Name: 질병 벡터 모기 유충의 키토산 / 간섭 RNA 나노 입자 중재 유전자 음소거 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: 학습하세요 키토산/간섭RNA 나노입자를 이용한 질병 벡터 모기 유충의 유전자 음소거 방법을. 이 기술은 고효율·저비용으로 유전자 기능을 연구하여 질병 매개 모기 통제에 활용됩니다.

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Kansas Agricultural Experiment Station과 K-State Arthropod Genomics Center에서 KYZ에 대한 자금 지원으로 A. gambiae19에서 키토산/dsRNA 매개 유전자 침묵의 원래 개발을 지원했습니다. 여기에 설명된 A. gambiae 작업은 NIH/NIAID에서 KM으로의 R01-AI095842에 의해 부분적으로 지원되었습니다. A. aegypti20,21에서 키토산/siRNA 매개 유전자 침묵의 개발은 MDS에 대한 NIH/NIAID 상 R01-AI081795의 지원을 받았습니다. 이 연구의 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 NIH의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.

1. 모기 종과 양육을 <ol><li> A. 유지 gambiae의 G3와 A. aegypti 리버풀 IB12의 (아래의 대표 연구에 사용) 균주 또는 표준 실험실 연습에 또는 이전에 23, 24 설명한대로 따라 관심의 다른 균주. </li></ol> 2. dsRNA를하고 siRNA를 디자인 및 제작 <ol><li> 디자인 프라이머는 관심의 유전자에 특정 긴 dsRNA를 템플릿을 구성합니다. E-RNAi의 도구 (25)를 사용합니다. 같은 또는 선택의 방법에 따른 dsRNA를 생산 이전에 설명 19. <ol><li> 음성 대조군의 경우, 녹색 형광 단백질 (GFP), β - 갈 락토시다 제 (β-GAL), 또는 모기로 표현하지 다른 유전자의 서열에 해당하는 dsRNA (19)를 합성. 목적한다면, 다음과 같이 요약 대표적인 결과를 생성하기 위해 이용 된 dsRNA (19)은 양성 대조군으로 사용할 수있다. 스토어 dsRNA를 -80 °에서 RNAse가없는 물에 용해 된; C가 필요할 때까지. </li></ol></li><li> 또한, 디자인 유전자 특이 적 siRNA를 표준 실험실 관행에 따라 또는 이전 10 설명했다. 모든 모기 유전자에 대응하지 않는 음성 대조군 siRNA의 설계를 최저의 siRNA 시퀀스를 스크램블링. 신뢰할 수있는 공급 업체의 숫자를 통해 사용할 수있는 사용자 정의 된 siRNA를 구입합니다. <ol><li> 목적한다면, 다음과 같이 요약 대표적인 결과를 얻기 위해 이용 된 siRNA (20, 21)은 양성 대조군으로 사용할 수있다. 필요할 때까지 보관 된 siRNA는 -80 ° C에 RNAse가없는 물에 용해시켰다. </li></ol></li></ol> 3. R​​NA 나노 입자를 방해 / 키토산 준비 <ol><li> 미리 만들어진 RT 100 mM 염화나트륨, 황산 수집 (탈 H 2 O 100mm의 나 2 SO 4), 0.1 M 아세트산 나트륨 (탈 H 2 O 중 0.1 M NAC 2 H 3 O 2 -0.1 M 아세트산, pH를 4.5) 버퍼. </li><li> 키토산을 용해 (≥75 %탈 아세틸) 0.1 M 아세트산 나트륨 완충액 () V / w 작업 용액 0.02 %를 만들기 위해 사용하기 전에 실온에서 용액을 유지한다. </li><li> H 2 O 탈 50 μL에서의 dsRNA 또는 siRNA에 용해시키고 50 mM 염화나트륨, 황산 100 ㎕ 당하는 dsRNA / siRNA를 32 μg의의 100 μL 용액을 만들기 위해 100 mM의 황산 나트륨 버퍼에 추가한다. </li><li> dsRNA에 / siRNA의 용액에 키토산 용액 100 μl를 첨가하고, 그 다음 1 분 동안 55 ℃에서 수욕에서 혼합물을 가열한다. 키토산 용액 100 ㎕ 50 mM 염화나트륨, 황산 100 ㎕를 첨가함으로써 제어를 설정하고 동일한 절차를 따른다. </li><li> 나노 입자의 형성을 촉진하기 위해 RT에서 고속 텍싱 30 초 동안 즉시 용액을 섞는다. </li><li> 펠릿 볼 수 있어야 그 이후 실온에서 10 분 동안 13,000 XG에서 혼합물을 원심 분리기. 새로운 1.5 ML 튜브에 뜨는을 전송합니다. 모기 음식을 준비하기 위해 그것을 사용하기 전에 실온에서 ≈10 분 펠렛을 공기 - 건조. </li><li> M상청액에 남아하는 dsRNA / siRNA와의 총량을 계산하는 블랭크로서 대조군 (3.5 참조)를 사용하여 상등액 상등액의 dsRNA /의 siRNA 농도를 easure. 