Name: 수술 조직에서 기본 인간 대장 종양 세포의 분리 및 견인 세포 계측법 부드러운 탄성 기판에 직접 배양 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: 배우세요 수술 조직에서 기본 인간 대장 종양 세포를 분리하고 부드러운 탄성 기판에 직접 배양하는 방법을. 견인 세포 계측법으로 세포 수축력을 분석하여 종양 생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 프로젝트는 National Science Foundation ECCS 보조금 10-02165 및 Interdisciplinary Innovation Initiative Program, University of Illinois 보조금 12035의 지원을 받았습니다. M.Y. A.는 UIUC에서 NIH National Cancer Institute Alliance for Nanotechnology in Cancer 'Midwest Cancer Nanotechnology Training Center' 보조금 R25 CA154015A의 지원을 받았습니다. 이누노염색(Immnunostaining) 및 컨포칼 현미경 이미징은 UIUC의 IGB(Institute for Genomic Biology)에서 수행되었습니다. M.Y.A.는 격리 실험에 관해 UIUC의 B. J. Williams와 논의한 것을 인정한다. M.Y.A.는 회로도 및 재료 목록 준비에 도움을 준 UIUC의 C. Nemeh와 Abdul Bhuiya에게 감사를 표합니다.

아래에서 설명하는 프로토콜은 UIUC 인간 연구 윤리위원회의 지침을 따른다. 1. 수집 및 수술 조직 샘플의 소화 <ol><li> 우측 결장 절제술 (도 1a 및도 1b) 후 종양 조직 샘플을 수집. 뿐만 아니라 인접한 건강한 사이트에서 조직을 수집합니다. </li><li> 12 ㎖의 HBSS를 함유하는 용액 15 ml의 유리 병에 즉시 조직을 옮긴다. 절연 거품 상자 안에 얼음에 병을 보관하십시오. </li><li> 45 분 내에서 추가 처리를 위해 조직 배양 후드로 조직 함유 바이알 전송. 후드 안쪽에 얼음 블록에 병을 보관하십시오. </li><li> 피펫을 사용하여 HBSS 용액을 6-7 ml의를 포함하는 6 웰 플레이트에 공급 조직을 따르십시오. 참고 : 물론 당 조직의 양이 헹굼 단계에서 중요하지 않습니다. </li><li> 얼음 블록에 6 웰 플레이트를 유지합니다. 두번 HBSS 용액 조직을 씻어. </li><li> 멸균 SCIS와 분리 된 섹션으로 깔끔하게 조직을 잘라SOR. 작은 부분으로 말하다 조직 멸균 메스 블레이드와 크기가 1-2mm 3보다 크지. </li><li> 조직을 전송하기 전에 (0.1 % 트립신 용액 1㎖를 함유) 표지 된 0.1 % 트립신 바이알을 단다. 피펫으로 0.1 % 트립신 튜브의 각으로 ~ 20 mg의 조직을 전송합니다. </li><li> 트립신의 추가 희석을 방지하기 위해 트립신 유리 병에 HBSS의 전송을 최소화하려고합니다. </li><li> 조직 전송 후 트립신 유리 병의 무게를 측정; 조직 덩어리와 같은 차이를 문서화. </li><li> ~ 20 mg의 조직과 24 웰 플레이트의 각 웰에 트립신 1 ml에 붓고. </li><li> 16 ~ 20 시간 동안 4 ° C에서 냉장고에 진탕 기에서 24 웰 플레이트를 넣습니다. 이 대기 기간 동안 또는 이전 시점에서, 폴리 아크릴 아마이드 겔 기판을 준비하고 3 장에 설명 된대로 ECM 단백질로를 기능화. </li></ol> 2. 효소 단일 세포 현탁액으로 조직 샘플의 해리와 ECM 기능화 탄성 Substrat에 배양 분리 된 세포ES 및 강성 폴리스티렌 요리 <ol><li> 진탕 기에서 4 ° C에서 잘 트립신에서 배양 16 ~ 20 시간 후, 피펫을 사용하여 (전체 성장 미디어의 2-3 ml를 포함) 4 ° C의 전체 성장 미디어 바이알에 4 ° C의 트립신에서 조직을 전송합니다. 성장 매체에 트립신의 최소한의 전송을 보장합니다. 주 : 완전 성장 배지 제형은 다음과 같다 : 10 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 용액 전체의 1 %의 최종 농도 말 혈청이 보충 된 RPMI 1640 배지 기재. </li><li> 12-15 분 동안 37 ℃의 온수 배스에서 미디어 바이알을 함유하는 조직을 배치. </li><li> 피펫을 사용하여 HBSS 용액을 포함하는 15 ㎖의 유리 병에 조직을 전송, 부드럽게 흔들어. </li><li> 2.3를 반복합니다. </li><li> HBSS 용액 1 ml의 솔루션을 포함하는 유리 병 (HBSS)에 전달 0.1 %에 콜라겐 솔루션에서 조직을 제거합니다. 가습 세포 배양 인큐베이터에서 45 ° C에서 37 분, 5 % CO 2 환경 부화. 