ICPMS 샘플 소개를위한 미세 유체 칩

본 절차의 전반적인 목표는 단일 세포 또는 수용액을 포함하는 단분산 마이크로 액적을 생성하고, ICP-MS를 통해 그 원소 조성을 정량적으로 분석하는 것입니다. 이는 먼저 PDMS를 이용한 복제 성형법으로 미세유체 칩을 제작함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 시린지 펌프를 미세유체 칩에 연결하는 것입니다.

펌프는 수성 시료와 휘발성이 높고 허용 가능한 유기 운반상인 PFH를 공급합니다. 시린지 펌프를 켜면, 미세유체 칩은 PFH를 이용한 유동 집속(flow focusing)을 통해 수성 시료 용액 또는 세포 현탁액의 단분산 액적을 생성하며, 추가적인 PFH를 이용해 이러한 액적을 액체 제트 형태로 칩 밖으로 배출합니다. 마지막 단계는 칩을 이송 어셈블리에 삽입하는 것으로, 이 어셈블리는 액적을 증발시키는 카트리지 히터와 ICP-MS를 통한 액적 성분의 이온화 및 검출 이전에 용매를 제거하는 멤브레인 탈용매제(membrane desolvator)로 구성됩니다.

최종적으로, 기록된 신호와 표준 용액을 이용한 보정 측정을 통해 시료 용액 또는 현탁액 내 세포의 원소 조성을 결정합니다. 기존 방법 대비 본 미세유체 기술의 주요 장점은 액적 크기 조절이 가능하다는 점, 시료 소모량이 적다는 점, 그리고 세포 현탁액이나 고농도 염 용액을 사용할 때 막힘 현상이 발생할 위험이 낮다는 점입니다. 또한, 저렴한 일회용 미세유체 칩을 사용하여 세척 시간을 줄이고 교차 오염을 방지할 수 있습니다.

본 절차의 시연은 GT A 교수 연구실의 박사 과정 학생인 vin sc와 본 연구실의 박사 과정 학생인 Pascal Fabrica가 진행하겠습니다. MICROFABRICATION 공정을 시작하기 위해, 커다란 플라스틱 접시에 PDMS 40 grams와 PDMS 경화제 4 grams를 측정하여 넣습니다. 스패튤러로 두 성분을 고르게 섞은 후, 혼합물 내의 모든 기포를 제거하기 위해 접시를 진공 데시케이터 안에 넣고 20 to 30 minutes 동안 탈기시킵니다.

탈기하는 동안, 마이크로 구조 실리콘 웨이퍼 위에 캐스팅 몰드를 놓고 설계 주변의 가이드 구조를 사용하여 평평한 실리콘 웨이퍼 위에 딱 맞게 고정하십시오. 그 위에 또 다른 캐스팅 몰드를 자유롭게 놓으십시오.

탈기된 PDMS 혼합물 약 3~4g을 두 개의 캐스팅 몰드에 각각 붓습니다. 두 실리콘 웨이퍼를 핫플레이트로 옮깁니다. PDMS를 150 °C에서 6분 동안 경화시킨 후 식힙니다.

금속 스패출러를 사용하여 실온의 벤치 위에서 경화된 PDMS 구조물을 다룹니다. 몰드에서 고체 PDMS 블록을 조심스럽게 분리하십시오. 두 블록의 접합 표면이 입자나 지문에 의해 오염되지 않도록 보호하십시오.

투명 스카치테이프를 한 층 붙임으로써, PDMS 조각을 다루고 가위로 크기에 맞게 다듬을 수 있습니다. 다듬은 후, 미세 구조 PDMS 블록에서 테이프를 제거하고 생검 펀치(biopsy hole punch)를 사용하여 미세유체 유입 포트를 생성합니다. 이로써 장치의 미세 구조 절반에 대한 제작 공정이 완료되며, 이제 평평한 상대 부품과 접합 및 조립할 준비가 되었습니다.