초기의 dsRNA / siRNA의 양 및 나노 입자에 포획 된 dsRNA / siRNA의 백분율을 계산하는 상청액에 남아있는 양의 차이를 사용한다. 이 적재 효율은 일반적으로 90 % 이상이다. </li><li> 나노 입자가 더 필요한 경우 동일한 절차를 반복한다. 즉시 건조 된 나노 입자를 사용합니다. 사용하기 전에 입자의 저온 저장의 영향은 평가되지 않았다. </li></ol> 4. 모기 음식 RNA 나노 입자를 방해 / 키토산을 포함하는 시스템 준비 <ol><li> 증류수에 아가 로스를 용융 (V / w) 아가로 오스 2 % 용액 1 ㎖를 제조하고, 사용 전에 55 C 수욕에서 용융 아가로 오스 용액을 유지한다. </li><li> 물고기 음식 부스러기를 혼합 (47 % 조단백질, 분. 조지방 10 %, 최대. 조섬유 3 %)에서 건조 효모(w / w) 1 : 2의 비율. 박격포와 유 봉 (50 위 미국 표준 시험 체를 통해 무난)와 작은 입자의 혼합물을 갈기. 중 즉시, 색상 갈색이어야한다 분쇄 된 음식물을 사용하거나 몇 주 동안 4 ℃에서 밀봉 된 용기에 보관하십시오. </li><li> 1.5 ML 튜브에서, 이쑤시개와 3.7 절에서 건조 된 나노 입자로 분쇄 된 음식물의 6 mg의 혼합. </li><li> 식품 나노 입자 혼합물을 2 % 예비 용융 아가 로스 겔 용액 30 μL를 추가; 이쑤시개 또는 피펫 팁을 사용하여 즉시 철저하게 약동하십시오. </li><li> 바로 모기 유충을 공급하는 음식과 나노 입자를 포함하는 겔을 사용합니다. 젤이 완전히 실온에서 응고되면 다른 방법으로, 4 ° C에서 젤을 저장하고 사용 다음날, 또는 나중에 사용하기 위해 -80 ° C에서. </li></ol> 5. 식품 RNA 나노 입자를 방해 / 키토산을 함유 모기 유충을 먹이 <ol><li> 수유 A. gambiae 모기 유충 : <ol><li> 시 제거이쑤시개를 사용하여 깨끗한 면도날이나 이쑤시개를 사용하여 6 동등한 조각으로 잘라 1.5 ML 튜브에서 ngle 젤 펠릿. </li><li> 100 ml의 탈 이온수를 함유하는 500 ml의 배양 접시에 20 번째 전송 령 유충. </li><li> 페트리 접시에 한 번 사일을위한 하루 겔 펠렛 (미세하게 작은 조각으로 잘게) 한 조각을 추가하여 모기 유충을 먹이. 크게 크기가 감소 또는 다음날에 의해 완전히 결석해야 펠릿에 애벌레 먹이를 준수해야합니다. 시간이 지나면 모기 늦게 넷째 령 애벌레로 발전 할 것이다. </li><li> 실험 기간 동안 눈에 보이는 표현형의 변화를 기록한다. 네 일의 기간이 종료 6 절에 설명 된대로 성적 수준과 다른 표현형의 변화를 검사합니다. </li></ol></li><li> 수유 A. aegypti 모기 유충 : <ol><li> 깨끗한 면도날이나 이쑤시개를 사용하여 6 동등한 조각으로 젤 펠렛을 잘라. </li><li> 달걀 부화 Fi를 한 후 50 세 동기 24 시간 배치탈 이온수 ≈40 용액에 배양 접시에 첫 령 유충. </li><li> 하루 중 나머지 1 접지 물고기 음식 부스러기와 건조 효모 : 다음이 정기적으로 애벌레 다이어트로 다시 유충을 전송, 4 시간 / 일에 대한 페트리 접시 당 유충 한 조각을 넣습니다. 매일 네 령 유충에 걸쳐 절차를 반복합니다. </li><li> 원하는 발달 시점에서 6 절에 설명 된대로 성적 수준과 다른 표현형의 변화를 검사합니다. </li></ol></li></ol> 유전자 넉다운 6. 확인 <ol><li> A.에 QRT-PCR에 의해 상대 성적 증명서 정량 aegypti 및 A. gambiae 애벌레. <ol><li> 수행하고 11,19,20 설명, 또는 표준 실험실 절차에 따라 같은 실험 유충 대 이상 10 풀링 제어 세 생물학적 복제물에 QRT-PCR 분석을 분석 할 수 있습니다. 대표 결과가 들어 있습니다. </li><li> 특정 조직 유형 / 신체 일부 (예., 뇌 또는 안테나), PERFO의 분석을 위해관심있는 조직을 복구하기 위해 다음의 6.1.1에 기재된 바와 같이 절개 RM QRT-PCR은 (예를 들면, 소르 등. 21). </li></ol></li><li> 현장 하이브리드 화에 의한 최저의 확인 <ol><li> digoxygenin 표지 안티센스를 합성 표준 실험실 연습에 또는 26 설명 된대로 따라 제어 리보 프로브를 감지. </li><li> 이전에 11,20을 설명하고 아래의 대표적인 결과 섹션에서 논의 된 바와 같이 최저의 확인을 위해 저자 Haugen 등. (27) 프로토콜에 따라 현장 하이브리드에 실행합니다. </li></ol></li><li> 면역 조직 화학 염색에 의한 최저의 확인 <ol><li> 표적 유전자의 단백질 생성물에 대한 항체를 사용할 수있는 경우 이전에 기술 된 바와 같이 28, representati에 예시 된 바와 같은 표현형 분석에서 20 녹다운의 최대 수준의 개인 식별을 용이하게, 면역 조직 화학 법을 수행아래의 결과 섹션을했습니다. </li></ol></li></ol>

