Name: 염색질 레귤레이터 및 미국에서의 게놈 전체의 스냅 샷 아프리카 발톱 개구리 태아 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: 배우세요 Xenopus 태아에서 ChIP-Seq을 이용한 염색질 레귤레이터의 게놈 전체 위치 결정 방법입니다. 이 프로토콜은 초기 배아 발달 중 유전자 발현 조절 메커니즘을 연구하는 데 활용됩니다.

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X. tropicalis 게놈(xenTro2, xenTro2r)을 HOMER에 구현한 Chris Benner와 염기서열분석 후 분석에 대한 논의를 위해 Gilchrist 실험실에 감사드립니다. I.P.는 GO 용어 분석을 지원했습니다. G.E.G와 J.C.S.는 웰컴 트러스트(Wellcome Trust)의 지원을 받았으며 현재 의학 연구 위원회(Medical Research Council, 프로그램 번호 U117597140)의 지원을 받고 있습니다.

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</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

우리의 프로토콜은하고 아프리카 발톱 개구리의 배아에서 게놈 전체 염색질 프로파일을 분석하는 방법에 대해 설명합니다. 그것은 실리에 풍부한 게놈 사이트를 나타내는 읽기의 수백만을 처리하는 생체 내에서 내인성 유전자 좌에 가교 단백질에서 모든 단계를 다루고 있습니다. 게놈 초안의 증가 번호를 사용할 수 있기 때문에,이 프로토콜은 다른 모델과 비 모델 생물에 적용해야합니다. 이전의 연구 8,31,33,34에서 떨어져이 프로토콜을 설정하는 가장 중요한 실험 부분은, 가교 핵을 추출 후 고정 절차입니다. 그것은 효율적인 염색질 용해 화 및 전단 쉽게 업 스케일링을 용이하게한다. 함께 도서관 준비의 개선 된 효율성이 프로토콜은 반에서 관심있는 염색질 관련 항원을 발현하는 이백만 세포에 높은 복잡성 칩-SEQ 도서관의 건축을 할 수 있습니다. 칩 qPCR의 실험의 경우, 이들 세포의 몇 만 정상적으로 충분아마도 여섯 별개의 게놈 유전자 좌에서 DNA 농축을 확인합니다. 이러한 숫자는 보수적이지만, 단백질 발현 수준, 항체의 품질에 따라 효율, 에피토프의 접근성을 가교 달라질 수있다. 가이드로, 단일 Xenopus의 배아 중반 포배 단계 (Nieuwkoop 및 페이버 (29) 후 8.5)에서 약 4,000 세포를 포함, 후반 낭배 단계 (12)에서 40,000 세포와 초기 tailbud 단계 (20)에서 10 만 셀. 효율적인 면역에 대한 정확한 고정 시간은 칩 qPCR에 (10 항)에 의해 경험적으로 결정해야합니다. 실험이 X를 포함하는 경우 일반적으로 더 이상 고정 시간이 필요합니다 배아, 초기 발달 단계, 약한 (또는 간접) DNA 결합 특성을 laevis의. 그러나, 염색질 전단 효율성이 떨어질대로, 40 분보다 긴 아프리카 발톱 개구리 배아를 고정, 또는 표시 (섹션 3)보다 더 많은 배아를 처리하지 않는 것이 좋습니다. 그것은 중요하지매우 어려운 노른자 풍부한 배아에서 핵 추출을 할 수 포름 알데히드를 담금질이 일반적인 단계로 고정 후 어떤 글리신를 사용합니다. 현재, 그 이유는 알려져 있지 않다. 또한 포름 알데히드 부가 물 상기 글리신 아미노 기 또는 아르기닌 잔기 35 N 말단과 반응하여 생각할 수있다. 항체는 칩 실험의 핵심입니다 충분한 컨트롤 (Landt 등. (36) 가이드 라인을 참조) 관심의 항원에 대한 특이성을 보여주기 위해 수행 될 필요가있다. 더 칩 등급 항체가없는 경우이 단백질이 차지하는 결합 부위 내인성 수 37, 에피토프 태그 융합 단백질 대응 소개 합법적 대안이 될 수있다. 이 경우, uninjected 배아는 음성 대조군보다는 비특이적 혈 칩으로 사용하는 것이 최선이다. 관심의 단백질이 enri의 가난한 복구의 결과로 낮은 수준에서 표현되는 경우,이 전략은 적용 할 수있다CHED DNA. 왜냐하면 사용중인 DNA의 소량 칩-SEQ 라이브러리 제조용으로서,이 세정 공정 수를 줄이고 최소한 DNA의 손실을 유지하는 반응을 조합하는 방법을 선택하는 것을 권장한다. 어댑터와 프라이머 (특정 재료 / 장비의 표 참조) 멀티 플렉스 시퀀싱 및 NGS 플랫폼과 호환 될 수 있도록해야합니다. (긴 단일 가닥 무기를 포함) Y-어댑터를 사용하는 경우, 그것은 크기 선택 DNA 삽입하기 전에 PCR의 3-5 라운드 사전 증폭 라이브러리에 중요하다 (예., 100 내지 300 bp) 겔 전기 영동에 의해. 단일 가닥 말단 DNA 단편이 균질하게 이동. 시험은 PCR 사이클의 총 수를 결정하도록 권장 입력 DNA (예를 들면, 0.1, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20 NG)의 다양한 양으로 실행 (이하 또는 18 사이클 같음) 크기를 만드는 데 필요한 100-200 NG의 - 선정 된 라이브러리입니다. PCR 사이클의 수를 줄이면 redu의 시퀀싱을 렌더링ndant은 덜 읽습니다. 고상 가역적 고정화 비즈 효율적으로 관심있는 DNA를 복구하고 안정적​​으로 결찰 및 PCR 반응이없는 임의의 어댑터 및 이량 체를 제거하는 시약을 정리 좋다. 수, 유형 및 길이의 측면에서 약 20-30000000 단일 엔드 36 bp의 충분한 깊이와 전체 Xenopus의 게놈을 커버하는 대부분의 칩 서열 번호 실험에 충분하다의 읽기, 읽기의. 가장 널리 NGS 기계는 이러한 기준을 충족 일상적으로 할 수있다. 그러나, 판독의 광범위한 분포가 예상되는 경우의 판독 샤프한 피크보다 오히려, 히스톤 변형 관찰로, 수를 늘리는 것이 유리할 수있다. 다수의 칩 - 서열 번호 실험을 위해, 4-5 다르게 인덱싱 라이브러리 풀링 할 수 있고, 고성능 NGS 기계를 사용하여 하나 이상의 유동 세포 차선 서열화. 때때로 mappability w을 증가 판독 길이 및 서열 DNA 템플릿의 양단 (페어링 엔드)를 연장하는 것이 바람직하다반복적 인 게놈 영역 내에서 염색질 암탉 분석입니다. 이 프로토콜은 전사 인자 시그널링 매개체 번역 후 변형으로 히스톤 염색질 다양한 기능에 성공적으로 적용되었다. 그들이 개발하고 염색질 프로파일을 해석하기 어렵게 될 그러나, 배아 세포 이질성의 증가 학위를 취득. 유망 단계는 세포 유형 특정 핵 (38, 39)를 추출하여 조직 특별히 프로필 염색질 풍경에 애기 장대와 초파리되었습니다. 우리의 프로토콜은 다른 배아 조직 특이 칩 서열 번호에 대한 방법을 포장 할 수있는 핵 추출 단계를 포함한다.