PDMS-PDMS 본딩을 위한 표면을 준비하려면, 먼저 공시편 실리콘 웨이퍼 위에 PDMS 경화제를 6,000 RPM으로 30초 동안 스핀 코팅합니다. 경화제가 아직 젖어 있는 상태에서 미세 구조 PDMS 블록의 본딩 인터페이스를 웨이퍼에 접촉시키고, PDMS 상단에 부드럽게 압력을 가하여 기포 없이 매끄러운 밀봉을 형성합니다. 별도의 단계로, 평평한 대조군 부품에서 보호 테이프를 제거합니다. 그런 다음 미세 구조 PDMS를 실리콘 웨이퍼에서 천천히 분리합니다.

두 개의 PDMS 조각을 주의 깊게 정렬하고 두 접합면을 접촉시킵니다. 두 블록을 가볍게 눌러 계면의 기포를 제거하고, 조립된 PDMS 칩을 상온에서 24시간 동안 경화시킵니다. 커터 칼과 정렬 장치를 사용하여 배출 노즐과 직교하는 표시선을 따라 절단합니다. 현미경으로 칩을 관찰하여 노출된 배출 노즐 인근에 트리밍 결함이나 입자 오염이 있는지 검사합니다.

제작 품질을 평가한 후, PDMS 마이크로채널의 내부 표면을 실란화할 준비를 합니다. 화학 흄 후드 내에서 울프 병(wolf bottle)의 한쪽 끝을 건조 질소원에 연결하고, 병의 다른 쪽 끝을 PDMS 칩의 입구에 연결합니다. 중앙 매니폴드에 연결된 여러 개의 튜브를 사용하여, 실란 50 µL를 울프 병에 피펫팅한 후 상단 뚜껑을 밀봉합니다.

질소 운반 가스 흐름을 켜고, 약 1 mL/s의 유량으로 식염수를 포함한 증기를 이용하여 마이크로 채널을 20분 동안 세척합니다. 마지막으로, wolf bottle에서 입구 튜브를 분리합니다. 이렇게 코팅된 PDMS 칩은 단일 세포 질량 분석 측정을 위한 질량 분석 실험에 사용할 준비가 되었습니다.

먼저, 유효 세포 농도가 mL당 1,000만 개 미만이 되도록 적절한 버퍼로 입력 시료를 희석합니다. 질량 분석 준비를 위해, 샘플 시린지에 튜빙을 연결하는 것부터 시작합니다. 5 mL 시린지 두 개에 PFH를 채우고, 별도의 1 mL 시린지에 입력 시료를 채웁니다. 시린지와 튜빙 내부에 갇힌 모든 기포를 제거한 후, 두 개의 시린지를 시린지 펌프에 장착합니다.

운송 튜브가 적절하게 정렬되었는지, 그리고 모든 가스 튜브가 연결되었는지 확인하십시오. 다음으로, 시린지 튜브를 PDMS 칩의 입구 포트에 연결하고 시린지 펌프를 3~5분 동안 작동시키십시오. 이 유량 안정화 과정 동안, 티슈를 사용하여 출구 포트에서 과잉 액체를 제거하십시오.

칩에서 나오는 유체가 직선형 제트를 형성하지 않는 경우, 5분 후에 깨끗한 티슈로 칩 배출구의 잠재적인 폐쇄물을 닦아내십시오. 해결되지 않으면 기존 칩을 폐기하고 새 칩으로 연결을 교체하십시오.

사이클론 스프레이어 어댑터에서 플러그를 제거하고, 유속이 안정화된 PDMS 칩을 어댑터에 조심스럽게 삽입하십시오. 권장 설정에 따라 유속을 변경하고, 2~5분 동안 유속을 다시 안정화하십시오. 동시에, 분석 대상 물질의 신호 강도가 최대가 될 때까지 모든 가스의 유속을 조절하십시오.