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본원에 기술 된 키토산 / RNA 간섭 나노 방법론 효과적으로 A.에서 유생 중에 유전자를 대상으로 사용되어왔다 gambiae (도 2, 3) 및 A. aegypti (도 4, 5, 6, 표 1, 2). 키토산 나노 입자는 본원에 기재된 대표적인 결과에 의해 입증되는 바와 같이 모기에서 성공적으로 사용되어왔다 둘 또는 긴 dsRNA에 siRNA를, 어느 제조 될 수있다. dsRNA에의 합성 siRNA를 구매보다 저렴하지만, 더 노동 집약적이다. 키토산 / siRNA를 사용하는 경우, 표현형 폭로 표현형 오프 사이트에 의한 타겟팅 아니라고 더 확신을 허용 다중 siRNA를 함께 확인할 수있다. 또한, siRNA를 한꺼번에의 상업 생산은 더 나은 분야에 종 특이 모기 제어 RNA 침묵을 방해 / 키토산의 확장을 용이하게 할 수있다. 이것은 물론 obsta 극복 필요이러한 비용 및 배달과 같은 사이클 사용. <p cl...

Anopheline과 Aedine 장군의 혈액 공급 벡터 모기는 인류 최악의 재앙의 몇 가지에 대한 책임 질병을 유발하는 에이전트를 전송합니다. 추정 34억명는 매년 전 세계에 걸쳐 절반 만 죽음에 대한 책임이 말라리아, 계약에 대한 위험이 있습니다. 말라리아 특검팀에 의해 감염 말라리아 결과. 주요 아프리카 벡터과 아노 펠 레스 gambiae (를 포함하여 얼룩 날개 속의 감염된 모기의 물린 상처를 통해 사람에게 전송되는 기생충, <a href="http://www.who.int/topics/malaria/en/">http://www.who.int/topics/malaria/en/</a> 2014) 1. Aedes aegypti는 뎅기열, 세계에서 가장 광범위하고 중요한 arboviral 질병 비특이적 열성 질환을 일으키는 뎅기 바이러스에 대한 기본 모기 벡터이다. 뎅기열 바이러스는 매년 inciden으로, 현재 열대&gt; 25억명에 대한 위협이다24,000 사망자 매년 ~의 결과로 약 5천만가지 경우의 CE ( <a href="http://www.cdc.gov/dengue/">http://www.cdc.gov/dengue/</a> 2014) 2. 인간의 건강에 모기 매개 질병의 파괴적인 글로벌 충격에도 불구하고, 예방 및 질병 치료의 효과적인 수단이 부족하다. 모기 제어는 현재 질병 예방의 가장 좋은 방법입니다. 벡터 곤충의 유전자 조작에 의해 절지 동물 매개 질병을 제어하기위한 잠재력은 지난 4 년간 3 인정을 받고있다. A.의 형질 전환 균주 최근 형질 전환 벡터 제어 전략을 현실로 4-6를 사용하기위한 가능성을 만든 aegypti repressible 여성 고유의 날지 표현형을 가지고 설계. 이러한 발전은 벡터 및 벡터 제어 모기 유전자 기능을 조작하기위한 수단을 추가로 신규 한 유전자 표적을 식별하기 위해 연구에 도전했다. 유전자 발현 (D)의 변경을여성이 날지 모기 4의 경우가 있다는 uring 개발, 새로운 벡터 제어 전략의 해명을 촉진 할 수있다. 그러나, 대부분 기술적 과제를 극소수의 유전자 기능의 개발 과정 A. 특성화되었다 gambiae, A. aegypti의, 또는 다른 모기 종. C.에서의 발견 이후 엘레 7은, 동물, 식물, 미생물에 보존되는 RNA 간섭 (RNAi에)는, 광범위 곤충 8,9 포함한 생물체의 다양한, 기능성 유전 연구에서 사용되어왔다. RNAi의 경로는 순서 특정 간섭 RNA의 기능을 짧은 20 ~ 25 염기 길이의 siRNA를로 다이 서 (Dicer), 절단 긴 dsRNA에 의해 시작됩니다. 성적 증명서 회전율, 분열, 번역 (9)의 중단을 촉진하여 순서에 상보적인 siRNA를 침묵 유전자. particula을 대상으로 긴 dsRNA를 분자 (일반적으로 300 ~ 600 BP) 또는 사용자 정의 된 siRNAR 열은 임의의 관심있는 유전자 사일런 싱에 대한 연구 실험실에서 사용될 수있다. RNA가 전달을 방해 할 때 관리함으로써, 연구진은 유전자에 동수를 침묵 시간을 제어 할 수 있습니다. 