대기 시간, 따뜻한 growt 중15 ㎖ 중의 H 매체는 수조에서 37 ° C에서 바이알. </li><li> 피펫 최소화 콜라게나 이월에 모든 조직 조각을 잡아 당깁니다. 미리 예열 문화 매체 유리 병에 바로 조직 조각을 꺼냅니다. </li><li> 6 웰 플레이트의 각 웰에 40 μm의 잘 삽입 필터를 놓습니다. 1 ml의 세포 배양 매체를 사용하여 필터를 적셔. </li><li> 조직이 완전히 분해 될 때까지 10 ㎖의 유리 피펫 수회 미디어 씹다 조직. </li><li> 바이알의베이스에 최대한 가까운 피펫 팁을 유지한다. </li><li> 파편과 해리되지 않은 부분을 제거하기 위해 필터 상에 용액을 증착. </li><li> 원심 RT에서 5 분 동안 150 XG에서 미디어 세포 현탁액을 여과 하였다. </li><li> 그 후 상층 액을 제거하고 2 ml의 신선한 문화 매체와 세포 펠렛을 재현 탁. </li><li> 혈구를 (필요한 경우)을 사용하여 세포를 카운트. 종자는 세포 외 기질 (ECM) 작용 젤 원하는 농도의 폴리스티렌 요리에 기본 세포입니다.</li></ol> 3. 준비 및 다른 강성 폴리 아크릴 아미드 (PA) 젤과 폴리스티렌 기판의 기능화 참고 : 제 3의 시각 데모를 들어, 시청자가 / 독자가 가시화 실험의 최근 저널 (주피터) 제 17 조라고합니다. <ol><li> 채택 공개 프로토콜 18, 19, 12mm 2 유리 커버가 하이드로 겔의 공유 결합을 보장하기 위해 화학적으로 미끄러 활성화. <ol><li> 첫째, 치료 유리 커버 실온에서 7 분 동안 3 Aminopropyltrymethoxysilane (ATS)로 미끄러 져. </li><li> DI 물 린스 완전히 ATS를 제거하고 치료 커버 (70 % 글루 타르 알데히드 주식 솔루션에서 PBS에 희석) 0.5 % 글루 타르 알데히드 30 분 동안 용액으로 미끄러 져. </li></ol></li><li> / V 아크릴 아미드 솔루션 및 0.05 %, N, 10 mM의 HEPES 완충 식염수 (20)에 N &#39;-methylenebisacrylamide (비스) 솔루션 승 5 %를 혼합하여 2 kPa의 젤 솔루션을 얻습니다. / V 아크릴 아미드 0.13 승 8 %를 사용% N, 10 kPa의 젤 (20) 10 mM의 HEPES 완충 식염수에 N &#39;-methylenebisacrylamide (비스) 솔루션입니다. <ol><li> 200 황산 암모늄 (/ w 10 % V) 및 1 : 두 경우 모두 1을 사용 2,000 N, N, N &#39;, N&#39;각각 중합 공정 용 개시제 및 촉매로서 -tetramethylethylenediamine (TEMED). </li><li> 또한, 신탁 마커 (21, 22)로 2 인민군 겔 용액 100 μL 형광 구슬을 추가합니다. </li></ol></li><li> 20 μL 12mm이 활성화 된 유리 커버 슬립에 미리 PA 고분자 겔 용액의 방울을 증착. 드롭 다른 12mm 2 일반 유리 커버 슬립을 놓습니다. 드롭 인해 모세관 현상에 커버 슬립 사이에 퍼져 있는지 확인합니다. 2 kPa의 겔 비드가 대부분 세포 배양 표면 가까이 오지 않도록하기 위해 샌드위치 전환. </li><li> 실온에서 45 분 동안 PA 젤 치료. </li><li> 하나의 가장자리 면도기를 사용하여 상단 커버 슬립을 벗겨. 참고 : 필링 동안 분리 한 가장자리에서 진행샌드위치. 겔은 활성화 된 유리 슬라이드에 접착 유지된다. </li><li> 사용하기 전에 PBS 용액에 젤을 저장합니다. </li><li> 50 μg의 / ㎖ 출판 다음 방법 (23)의 농도로 PA 젤과 ECM 분자, 인간 피브로넥틴 유리를 기능화. <ol><li> 간단히, 2 ml의 순수한 히드라진 하이드레이트 O / N과 기판을 품어. </li><li> 히드라진 하이드레이트를 제거하고 탈 이온수로 철저하게 기판을 씻어. </li><li> 30 분 동안 5 % 아세트산으로 기판을 세척 할 것. </li><li> 아세트산을 제거하고 탈 이온수로 철저하게 기판을 씻어. </li><li> 30 분 동안 탈 이온수에 침지 기판을 유지합니다. </li><li> 50 μg의 / ml의 농도에서 35 분 동안 산화 피브로넥틴과 기판을 품어. </li><li> 10 분 동안 낮은 rpm에서 진탕에 PBS로 기판을 씻어. </li><li> 세포를 도금하기 전에 30 분 동안 2-3 ml의 배양 배지에서 37 ° C에서 모든 기판을 품어. 참고 : 플레이트 세포를 띄엄 띄엄 채우기에D 방식 (1,000-3,000 세포 / ㎠). 각 겔 피복 유리 슬립은 35mm 페트리 접시에 포함되어야한다. 세포가 어떤 현미경 (적어도 O / N) 전에 완전히 준수하도록 허용합니다. </li></ol></li></ol> 4. 