플을 준비하려면, 희생 후 2분 이내에 얼음처럼 차가운 L 15 배지 내에서 생후 1일차 마우스의 뇌를 적출하십시오. 그다음, 절편 제작에 적합한 방향으로 뇌를 임베딩 몰드에 넣고, 몰드에 동결 조직 임베딩 매질을 채웁니다.

그다음 즉시 시료를 액체 질소로 급속 냉동하고, 급속 냉동 후 30초 이내에 -80°C에서 보관하십시오. 이제 막 코팅된 유리 슬라이드를 표면 RNA 제거 처리하여 미량의 RNA를 모두 제거합니다. DEPC 처리수로 헹군 후, 슬라이드가 마를 때까지 자연 건조하십시오.

크라이오스탯 챔버 온도를 -20 °C로 설정하고 동결된 샘플을 크라이오스탯으로 옮깁니다. 각 샘플에 대해, 동결 블록을 검체 클램프에 고정하고 10 µm 두께로 절편을 만들어 멤브레인이 코팅된 슬라이드 위에 수집합니다. 절편을 최소 10분 동안 건조시킨 후, 소수성 배리어 펜을 사용하여 조직 주변을 둘러쌉니다.

약 10초 후에, 슬라이드를 갓 준비한 차가운 고정액 용액에 넣고 -20 °C에서 5분 이내로 유지합니다. 이제 표면 RNA 오염 제거 용액으로 전처리된 깨끗한 트레이로 슬라이드를 옮깁니다. 먼저, 슬라이드를 한 번 흔들어 과잉 고정액을 제거하고 D-E-P-C-P-B-S에 6~8회 빠르게 담가 세척한 후 슬라이드를 털어냅니다.

과잉의 D-E-P-C-P-B-S를 제거하기 위해 각 섹션에 1차 항체 솔루션 200 µL를 첨가합니다. 상온에서 10분 후, 슬라이드를 D-E-P-C-P-B-S에 세 번 빠르게 담가 세척하고 한 번 털어내어 과잉 세척액을 제거합니다. 그런 다음 2차 항체 솔루션 200 µL에 샘플을 넣고 상온에서 6분 동안 배양합니다.

시연한 대로 슬라이드를 D-E-P-C-P-B-S로 세척하고, 다시 한번 빠르게 D-E-P-C-P-B-S로 세척한 후 갓 제조한 BC 용액에서 4분 동안 배양합니다. 갓 제조한 DAB 196 µL와 RNA 억제제 4 µL를 혼합합니다. 용액을 절편에 첨가하기 직전에 DAB를 1~2분 동안 반응시킨 다음, A-D-E-P-C-P-B-S로 세척합니다. 그 후 절대 에탄올에서 몇 초간 배양하여 절편을 탈수시키고, 슬라이드를 가볍게 털어 건조시킨 후 LCM 단계를 진행합니다.

다음으로 RNA 추출 키트의 용해 완충액 50 µL를 수집 튜브 캡에 넣습니다. 그런 다음 샘플 면이 캡을 향하도록 하여 슬라이드를 현미경 아래에 놓습니다. 샘플에 가장 적합한 배율을 선택하고 초점을 조정하여 관찰하고자 하는 세포를 확인합니다.

그런 다음 절단 영역을 지정하고 레이저로 절단을 시작합니다. 절단된 물질을 수집 튜브에 수집한 후, 수집된 세포를 42 °C에서 30분 동안 배양합니다. 이 시간 동안 RNA 추출 키트에 포함된 RNA 정제 컬럼을 250 µL의 컨디셔닝 버퍼로 전처리합니다.

그런 다음 컬럼의 용해된 세포에 50 µL의 에탄올을 넣고, 실온에서 16,000 Gs로 2분 동안 원심분리한 후 세척 완충액으로 두 번 헹굽니다. 마지막으로, RNA 품질 테스트를 위해 2 µL를 따로 남겨두고, 권장 최소 부피인 11 µL의 RNA-free water로 RNA를 용출합니다. 이 신속한 면역 표지 절차를 통해 실험적 RNA 무결성을 유지하면서 관심 세포를 시각화할 수 있습니다.

실험에 따라, LCM은 방금 시연한 것과 같이 단일 세포 또는 더 넓은 관심 영역을 분리하는 데 사용할 수 있습니다. 분해된 RNA는 후속 분석의 품질에 상당한 영향을 미칩니다. 따라서 각 샘플은 방금 시연한 대로 분리된 RNA의 무결성을 정량화하고 검증하기 위해 microfluid X 기반 플랫폼 바이오분석기로 추가 처리됩니다.

예를 들어, 여기에서는 분해된 샘플과 품질이 좋은 RNA 샘플의 전형적인 바이오분석기(bioanalyzer) 결과가 제시되어 있습니다. 실제로 디지털 겔과 전기영동도는 RNA를 보호하기 위해 각 용액에 RNase 억제제를 사용하는 것이 얼마나 중요한지를 보여줍니다. 이 절차를 통해 얻은 고품질의 RNA는 RNA 시퀀싱, 마이크로어레이(MICROARRAY) 또는 Q-R-D-P-C-R을 포함한 하위 응용 분석에 추가로 사용될 수 있습니다. 예를 들어, 이 그래프들에서 중뇌 절편과 비교하여 미세절단된 샘플 내 TH 및 A A DC 유전자 발현의 평균 농축도는 170배 이상인 것으로 나타났습니다.

이 절차를 시도할 때는 매우 신속하게 작업하고 RNase-free 재료를 사용하는 것이 중요합니다. 이 영상을 시청하고 나면, 모든 조직에서 특정 세포군을 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.