그것은 생산과 유전적인 돌연변이, 아직 모든 곤충 종에 존재하지 않는 비용과 노동 집약적 인 프로세스를 베어링 균주의 유지를 방해 할 수 있습니다 이러한 발달 치사 또는 불임 등의 문제를 극복하는 데 사용할 수있는 이러한 장점에 유용합니다. RNAi에 의한 유전자 침묵의 과정은 동물에게 유전자를 조직의 조직 및 동물 유전자에서 달라질 수 있지만, RNAi를 널리 모기 및 다른 곤충 8,9에서 유전자의 기능 분석을 위해 사용된다. 세 간섭 RNA 배달 전략은 모기에 사용되었습니다 미세 주사, 전신 / 국소 응용 프로그램 및 섭취. 자세한 역사와 곤충이 세 가지 기술의 사용의 비교를 위해, 유 등의 알 8을 참조하시기 바랍니다. WE 성공적 A.에서 발달 유전자를 표적으로 siRNA를 전달하는 수단으로서 마이크로 인젝션 10을 사용한 aegypti 배아, 유충, 번데기 11-14. 그러나이 노동 집약적 인 배달 전략은 미세 주사 설정 및 숙련 된 손 모두를 필요로한다. 또한, 미세 주입은 행동 표현형이 부과됩니다 특히, 생물, 교란 요인에 스트레스. 마지막으로, 마이크로 인젝션 배달 벡터 제어를위한 필드로 확장 될 수 없다. 편리하고 작은 장비 또는 노동을 필요로하는 대신, RNA 간섭을 용액에 담그는 유기체 또한, 유전자 침묵을 유도하는 인기 수단이되었다. 잠기기는 주로 곤충 세포 라인에 적용된 것은 8을 연구하지만, 최근의 연구에서, 최저는 A에 달성되었다 aegypti 유충 동물이 섭취하는 dsRNA 것으로 나타났다 (15)의 용액에 침지. 그러나, 여러 experimenta의 분석과 관련된 연구L 그룹이나 표현형은 몸을 담근 채 오히려 비용이 많이 든다. 로페즈 마르티네스 등. 16의 RNAi, RNA 간섭을 함유하는 물을 한 방울과 식염수 탈수 재수 관련된 RNA 전달을 방해하기위한 새로운 접근 방식을 재수 구동을 설명했다. 이 접근법은 전체 동물의 침지와 관련된 비용을 절감하지만 미세 주입보다 더 비싼 높은 삼투압을 허용 할 수있는 종의 적용이 제한 될 수있다 않는다. 또한, 침지 또는 탈수 / 재수 침지 방법이 필드 벡터 제어하도록 적응 될 수있는 방법을 구상하는 것이 곤란하다. 이런 이유로, 이후의 배아 연구를 들면 음식 섭취 RNA 간섭의 배달 대안 전략이다. 섭취 기반 전략이 모든 종의 곤충, 아마도 특히 초파리에서 작동하지 않지만, 음식과 혼합 RNA 간섭의 구두 전달은 유전자의시를 승진시켰다곤충 8,17의 다양한 lencing 포함 A. aegypti 성인 18. 우리는 A에 키토산 나노 입자 매개 RNAi의 설명 gambiae 유충 (19) 성공적으로 A의 유전자 발현의 감소를위한이 방법을 적용했습니다 aegypti 애벌레 (20, 21). 여기서, 고분자 키토산 RNA 간섭의 포획이 포함 RNAi의 절차를위한 방법은, 상세하다. 키토산 / 간섭 RNA 나노 입자 키토산의 아미노기의 양전하와 RNA 19 간섭의 백본에 인산기에 의해지지 마이너스 전하 사이의 정전기력을 통해 RNA 간섭과 폴리 양이온의 자기 조립에 의해 형성된다. 설명 된 절차는 긴 dsRNA를 분자 (이하의 siRNA로 지칭)을 가닥의 siRNA (이하 dsRNA를 라 함) 또는 이중 모두와 호환된다. 다음 합성, 키토산 / 간섭 RNA 나노 입자는 애벌레 음식과 혼합에게 전달됩니다경구 섭취를 통해 유충. 이 방법론은, 비교적 저렴 작은 장비 및 인력 (19)이 필요하며, 동작 (20, 21)의 분석을 포함하는 다수의 표현형의 높은 처리량 분석을 용이하게한다. 다른 질병 벡터 및 곤충 농업 ​​해충 포함한 다른 곤충에서 유전자 침묵 과정에 대해 적응 될 수있다이 방법은, 잠재적으로 다른 동물 종의 다양한 유전자 침묵을 위해 사용될 수있다. 또한, 키토산, 저렴 무독성 생분해 성 고분자 (22)는 잠재적으로 종 특이 모기 제어를위한 분야에서 이용 될 수있다.