견인 힘 현미경과 면역 형광 현미경 분석 실험 <ol><li> 견인 힘 현미경 분석 <ol><li> 10 분 동안 물을 욕조에 37 ℃의 따뜻한 0.25 % 트립신 - EDTA / 10 % SDS 솔루션 견인 실험을 시작하기 전에. </li><li> 한번에 세포 배양 인큐베이터에서 한 겔을 분리하여 형광 현미경 반전 스테이지 (32X 배율)에 배치했다. </li><li> 시야에서 하나의 셀을 찾을 수 있습니다. 페트리 접시의 뚜껑을 제거합니다. </li><li> 셀의 위상차 이미지 (예를 들어,도 3)을 가지고. </li><li> 형광 적절한 필터를 선택할 수있는 영상 모드를 전환합니다. 이 시간 동안 현미경 단계 또는 샘플을 이동하지 마십시오. </li><li> 형광 비드 displac의 이미지를 촬영휴대 견인 (그림 4C)에 의해 에드. </li><li> 겔에서 세포를 분리 배양 접시에 1 ml의 트립신 / SDS 솔루션을 추가합니다. 이 시간 동안 현미경 단계 또는 샘플을 이동하지 마십시오. 또한, 겔의 완전한 제거를 보장하기 위해 셀의 제어 영상을 취할. </li><li> 세포가 제거 된 후 비드 기준 (NULL 힘) 이미지를 가져. </li><li> 다른 모든 젤에 대한 단계를 반복 4.1.2-4.1.8. </li><li> 각각의 경우에 대한 단계 4.1.6과 4.1.8에서 획득 한 두 개의 이미지에서 ImageJ에를 사용하여 이미지 스택을 확인합니다. 스택 스택 → 이미지 → 이미지 : 이미지 스택을 생성하려면, 이미지를 연 후 ImageJ에의 명령 다음과 같은 순서를 사용합니다. </li><li> . 변위 필드와 견인을 얻으려면, 발표 방법 (21), (22) 다음 ImageJ에 플러그인을 사용하여 다음과 같은 링크를 사용하여 이러한 플러그인에 대한 코드와 상세한 튜토리얼을 얻 <a href="https://sites.google.com/site/qingzongtseng/imagejplugins">https://sites.google.com/site/qingzongtseng/ima을</a>gejplugins. <ol><li> &#39;템플릿 매칭&#39;플러그인을 사용하여 스택의 이미지를 맞 춥니 다. → 확인을 스택에 플러그인 → 템플릿 매칭 정렬 조각 → : 단계 4.1.10에서 생성 된 이미지 스택을 연 후 ImageJ에의 명령 순서 다음 사용. 결과적으로 이미지 스택을 저장합니다. 다음 단계에서이 새로운 이미지 스택을 사용합니다. </li><li> PIV (입자 영상 유속계) 플러그인 (그림 4D)를 사용하여 변위 필드를 얻습니다. 단계 4.1.11.1에 저장된 이미지 스택을 연 후 명령의 순서 다음 사용 : 플러그인 → PIV → 반복 PIV (기본) → → 확인 확인 →이 PIV 및 출력을 수락합니다. 원본 이미지 스택과 동일한 디렉토리에있는 PIV 출력을 저장합니다. 다음 단계에서 입력으로 사용합니다. </li><li> 마지막으로 FTTC 견인지도 (그림 4E)을 얻기 위해 플러그인을 (푸리에 세포 계측법 견인 변환)를 사용합니다. 명령을 사용하여 다음과 같은 순서 : 플러그인 → FTTC → 기능ERT의 재료 특성, 즉, 탄성 계수 및 PA 젤 → 확인 →의 포아송 비는 확인 → 단계 4.1.11.2에 저장된 PIV 출력 파일을 선택합니다. 저장 FTTC 이미지 스택과 PIV 출력과 동일한 디렉토리에 발생합니다. </li></ol></li></ol></li><li> 면역 형광 현미경 분석 실험 <ol><li> 층류 후드에 면역 염색 할 수있는 기판 가지고 배양 배지를 제거합니다. </li><li> PBS로 기판을 세척하여 실온에서 20 분 동안 PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드와 세포를 고정합니다. </li><li> 3 회 (5 분마다) PBS로 기판을 세척 할 것. 따라서, 30 분 동안 500 ㎕의 신호 인핸서와 기판을 배양하고 PBS로 헹군다. </li><li> 실온에서 45 분 동안 PBS 250 희석 : 1 단일 클론 항 vinculin 항체와 세포를 품어. 3 회 (5 분마다) PBS로 기판을 세척 할 것. </li><li> (200) 희석 : 1 차 항체 알렉사 플 루어 488 염소 항 마우스 IgG를 가진 샘플을 품어실온에서 30 분 동안 PBS에서. 3 회 (5 분마다) PBS로 기판을 세척 할 것. </li><li> F - 굴지 구조를 시각화하기 위해, TRITC 실온에서 45 분 동안 농도를 50㎍ / ㎖에서 접합체를 Phalloidin의와 세포를 품어. 3 회 (5 분마다) PBS로 기판을 세척 할 것. </li><li> 이미지 공 초점 주사 레이저 현미경을 사용하여 샘플 (도 5a -도 5d). </li></ol></li></ol>