또한, 신호 최적화 시 신호 강도를 더욱 높이기 위해 질량 분석기의 플라즈마 전력과 포커싱 렌즈 전압을 조정하십시오. 질량 분석기의 dwell time을 10 milliseconds로 설정하고 데이터 수집을 시작하십시오. 측정이 완료되면, 로우 데이터를 데이터 분석 프로그램으로 전송하십시오.

전형적인 데이터 분석 과정에서는, 먼저 모든 측정값을 데이터 빈(bin)으로 분리하며, 각 빈은 10 milliseconds의 체류 시간당 카운트 수를 나타냅니다. 그 다음 모든 빈에 대해 히스토그램 플롯을 생성하고 가우스 분포 함수(Gaussian distribution function)로 피팅합니다. 개별 피팅의 평균과 분산은 특정 질량 대 전하비에서의 평균 신호 강도와 표준 편차를 나타냅니다. 검정 과정을 시작하려면, 우선 샘플과 동일한 유속으로 표준 용액을 측정하십시오.

액적 생성을 위해 PDMS 칩을 사용하여, PFH용 5 mL 주사기 두 개와 표준 용액용 1 mL 주사기 하나를 준비합니다. 그런 다음 페트리 접시를 현미경 시료 홀더로 사용하여 PDMS 칩을 페트리 접시에 놓고, 이전 프로토콜 단계와 동일하게 저배율에서 칩의 초점을 맞춥니다. 고속 카메라를 이용하여 PDMS 마이크로채널 내의 액적 생성을 3~5분 동안 안정화합니다.

칩의 2차 접합부에서 수성 액적의 이미지 기록을 시작하여, 기록된 영상으로부터 평균 액적 직경을 구합니다. 전용 액적 형태 분석, 광학 측정 및 속도 대칭 스위트가 포함된 이미지 분석 소프트웨어를 사용하십시오. 각 액적을 구형 객체로 모델링할 수 있다고 가정하면, 소프트웨어를 통해 얻은 평균 액적 직경을 이용하여 평균 액적 부피를 추정할 수 있습니다.

다음으로, 샘플의 기지 분석물 농도를 평균 액적 부피로 나누어 액적 하나에 포함된 분석물의 질량을 구합니다. 그런 다음, 산출된 질량을 원자 수로 변환합니다. 마지막으로, 액적당 측정된 이온 수를 이전 결과값으로 나누어 전체 검출 효율을 계산합니다.

이 검출 효율은 이제 미지 시료 내의 원자 수를 확인하기 위한 교정 값으로 사용될 수 있습니다. 미세유체 액적 생성기를 사용하여 단일 세포를 평균 직경 50 microns 미만의 단분산 수성 액적 내에 캡슐화하고, 이를 I-C-P-M-S로 분석할 수 있습니다. 수성 액적을 둘러싸고 있는 유기 PFH 시스(sheath)는 시료가 I-C-P-M-S 검출기에 도달하기 전에 쉽게 제거될 수 있습니다.

용액을 측정할 때, 높은 액적 단분산성은 주어진 체류 시간 내에서 단일, 이중 또는 삼중 액적 수로부터 오는 신호 그룹 간의 낮은 분산으로 관찰될 수 있습니다. 적절한 교정을 거치면, 각각 단일 액적에 현탁된 단일 소 bovine 적혈구 앙상블의 철 함량을 확인할 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 매우 적은 양의 시료 부피나 단일 입자 및 세포의 정량적 원소 분석을 위해 이러한 미세유체 칩을 준비하고 사용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

이 칩들을 제작하는 데 소요되는 실제 작업 시간은 적절하게 수행될 경우 칩당 15분 미만입니다. 또한, 수정이 용이한 칩의 특성 덕분에 고급 시료 전처리를 위한 추가적인 미세유체 모듈을 통합할 수 있으며, 시료와 표준물질을 동시에 주입함으로써 효율성과 시료 처리량을 향상시킬 수 있습니다.