<table><tbody><tr><td>0.02 ml pipetteman</td><td>Rainin</td><td>PR20</td><td>간섭 RNA의 재현탁</td></tr><tr><td>0.2 ml pipetteman</td><td>Rainin</td><td>PR200</td><td>방해 RNA의 재현탁 및 간섭 RNA/나노 입자 준비</td></tr><tr><td>0.5 ml 졸업 튜브&nbsp;</td><td>Fischer Scientific</td><td>05-408-120</td>은 <td>재현탁 간섭 RNA</td></tr><tr><td>1 ml pipetteman</td><td>Rainin</td><td>PR1000</td>은 <td>간섭 RNA의 재현탁 및 간섭 RNA/나노 입자</td></tr><tr><td>1.5 ml 졸업 튜브의 준비를 위해&nbsp;</td><td>Fischer Scientific</td><td>05-408-046</td><td>간섭 RNA/나노 입자</td></tr><tr><td>1M 아세트산 나트륨, pH 4.5</td><td>TEKnova</td><td>S0299</td> 아세트산 완충액 아세트산 <td>제조를 위한</td></tr><tr><td>AIRSTAR. ACS, USP, FCC 등급</td><td>BDH</td><td>VWR BDH3092-500MLP</td><td>는 아세트산 나트륨 완충액을 준비합니다</td></tr><tr><td></td><td>.</td><td></td><td>800668 준비된 간섭 RNA/나노 입자</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf AG</td><td>5415D</td><td>를 펠렛 간섭 RNA/나노 입자</td></tr><tr><td>키토산으로, 새우 껍질에서</td> 간섭 RNA/나노 입자를 펠렛으로 코팅하기 위해 <td>Sigma-Aldrich</td><td>C3646-25G</td><td>를 간섭 RNA/나노 입자의 준비를 위해 간섭 RNA와 결합</td></tr>하기 위해 <tr><td>Dry Yeast</td><td>Universal Food Corp</td><td>NA</td><td>에서 간섭 RNA/나노 입자를 가진 모기 유충 먹이를 준비합니다. 나노 입자</td></tr><tr><td>E-RNAi 도구</td><td>dsRNA 설계를 위한</td> <td>독일 암 연구 센터</td><td>NA</td>; http://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3//</tr> <tr><td>금붕어 먹이</td><td>Wardley</td><td>Goldfish FLAKE FOOD</td><td>간섭 RNA/나노 입자로 모기 유충 먹이를 준비하기 위한</td></tr> 온수 <tr><td>수조</td><td>Thermo Scientific</td><td>51221048</td><td>간섭 RNA/나노 입자를 55oC에서 가열합니다</td>.</tr><tr><td>얼음</td><td>해당 없음</td><td>간섭 RNA 해동 및 간섭 RNA/나노 입자</td><td></td></tr><tr> 준비에는 적용되지 않음<td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>얼음 양동이</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-591-44</td><td>절차 중 얼음 저장용</td></tr><tr><td>간 분말</td><td>MP Biomedicals LLC.</td><td>간섭 RNA/나노 입자 처리 후 모기 유충에게 먹이를 주는</td> <td>900396</td></tr><tr><td>전자레인지 오븐</td><td>2% 아가로스 용액</td><td></td><td></td></tr><tr><td>페트리디쉬(100 x 15mm)</td> 제조에 적용되지 않는 다양한 공급업체<td>Fischer Scientific</td><td>875713유</td><td>충용 간섭 RNA/나노 입자 공급 챔버</td></tr><tr><td>pH 측정기</td><td>버퍼용 Mettler Toledo</td><td>S220</td><td></td></tr><tr><td>면도날</td><td>Fischer Scientific</td><td>12-640</td><td>공급용 간섭 RNA/나노 입자 펠릿</td></tr><tr><td>siRNA</td><td>Thermo Scientific/Dharmacon</td><td>맞춤형</td><td>siRNA/나노 입자</td></tr><tr><td>황산나트륨, 무수(Na2SO4)</td><td>BDH/VWR</td><td>VWR BDH0302-500G</td>에 의해 배포<td>되어 간섭 RNA가 50mM 황산나트륨 용액을 준비하도록 분배됩니다. </td></tr><tr><td>수조 온도를 측정하기 위한</td><td>현탁 온도계</td><td>VWR</td><td>61066-046</td></tr><tr><td>이빨 선택</td><td>VWR</td><td>470146-908</td><td>간섭 RNA/나노 입자 식품 준비 및 젤 펠릿 절단 중 교반</td></tr> 초<tr><td>저 냉동고</td><td>-80oC에서 간섭 RNA 분취액 및 간섭 RNA/나노 입자의 저장에 적용할 수 없는 다양한 공급업체 -80supo/supC에서 간섭 RNA 분취액 및 간섭 RNA/나노 입자의 저장</td>에 <td>적용할 수 없는</td> 다양한 <td>공급업체</td></tr><tr><td>키토산/간섭 RNA 준비 용</td> <td>Vortex mixer</td><td>Fischer Scientific</td><td>02-216-108</td></tr><tr><td>중량 종이</td><td>Fischer Scientific</td><td>NC9798735</td><td>공급을 위해 간섭 RNA / 나노 입자 펠릿을 분할합니다</td></tr></tbody></table>.