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셀룰러 견인 스트레스는 최근 전이 상태 (13)의 잠재적 인 생물 물리학 적 지표로 떠오르고있다. 그러나 차 종양 세포와의 실험 견인 데이터는 현재까지 문헌에 존재하지 않습니다. 또한, 다른 강성 폴리 아크릴 아마이드 젤에 직접 배양 고립 된 차 대장 세포는 아직보고되지 않습니다. 따라서, 우리는 겔 및 폴리스티렌 (도 2)에 최적화 된 일차 결장 세포 배양 조건을 확립한다. 소프트 겔 제조시 세포 배양 표면 근방 형광 마이크로 비드 캡슐화 변위 필드 및 일차 인간 세포 (도 4C, 4D 및 4E)에 의해 생성 된 마찰의 측정을 가능하게한다. 또한, 면역 형광 분석은 세포 골격 조직 및 기판 강성도 변화와 같은 국소 유착 (- 5D도 5a)에 관한 중요한 정보를 제공 할 수있다. 그 다른 암과 정상 불후의 세포를 참고라인도 확산, 굴지의 스트레스 번들 형성을 증강 증가 기판 강성 <sup...

기계적인 미세 환경은, 생화학 적 요인 외에, 세포 기능을 조절하는데 중요한 역할을한다는 것이 최근 점점 분명하게되었다. 세포를 감지하고이 3-7 (2D 배양에서와 같이)에 부착 또는 (3D 배양에서와 같이)에 의해 포위되어있는 기판의 강성에 응답 할 수있다. 이렇게함으로써, 세포 분화 3, 4 형태, 이주 / 운동성 5 바이오 물성 (6), (7)의 성장 및 기타 프로세스를 변조 할 수있다. 암세포는 또한 접착 수용체의 조정, 계층 - 기계 화학적 결합과 관련된 신호 전달 막 단백질, 세포 골격 구조, 분자 모터 (1, 2)을 사용하여 2 차원 및 3 차원 매트릭스 강성 응답한다. 예를 들어, 유선 상피 세포 (MEC의) 150 아빠 기판에 배양 할 때 강성과 유사 정상적인 선포 실질을 형성건강한 유방 조직. 흥미롭게도, 이들은 종양 기질 (8)의 강성을 모방 딱딱한 기판 (&gt; 5,000 PA)에서 배양 구조와 전사 모두 현상 종양의 특징은 나타낸다. 또 다른 실험은 유방 종양 콜라겐 가교 ECM 9 보강 동반되는 것을 나타낸다. 최근의 실험들은 생리적으로 중요한 강성 (20-47 kPa의)을 갖는 2 차원 기판에서 배양 있지만 (3.6 GPA) 기판 상에 매우 뻣뻣하지 않을 때 인간 결장암 (HCT-8) 세포 표현형 (MLP) 등의 전이를 표시하는 것을 보여준다 10- 제 12 .These 셀 폼과 같은 종양 세포 클러스터와 그 주변부터 서로 해리. 변화는 그들은 세포 - 세포 및 세포 - ECM 부착을 줄이고, 철새가, 확산, 발생 (R 전환에 E) 둥근 형태이 상피로. 이 발생하지 않는 매우 어려운 폴리스티렌 기판에 HCT-8 세포 배양악성 특징. 따라서이 HCT-8 세포 인해 적절한 미세 환경에 대한 노출로 전이 될 수 있음을 가정하고있다. 이들 실험이없는 일차 인간 암 세포 불멸화 암 세포주 또는 일차 쥐 유래 세포로 수행되는 것을 주목할 필요가있다. 최근 연구 증강 셀룰러 트랙션 응력 전이성 세포 13 국지적 연구는 폴리 아크릴 아미드 겔에서 다른 인간 암 세포주에 대한 견인력을 측정하는 것을 포함하는 잠재적 생물 리 학적 특성으로서 사용될 수 있다는 것을 제안한다. 또한, 전이성 암세포가 모든 경우에 13 비 전이성 세포에 비해 상당히 높은 트랙션 응력을 발휘할 수있는 것을 알 수있다. 그러나,이 결과는 직접적으로 유도 뮤린 유방암 세포주 (14)에 앞서 발표 결과와 모순. 또한, 최근의 연구는 세포 골격 리모델링 프로 불후 및 기본 인간의 세포 사이에 현저한 차이를 강조TEIN 프로파일과 세포 생존 단백질 발현 15. 따라서, 일차 인간 암 세포에 대한 견인을 포함한 생물 물리학 적 분석의 많은 방문하는 것이 중요하다. 일차 세포가 불멸화 된 암 세포주 견인 경향 요점을 되풀이 것인지 이는 질문을 다룰 것이다. 여기에 설명 된 프로토콜은 부드러운 기판 (폴리 아크릴 아마이드 하이드로 겔)뿐만 아니라에 페트리 접시에 그들을 배양 (건강과 암 모두) 주 인간의 대장 세포의 분리에 최적화되어 있습니다. 프로토콜은 소화 및 단일 세포 현탁액 (16)에 외과 적 조직 샘플의 결과의 효소 분해에 기초한다. 우리가 아는이 직접 세포 계측법 견인 용 내장형 형광 마이크로 비드와 부드러운 하이드로 겔 기판에 절연 차 대장 암과 정상 세포를 배양의 첫 번째 데모입니다. 투명 겔 기판은 또한 면역 염색을 할​​ 수 있습니다. 이 분석은 밝혀 F - 굴지 조직의 차이기판 강성 변화와 같은 주요 인간의 대장 세포에 초점 유착. 이 세포 배양 플랫폼은 암 사전 진단을위한 매개 변수로 셀 강성과 견인 1 차 인간 세포의 다양한 생물 물리학 적 특성을 탐구의 가능성을 열어.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life technologies</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Worthington</td><td>LS003736</td><td></td></tr><tr><td>Collagenese</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>3- Aminopropyltrymethoxysilane (ATS)&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>281778</td><td></td></tr><tr><td>글루타르알데히드</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>01201-5</td><td></td></tr><tr><td>아크릴아미드</td><td>시그마-알드리치</td><td>A4058</td><td></td></tr><tr><td>N-메틸렌비스아크릴아미드 (비스)</td><td>시그마-알드리치</td><td>M1533</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 완충 용액</td><td>시그마-알드리치</td><td>83264</td><td></td></tr><tr><td>과황산암모늄</td><td>바이오-라드</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>인간 피브로넥틴</td><td>BD 생명과학</td><td>354008</td><td></td></tr><tr><td>히드라진 수화물</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18412</td><td>위험한</td></tr><tr><td>아세트산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드&nbsp;</td><td>전자 현미경 과학</td><td>RT15710</td><td></td></tr><tr><td>신호 강화제</td><td>생명 과학</td><td>I36933</td><td></td></tr><tr><td>단클론 항 빈쿨린 항체&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V9131</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 염소 안티-마우스 IgG</td><td>Life technologies</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>TRITC phalloidin conjugates&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>P1951</td><td></td></tr><tr><td>0.1 &마이크로; m 형광 비드</td><td>Life technologies</td><td>F8801</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 트립신-EDTA</td><td>라이프 테크놀로지</td>스 <td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Materials</td></tr><tr><td>12 mm2 glass 커버 슬립</td><td>Corning</td><td>2865-12</td><td></td></tr></tbody></table>