생체 내에서 단백질-DNA 상호 작용을 특성화하려는 첫 번째 시도는 박테리아와 초파리에서 RNA 중합효소 매개 유전자 전사를 이해하기 위한 노력의 일환으로 약 30년 전에 보고되었습니다1,2. 그 이후로, 뚜렷한 염색질 특징(ChIP)을 풍부하게 하기 위해 면역침전을 사용하는 것이 널리 채택되어 높은 효율로 결합 이벤트와 염색질 상태를 포착했습니다3. 그 후, 강력한 마이크로어레이 기술의 출현으로 이 방법은 게놈 전체 염색질 풍경의 특성화로 이어졌습니다4. 최근에는 염색질 프로파일링이 더욱 포괄적이고 고해상도가 되었는데, 이는 이제 수백만 개의 공동 면역침전된 DNA 템플릿을 병렬로 염기서열 분석하고 게놈(ChIP-Seq)5에 매핑할 수 있기 때문입니다. 점점 더 많은 게놈 어셈블리를 사용할 수 있게 됨에 따라 ChIP-Seq는 생물학적 과정의 기초가 되는 게놈 조절에 대해 자세히 알아볼 수 있는 매력적인 접근 방식입니다. 
여기에서는 개구리 Xenopus와 같은 난황이 풍부한 배아에서 ChIP-Seq를 수행하는 프로토콜을 제공합니다. 널리 사용되는 두 Xenopus 종인 X. tropicalis와 X. laevis의 게놈 초안이 현재 International Xenopus Genome Consortium6에 의해 발표되었습니다. Xenopus 종의 배아는 많은 수의 고품질 배아의 생산, 배아 자체의 큰 크기 및 외부 발달을 포함하여 게놈 전체 염색질 연구의 해석을 용이하게 하고 허용하는 많은 바람직한 기능을 공유합니다. 또한 배아는 세포 계통 추적, whole-mount in situ hybridisation, RNA overexpression 및 TALEN/CRISPR 매개 knockout 기술과 같은 고전적이고 새로운 조작에 적합합니다.
다음 프로토콜은 Lee et al., Blythe et al. 및 Gentsch et al.의 작업을 기반으로 합니다. 7-9. 간단히 말해서, Xenopus 배아는 관련 게놈 DNA에 공유 결합(교차 연결) 단백질을 결합하기 위해 관심 발달 단계에서 포름알데히드에 고정됩니다. 핵 추출 후, 가교 염색질은 특정 게놈 결합 또는 변형 부위에 대한 후속 염기서열분석에 집중하고 측면 DNA 염기서열의 기여를 최소화하기 위해 단편화됩니다. 그 후, 염색질 단편은 ChIP 등급 항체로 면역침전되어 관심 단백질을 포함하는 항체를 풍부하게 합니다. 동시 면역침전된 DNA는 단백질에서 제거되고 정제된 후 차세대 염기서열분석(NGS)을 위한 색인화된(paired-end) 라이브러리를 생성합니다. 마지막에는 ChIP-Seq 데이터의 시퀀싱 후 분석을 위해 간단한 명령줄이 제공됩니다.