질병 벡터 모기 유충의 키토산 / 간섭 rna 나노 입자 중재 유전자 음소거

Chitosan/Interfering RNA Nanoparticle Mediated Gene Silencing in Disease Vector Mosquito Larvae

벡터 모기는 다른 생물보다 더 인간의 고통을 입힐 - 이상 백만명 매년 죽인다. 모기 게놈 프로젝트는 기본 아프리카 말라리아 벡터과 아노 펠 레스 gambiae 및 뎅기열과 황열병 벡터 Aedes aegypti의 유전학적인 연구를 포함하여 모기 생물학의 새로운 측면에서 연구를 촉진. RNA 간섭 - (RNAi-) 매개 유전자 침묵은 이러한 질병 벡터 모기 종 모두에 대한 관심의 유전자를 대상으로 사용되어왔다. 여기서는 음식 합하고 유충 섭취 RNA 간섭 나노 입자 / 키토산의 제조 과정을 설명한다. 긴 이중 가닥 RNA (dsRNA에) 또는 작은 간섭 RNA (siRNA의) 분자와 호환이 기술적으로 간단 높은 처리량 및 비교적 저렴한 방법은, A. 다른 유전자의 숫자의 성공적인 최저 사용되어왔다 gambiae 및 A. aegyptiQRT-PCR을 통해 또는 현장 하이브리드에 확인 유충. 애벌레의 먹이에 따라, 최저는, 적어도 후반 번데기를 유지할 수 있습니다. 이 방법론은 모기 및 농업 해충 곤충을 포함하는 다른 종의 다양한뿐만 아니라 다른 비 유기체 모델에 적용될 수있다. 연구 실험실에서 유용성 외에도 향후, 키토산, 저렴하고, 비 독성 및 생분해 성 중합체, 잠재적 분야에서 이용 될 수있다.

<html> A. gambiae : 키토산 / 나노 dsRNA에 의한 키토산의 아미노기와의 dsRNA의 인산기 간의 정전 상호 작용으로 형성된다. 용액으로부터의 dsRNA의 고갈에 의해 측정하는 나노 입자에 혼입하는 dsRNA의 효율은 일반적으로 90 % 이상입니다. 원자력 현미경 이미지 표시하는지 100-200 nm의 (도 1)에 이르는 직경 키토산 dsRNA에 입도 140 nm의 평균. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52523/52523fig1.jpg" /> 키토산 및 RNA 간섭에 의해도 1의 나노 입자 형성. 키토산 / dsRNA를 나노 입자 (A) 또는 dsRNA를 <...

여기서 우리는 유충 섭취 RNA 나노 입자 / 키토산의 사용을 통해 질병 벡터 모기 유전자 기능을 억제 간섭하는 절차를 설명한다.

질병 벡터 모기 유충의 키토산 / 간섭 RNA 나노 입자 중재 유전자 음소거

Vector mosquitoes inflict more human suffering than any other organism&#8212;and kill more than one million people each year. The mosquito genome projects ...