수술 조직에서 기본 인간 대장 종양 세포의 분리 및 견인 세포 계측법 부드러운 탄성 기판에 직접 배양

Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry

암 세포 접착 수용체 이루어지는 코디 계층 - 기계 화학적 시스템과 관련된 신호 전달 막 단백질, 세포 골격 구조, 분자 모터 (1, 2)을 사용하여 복잡한 방식으로 기계적 강성 매트릭스 응답. Mechanosensitivity를 다른 암세포의 시험관에 하지 일차 인간 암 세포 불멸화 세포주 또는 일차 세포를 쥐 유래, 주로 연구 하였다. 따라서, 작은 시험관 일차 인간 대장 암 세포의 mechanosensitivity 대해 공지되어있다. 여기서, 최적화 프로토콜은 건강한 인간 암 수술 조직 샘플로부터 일차 인간 결장 세포의 분리를 설명하는 현상된다. 고립 대장 세포를 피브로넥틴 (세포 외 기질에 의해 기능화 기판 폴리 아크릴 아마이드 하이드로 겔과 강성 폴리스티렌 (~ 3.6 GPa의 강성) (10 kPa의 강성) (2 kPa의 강성) 부드럽고 뻣뻣한에 성공적으로 배양이 경우에). 형광 마이크로 비드를 세포 배양 표면 근방 소프트 겔에 포함되고, 정지 마찰 분석법 자유로운 개방형 액세스 소프트웨어를 이용하여 세포 수축 응력을 평가하기 위해 수행된다. 또한, 다른 강성 기판상의 면역 형광 현미경 검사는 기판의 강성의 함수로서 초점 유착을 함유하는 일차 전지의 형태, 세포 골격 조직 및 vinculin에 대한 유용한 정보를 제공한다.

위에서 설명한 프로토콜은 성공적으로 기관 검토위원회의 지침에 따라 네 가지 환자에서 여러 조직 샘플 (N = 12)을 위해 사용된다. 그림 1A 바로 세포 배양에 대한 조직 섹션이 얻을 수있는 수술 후 대표적인 대장 종양을 보여줍니다. 추가 처리를 위해 층류 후드 전사 후 HBSS 용액 전형적인 조직 절편은도 1b에 도시되어있다. 소화 및 단일 세포 현탁액으로 수술 조직 샘플의 효소 분해의 개략도는도 2에 도시되어있다. 성공적인 조직 분리 한 후, 고립 된 차 인간의 세포는 PA 젤 폴리스티렌 요리에 씨앗을 품고있다. 위상차 현미경 사진 (도 3A 및 3B)는, 기판의 강성의 함수로 일차 인간 대장 암과 정상 세포의 대표적인 형태를 나타낸다. 이는 분명하다(건강과 암 모두) 주 결장 세포는 PA 젤 (그림 3a<...