본 절차의 전반적인 목표는 유전자 억제 연구를 위해 모기 유충에서 tussin 간섭 RNA 나노입자를 설계하고 사용하는 것입니다. 이는 먼저 키틴과 간섭 RNA를 결합한 후, 가열, 볼텍싱 및 원심분리를 통해 tussin 간섭 RNA 나노입자를 제조함으로써 달성됩니다. 다음 목표는 나노입자를 유충 먹이 및 agarose와 혼합하여 먹이와 나노입자가 포함된 겔 펠릿을 준비하는 것입니다.나노입자 먹이를 모기 유충에게 공급하고, 펠릿을 섭식하는 유충을 관찰한 뒤, 최종적으로 quantitative real-time polymerase chain reaction 또는 두 가지 하이브리드 분석법을 통해 유전자 침묵을 확인합니다. 이후 기능 상실 표현형을 조사할 수 있습니다.이 방법은 매개 모기 연구 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 저희는 이 방법을 사용하여 후각 시스템, 뇌, 중장 및 기타 매개체로서 중요한 조직의 발달 과정 중 유전자 기능을 연구했습니다. 이 기술의 주요 장점은 처리량이 높고 비용이 상대적으로 저렴하며, 고도의 숙련도가 필요하고 현장 적용이 불가능한 미세주입을 통한 간섭 RNA 전달보다 생물체에 가해지는 스트레스가 적다는 점입니다.박사후 연구원 Ava Maur와 함께 기술원 Ping Lee가 실험 절차를 시연하겠습니다. 우선, 0.1 M sodium acetate 완충액에 tussin을 녹여 0.02% 작업 용액을 만듭니다. 해당 용액은 사용 전까지 상온에서 보관하십시오. 그다음, 이중 가닥 RNA 또는 소형 간섭 RNA(이하 간섭 RNA로 지칭)를 50 µL의 탈이온수에 녹입니다.50 millimolar 황산나트륨 100 microliter당 32 micrograms의 핵산이 포함된 100 microliter 용액을 제조하십시오. 다음으로, 간섭 RNA 용액에 tussin 용액 100 microliters를 첨가하십시오. 혼합물을 55 degrees Celsius의 항온 수조에서 1분 동안 가열하십시오.100 µL의 50 mM 황산나트륨을 100 µL의 Tustin 용액에 첨가하여 대조군을 설정하고, 가열 후 동일한 절차를 따릅니다. 나노입자 형성을 촉진하기 위해 상온에서 고속 볼텍싱으로 용액을 즉시 30초 동안 혼합합니다. 혼합물을 상온에서 13,000 G로 10분 동안 원심 분리하면 펠릿이 관찰됩니다. 상층액을 새로운 1.5 mL 튜브로 옮기고, 사용 전 상온에서 펠릿을 약 10분 동안 공기 건조합니다.UV 분광 광도법을 사용하여 모기 먹이를 준비하려면, 대조군의 S 상층액을 블랭크로 사용하여 SNAT 내 간섭 RNA의 농도를 측정함으로써 snat에 남아 있는 간섭 RNA의 총량을 계산합니다. 간섭 RNA의 초기 양과 상층액에 남아 있는 양의 차이를 이용하여 나노입자에 포획된 간섭 RNA의 백분율을 계산합니다. 이러한 로딩 효율은 일반적으로 90% 이상입니다. 더 많은 나노입자가 필요한 경우 동일한 절차를 반복하십시오.사용 전 입자를 냉장 보관했을 때의 영향이 평가되지 않았으므로, 건조된 나노입자를 즉시 사용하십시오. 모기 먹이를 조제하려면 먼저 탈이온수에 2% agro 용액을 준비하고 agar를 녹입니다. 녹인 agro 용액을 사용 전까지 55 °C 항온수조에 보관하십시오.다음으로 물고기 먹이 플레이크와 건조 효모를 1:2 비율로 혼합합니다. 막자와 막자사발을 사용하여 혼합물을 작은 입자로 갈아줍니다. 갈아낸 먹이는 갈색을 띱니다.1.5 milliliter 튜브에 갈린 먹이 6 mg과 건조된 나노입자를 넣고 이쑤시개를 사용하여 섞습니다. 그런 다음, 먹이-나노입자 혼합물에 2%로 미리 녹인 agros gel 용액 30 microliters를 추가합니다. 이쑤시개나 피펫 팁을 사용하여 즉시 충분히 교반합니다.먹이와 나노입자가 포함된 겔이 준비되었으므로 이제 *Anopheles gambiae* 모기 유충에게 먹이를 공급할 수 있습니다. 이쑤시개를 사용하여 1.5 mL 튜브에서 겔 펠릿 하나를 꺼낸 후, 깨끗한 면도날이나 이쑤시개를 사용하여 이를 4등분으로 자릅니다. 그런 다음 3령 유충을 100 mL의 탈이온수가 담긴 페트리 접시에 옮깁니다.겔 펠릿 한 조각을 추가하여 모기 유충에게 먹이를 줍니다. 마지막으로 페트리 접시당 작은 조각으로 잘라 넣습니다. 4일 동안 하루에 한 번씩, 유충이 펠릿을 섭취하는지 반드시 관찰하십시오. 펠릿의 크기는 다음 날까지 현저히 줄어들거나 완전히 사라져야 합니다.모기는 유충 시기에 4령 후기로 발달하게 됩니다. 실험 기간 중 관찰되는 모든 표현형 변화를 기록하십시오. 80마리의 GTI 모기 유충에게 4일간 먹이를 공급한 후, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 전사체 수준 및 기타 표현형 변화를 조사하십시오.이전과 마찬가지로 깨끗한 면도날이나 이쑤시개를 사용하여 젤 펠릿을 4등분으로 자릅니다. 그 다음, 알 부화 24시간 후로 동기화된 50 h 스타 유생을 페트리 접시에 넣습니다.약 40 milliliters의 탈이온수에 넣습니다. 유충에게 페트리 접시당 한 조각씩 하루 4시간 동안 공급합니다. 이때, 조각은 더 작은 크기로 잘게 다져야 합니다.그런 다음 유충을 나머지 하루 동안 2:1 비율의 분쇄 어류 사료 플레이크와 건조 효모로 구성된 일반 유충 식단으로 다시 옮깁니다. 4단계 유충 탈피 기간 동안 이 절차를 매일 반복합니다. 원하는 발달 시점에 텍스트 프로토콜에서 논의된 대로 전사체 수준 및 기타 표현형 변화를 조사합니다.여기에 표시된 지점은 정상적으로 보이며 예상대로 대조군 먹이를 섭취한 4령 An. gambiae 유충입니다. 그러나 chitin synthase 1을 표적으로 하는 chitin 간섭 RNA를 섭취한 유충에서는 para atrophic matrix가 파괴되었으며, 이는 gastric C로 유출된 dextrin blue에 의해 입증됩니다. 필수 후각 공동 수용체인 orco의 정상적인 발현이 대조군 먹이를 섭취한 4령 Ae. aegypti 유충의 촉수에서 관찰됩니다.이와 대조적으로, 대조군으로 사육된 동물과 비교했을 때 single-minded 유전자를 표적으로 하는 RNA 간섭 물질을 섭취한 동물에서는 Orco 발현이 나타나지 않습니다. Single-minded 녹다운 동물은 후각 추적 행동에 결함이 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 벡터 모기의 발달 과정에서 유전자를 억제하기 위해 RNA 간섭 나노입자를 사용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.성체 모기 또는 다른 신흥 모델 생물 연구로 확장될 가능성이 있는 이 기술은 연구자들이 질병 매개체인 모기의 게놈 프로젝트에서 확인된 유전자의 기능을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.

chitosaninterfering-rna-nanoparticle-mediated-gene-silencing-disease

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

역방향 유전자 접근 방법은 모기에 벡터 병원균하는 유전자 underly 저항을 결정하는 매우 유용하게 입증했습니다. 이 비디오 프로토콜은 말라리아 기생충을 항구 아노 펠 레스 모기 gambiae로 dsRNA를 주입하기 위해 Dimo​​poulos 연구실에서 사용하는 방법을 보여줍니다. 사출 설정을 조작하고 흉부에 dsRNA를 주입 기술은 그림이다.

성인 모기 (A. gambiae)에서 RNAi의 Assays을위한 프로토콜

이 프로토콜에서 우리는 함께 RNAi - 중재 유전자 입을를...

RNAi - 중재 유전자 최저 및<em&gt; VIVO에서</em성인 여자의&gt; 이뇨 분석<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; 모기

RNA interference (RNAi)는 유전자 기능을 밝히는 데 매우 유용한 도구입니다. 그러나 성체 이전 단계에서 RNAi를 사용하여 유전자를 표적으로 하는 능력은 주요 인간 말라리아 매개체인 Anopheles gambiae에서 제한됩니다. 번데기 발달 중 직접 주입을 통해 유전자 기능을 감소시키는 RNAi 프로토콜에 대해 설명합니다.

에 RNAi의 트리거 배달<em&gt; 아노 펠 레스 gambiae</em&gt; 번데기

우리는 비 결함 재조합 Aedes aegypti densovirus (AaeDV) vivo에서 전달 시스템을 개발 하는 인공 intronic 작은 RNA 식 전략을 사용 하 여 보고 합니다. 건설, 포장, 및 애벌레 감염에 관해서는 뿐만 아니라 rAaeDV 벡터의 정량 분석에 대 한 자세한 절차를 설명 합니다.

모기 유 충에서 유전자의 기능 분석에 대 한 유전자 납품 벡터로 재조합 모기 Densovirus의 사용

이 원고는의 리에 이중 가닥 RNA의 구강 섭취를 통해 독일 바퀴벌레는 midgut에 유전자 발현의 고갈 보여 줍니다.

RNA 방해의 실용적인 사용: Liposome 캐리어 바퀴벌레에 대 한 이중 가닥 RNA의 구두 납품

이 문서에는 RNA 간섭 (RNAi) 곤충 먹이 체 관 부 수액에 대 한 식물의 혈관 조직을 통해 이중 가닥 RNA (dsRNA)의 구두 납품을 위해 개발 된 새로운 기술을 보여 줍니다.

체 관 부 식물 수액 공급 Hemipteran 곤충에 RNA 간섭을 유도 하 이중 가닥 RNA 구두 전달 방법

이 프로토콜 우리가 표준화 하 고 몇 년 동안 모기와 집 파리의 hemolymph를 직접 핵 산의 특정 수량을 제공 하는 데 사용 하는 microinjection 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜 최소 주입 죽음 귀착되 고 통치의 복용량 상관 측정을 허용 한다.

재현할 수 dsRNA Microinjection 및 산란 검정 집 파리 모기에

세균에 의해 생산된 dsRNA의 경구 투여는, 예쁜꼬 마선충에서 일상적으로 사용되는 RNA 간섭(RNAi)에 대한 전달 방법으로서, 성인 모기에 성공적으로 적용되었다. 우리의 방법은 주사를 사용하지 않고도 강력한 역 유전학 연구 및 전송 차단 벡터 연구를 가능하게합니다.

성인 Anopheles 감비아 모기에 효과적인 경구 RNA 간섭 (RNAi) 투여

여기에는 누에 Bombyx mori 유충에서 키토산/dsRNA 나노입자 전달을 통해 유전자 침묵을 유도하기 위한 프로토콜이 제시되어 있습니다.

키토산/dsRNA 나노입자 전달을 통한 누에 Bombyx mori 의 유충 RNA 간섭

노크를 다운 유전자 표현의에 대한 바이러스 유도된 유전자 입을 (VIGS) 메서드에 대한...

바이러스 유도 진 입을 (VIGS)에 Nicotiana benthamiana 토마토

학습하세요 키토산/간섭RNA 나노입자를 이용한 질병 벡터 모기 유충의 유전자 음소거 방법을. 이 기술은 고효율·저비용으로 유전자 기능을 연구하여 질병 매개 모기 통제에 활용됩니다.

질병 벡터 모기 유충의 키토산 / 간섭 RNA 나노 입자 중재 유전자 음소거

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