외과적 결장 종양 및 정상 조직에서 일차 인간 세포를 추출하기 위한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 그런 다음 분리된 세포를 세포외 기질 단백질에 의해 기능화되고 형광 마이크로비드가 내장된 부드럽고 탄력 있는 기질(폴리아크릴아미드 하이드로겔)에서 배양합니다. 견인 세포 분석은 세포 수축 응력을 평가하기 위해 수행됩니다.

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion ...

이 절차의 전반적인 목표는 수술로 제거된 인간 결장 종양 및 정상 조직으로부터 일차 세포를 분리하고, 분석을 위해 서로 다른 탄성을 가진 기질 위에서 이들을 직접 배양하는 것입니다. 이는 먼저 인간 결장 종양과 정상 부위에서 수술 조직을 수집함으로써 수행됩니다. 다음으로, 잘게 자른 조직을 효소적으로 해리하여 수많은 단일 세포를 얻습니다.마지막 단계는 나노 규모의 형광 비즈가 내장된 소프트 폴리아크릴아미드 하이드로젤과 폴리스티렌 접시 위에 분리된 세포를 배양하는 것입니다. 최종적으로, 공간적 세포 견인 맵을 얻기 위해 견인 세포 측정법(traction cytometry)을 수행하며, 세포 골격 조직을 시각화하기 위해 면역형광 현미경 검사를 수행합니다. 이 기술의 주요 장점은 수술 조직에서 분리된 일차 인간 결장 세포를 견인 세포 측정 및 면역형광 현미경 분석을 위해 서로 다른 강성을 가진 기질 위에 직접 배양할 수 있다는 점입니다.이 방법은 원발성 종양 세포의 수축성이 암 예후의 잠재적 마커로 사용될 수 있는지에 대한 답을 얻는 데 도움이 될 수 있습니다. 우선, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 종양 조직 샘플을 수집하십시오. 그런 다음 피펫을 사용하여 6 mL에서 7 mL의 햑스 평형 염 용액(Hank's balanced salt solution) 또는 HBSS가 담긴 6-웰 플레이트에 조직을 넣으십시오.6웰 플레이트를 아이스 블록 위에 두고 조직을 HBSS 용액으로 두 번 헹굽니다. 다음으로, 멸균 가위를 사용하여 조직을 깨끗하게 분리된 구획으로 자릅니다. 멸균 메스 날을 사용하여 조직을 1~2 mm³ 이하의 작은 크기로 잘게 다집니다.조직을 옮기기 전, 0.1% trypsin 용액 1 mL가 들어 있고 라벨이 부착된 0.1% trypsin 바이알의 무게를 잽니다. 그 다음, 피펫을 사용하여 각 trypsin 바이알에 약 20 mg의 조직을 옮깁니다. 조직 전송 후 trypsin 바이알의 무게를 다시 재고, 그 차이를 조직 질량으로 기록합니다.이제 24-웰 플레이트의 각 웰에 약 20 mg의 조직과 1 mL의 trypsin을 붓습니다. 24-웰 플레이트를 4 °C의 쉐이커에 넣고 16~20시간 동안 둡니다. trypsin에서 16~20시간 동안 배양한 후, 피펫을 사용하여 조직을 4 °C의 2~3 mL 완전 성장 배지로 옮깁니다.바이알을 37°C의 온수욕조에 12~15분 동안 둡니다. 그다음, 조직을 HBSS 용액이 들어 있는 15 mL 바이알로 옮깁니다. 피펫을 사용하여 부드럽게 흔들어 주며 이 단계를 두 번째로 반복합니다.그 다음 조직을 HBSS 용액에서 꺼내 1 mL의 0.1% Collagenase 용액이 들어 있는 바이알로 옮깁니다. 가습된 세포 배양 배양기 내의 37 °C, 5% CO2 환경에서 45분 동안 배양합니다. 대기 시간 동안 15 mL 바이알에 담긴 성장 배지를 37 °C로 예열합니다. 이어서, Collagenase가 최소한으로 포함되도록 모든 조직 조각을 피펫 팁으로 빨아들인 후, 예열된 배지로 조직 조각만 배출합니다.배지 바이알. 그런 다음 6-웰 플레이트의 각 웰에 40 micron 필터를 넣고, 1 mL의 세포 배양 배지로 필터를 적십니다.조직이 완전히 해리될 때까지 10 milliliter 유리 피펫을 사용하여 배지 내에서 여러 번 재현탁합니다. 이때 피펫 팁을 바이알 바닥에 최대한 가깝게 유지하십시오. 그 다음, 용액을 필터 위에 부어 잔해와 해리되지 않은 부분들을 제거합니다.여과된 세포 현탁액을 배지 내에서 150 ×g로 5분 동안 원심분리합니다. 실온에서 상층액을 제거한 후, 세포 펠렛을 2 mL의 신선한 배양 배지로 재현탁합니다. 분리된 일차 세포를 원하는 농도로 세포외 기질(extracellular matrix) 또는 ECM 기능화 겔 및 폴리스티렌 디시에 접종합니다.견인력 현미경(traction force microscopy) 분석을 수행하려면, 먼저 0.25% trips가 포함된 EDTA 10% SDS 용액을 항온수조에서 37°C로 10분 동안 가온합니다. 견인력 실험 전, 세포 배양 인큐베이터에서 겔을 하나씩 꺼내어 현미경 스테이지 위에 놓습니다. 시야 내에서 단일 세포를 찾은 후, 페트리 접시의 뚜껑을 열고 세포의 위상차 이미지를 촬영합니다.다음으로, 이미징 모드를 형광으로 전환하고 적절한 필터를 선택하십시오. 이 과정 동안 현미경 스테이지나 시료를 이동시키지 마십시오. 그런 다음 세포 견인력에 의해 변위된 형광 비드의 이미지를 촬영하십시오.이제 세포를 젤에서 분리하기 위해 1 mL의 trypsin SDS 용액을 페트리 접시에 첨가합니다. 세포를 제거한 후, 비드의 참조 이미지를 촬영합니다. 면역염색을 진행할 기질을 라미나 후드로 옮겨 배양액을 제거합니다. 그런 다음 인산염 완충 식염수(PBS)로 기질을 헹구고, 실온에서 4% paraformaldehyde가 포함된 PBS로 20분 동안 세포를 고정합니다. PBS로 5분씩 총 3회 기질을 세척합니다.그 다음, 기질을 500 µL의 신호 증폭제와 함께 30분 동안 반응시킨 후 PBS로 헹굽니다. 이어서, PBS 내에서 1:250으로 희석한 단클론 anti vanolin 항체와 함께 세포를 실온에서 45분 동안 반응시킵니다. 그 후 기질을 PBS로 5분 동안 총 3회 세척합니다.샘플을 PBS에 1:200으로 희석한 secondary antibody LOR 4 88 goat anti mouse IgG와 함께 실온에서 30분 동안 반응시킵니다. 그 후 PBS로 기질을 5분 동안 총 3회 세척합니다. f actin 구조를 시각화하기 위해, 50 µL/mL 농도의 tetraethyl rod domine Phin conjugates와 함께 세포를 실온에서 45분 동안 반응시킵니다.그 다음, 이전과 동일하게 기판을 다시 세척합니다. 마지막으로 공초점 주사 레이저 현미경을 사용하여 샘플의 이미지를 촬영하며, 위상차 현미경 사진을 통해 일차 인간 대장암 세포와 정상 세포의 대표적인 형태를 보여줍니다. 기판 강도에 따라, 일차 대장 세포가 폴리아크릴아마이드 겔에 비해 폴리스티렌 디쉬에서 더 많이 퍼지는 것을 확인할 수 있습니다.병리적 헤마토실린 및 에오신 염색을 통해 침습성 선암종을 확인한 후, ECM이 코팅된 2 kPa의 소프트 젤에서 견인 분석을 수행합니다. 여기에는 변위된 비드 이미지와 기준 비드 이미지로부터 얻은 젤 내부에 삽입된 나노스케일 형광 비드의 스냅샷이 나타나 있습니다. 변위 장(displacement fields)은 ImageJ의 particle image velocimetry 플러그인을 사용하여 얻습니다.2 kPa 겔 상에서 침습성 결장암 세포에 의해 생성된 대표적인 비드 변위 장(displacement field)과 이에 따라 얻어진 견인 응력(traction stress)이 표시되어 있습니다. 변위 장에 상응하는 ImageJ Fourier transform traction cytometry 플러그인을 사용하였습니다. 여기에는 연성 2 kPa 겔과 강성 폴리스티렌 기질 상의 일차 인간 결장 세포에서 f-actin 및 cullin을 포함하는 국소 접착(focal adhesions)이 나타나 있습니다.부드러운 겔 위의 덜 퍼진 세포에서는 액틴 섬유가 나타나지 않았습니다. 또한, 부드러운 겔에서는 점상의 cullin을 포함하는 국소 접착이 관찰됩니다. 반대로, 단단한 폴리스티렌 기질 위의 일차 세포는 잘 퍼진 형태, 뚜렷한 액틴 및 스트레스 섬유, 그리고 분리되어 길게 늘어난 국소 접착을 보여줍니다.이 절차 이후에 원자 힘 현미경(atomic force microscopy)을 이용한 세포 강성 측정과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 효소 분해를 통해 수술 조직에서 결장 세포를 분리하고, 결과적으로 세포 수축력을 평가하기 위해 폴리아크릴아마이드 하이드로젤 위에 직접 배양하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 비디오는 견인력 현미경 분석에 대해 설명합니다. 이 분석은 형광 비드가 내장된 연질 탄성 하이드로겔에 존재하는 세포외 기질에서 인간 대장암 세포의 세포 견인을 측정합니다. 형광 비드의 결과 변위는 적절한 소프트웨어를 사용하여 측정됩니다.

견인 세포 분석 분석: ECM에서 암세포가 가하는 견인력을 정량화하는 방법

이 동영상은 기질 강성에 따른 변형을 이해하기 위해 원발성 인간 대장암 세포의 세포골격 및 국소 접착을 연구하는 기술을 설명합니다. 연질 및 경질 기질에서 암세포를 배양하면 암 예후를 위한 다양한 다운스트림 생물물리학적 측정이 가능합니다.

Cytoskeleton and Focal Adhesion Organization Assay: 기질의 세포 접착 및 확산을 연구하기 위한 면역형광 기반 방법

기본 생쥐 대장 종양 organoid을 설정하는 간단한 방법이 설명되어 있습니다. 이 방법은 대장 종양 세포가 생존하고 상피 정상적인 결장하지 않는 반면, 제한된 성장 인자를 포함하는 미디어 organoids로 성장하는 기능을 사용합니다.

기본 마우스 대장 종양의 체외 Organoid의 문화

근섬유는 정상과 질병 상태 모두에서 중요한 생리 과정을 조절하는 위장관의 영향력 기질 세포이다. 우리는 마우스 및 시험 관내 실험에 이용 될 수있는 인간의 결장 조직 모두에서 일차 근육 섬유 모세포의 분리를 허용하는 기술을 설명한다.

마우스와 인간의 대장 조직에서 주요 근육 섬유 모세포의 분리

합성, 조직 공학 대장 암 모델에서 레이저 microdissected 세포 및 기질의 분자 프로파일은 침습적 전방 및 암 관련 기질 세포에서 종양 세포 간의 계면에서 독특한 생물학을 특성화하고 해부 소설과 같은 처리 방식을 나타낸다.

분자 대장 암 세포의 3 차원 모델의 침윤성 종양 미세 환경의 프로파일 및<em&gt; 예 생체 내</em&gt; 섬유 아세포

우리는 마우스의 맹장에 종양 세포 또는 유기체를 주입하고이 모델에서 순환하는 종양 세포 (CTCs)를 분리하여 정형 적 대장 직장 종양의 형성을 기술합니다.

대장 암 정위 마우스 모델에서의 순환 종양 세포의 분리

다음 프로토콜 환자 파생 된 연 조직 육 종 (STS)의 주 문화는의 설립에 집중 한다. 이 모델 분자 배경 및 약리 프로필 이러한 드문 악성 종양의 더 나은 이해를 우리를 도울 수 및 STS 관리를 개선 하기 위한 추가 연구에 대 한 출발점을 대표할 수 있었다.

환자에서 파생 된 연 조직 육 종의 기본 문화 설립

종양 내 피 세포는 종양 microenvironment의 중요 한 결정 요인 및 질병의 과정. 여기, 인간 대 장 암 및 마약 테스트 및 병 인 연구에 사용 될 일반 콜론에서 순수 하 고 가능한 내 피 세포의 고립에 대 한 프로토콜을 설명 합니다.

정상적인 대 장 암과 대 장 암-향상 된 프로토콜에서 인간의 내 피 세포의 고립

현재 프로토콜은 원발성 암세포에서 3D 종양 배양 모델을 생성하고 세포 생존력 분석 및 현미경 검사를 사용하여 약물에 대한 민감도를 평가하는 것을 설명합니다.

환자 유래 종양 샘플에서 3차원 스페로이드 설정 및 약물에 대한 민감도 평가

종양 오가노이드는 암 연구와 개인 맞춤형 의학에 대한 접근 방식에 혁명을 일으켰습니다. 이는 임상적으로 관련성이 높은 종양 모델을 나타내며 이를 통해 연구자들은 임상에서 종양보다 한 발 앞서 나갈 수 있습니다. 이 프로토콜은 신선한 췌장 종양 조직 샘플과 췌장 선암 기원의 환자 유래 이종이식에서 종양 오가노이드를 확립합니다.

췌장암 유래 종양 오가노이드 및 섬유아세포를 신선한 조직에서 확립

이 프로토콜은 종양 침윤 림프구(TIL)와 공동 배양된 환자 유래 대장암(CRC) 오가노이드 모델을 만들어 이들의 상호 작용과 치료 잠재력을 연구하는 방법을 설명합니다. 이 모델은 종양 미세환경에서 면역 반응을 탐색하고 맞춤형 CRC 치료를 위한 TIL 기반 요법의 효능을 예측할 수 있는 전임상 플랫폼을 제공합니다.

환자 유래 대장직장 종양 오가노이드(Patient-derived Colorectal Tumor Organoids)와 종양 침윤 림프구(TIL)의 공동 배양 시스템 구축

배우세요 수술 조직에서 기본 인간 대장 종양 세포를 분리하고 부드러운 탄성 기판에 직접 배양하는 방법을. 견인 세포 계측법으로 세포 수축력을 분석하여 종양 생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

수술 조직에서 기본 인간 대장 종양 세포의 분리 및 견인 세포 계측법 부드러운 탄성 기판에 직접 배양

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