<table><tbody><tr><td>1/16인치 테이퍼드 마이크로팁</td><td>Qsonica</td><td>4417</td><td>이 마이크로팁은 Misonix의 Sonicator 3000 및 Qsonica의 Q500/700과 호환됩니다.</td></tr><tr><td>뚜껑이 있는 8ml 유리 시료 바이알</td><td>Wheaton</td><td>224884</td><td>15-425 크기의 페놀 고무 안감 나사 캡이 있는 수성 시료용 8ml 투명 유리 시료 바이알.</td></tr><tr><td>어댑터</td><td>(예: IDT 또는 Sigma</td><td>NA</td><td>TruSeq 범용 어댑터) 
AATGATACGGCGACCACCGAG 
ATCTACACTCTTTCCCTACAC 
GACGCTCTTCCGATC*T. TruSeq 인덱스 어댑터, 
P-GATCGGAAGAGCACACGTC 
TGAACTCCAGTCAC &#8208; NNNNNN&#8208; 
ATCTCGTATGCCGTCT TCTGCTT*G. *, 5'에서 포스포로티오에이트 본드 포스페이트 그룹; 끝. NNNNNN, 색인(DNA 염기서열에 대한 TruSeq ChIP 시료 전처리 가이드 참조). 정제된 HPLC 어댑터를 주문하십시오. 어댑터는 등몰 양(각 100 &#181; M)을 사용하여 95 &#176에서 천천히 냉각시킵니다. C에서 실온으로. 입력 DNA의 ng당 1.5 pmol을 사용합니다. -20 &#176;C에서 보관하십시오.</td></tr><tr><td>b2g4pipe (소프트웨어)</td><td>Blast2GO</td><td>비상업적</td><td>http://www.blast2go.com/data/blast2go/b2g4pipe_v2.5.zip</td></tr><tr><td>BLAST+ (소프트웨어)</td><td>Camacho 외</td><td>비상업적</td><td>http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastDocs&amp; DOC_TYPE=Bowtie</td></tr><tr><td>(소프트웨어)</td> 다운로드<td>Langmead et al.</td><td>비상업적</td><td>http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml</td></tr><tr><td>cisFinder (소프트웨어)</td><td>Sharov et al.</td>비<td>상업적인</td><td>http://lgsun.grc.nia.nih.gov/CisFinder/</td></tr> <tr><td>캐필러리 전기영동용 칩</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1504</td><td>이 칩에 1 &micro; l 라이브러리 품질 관리를 위한 DNA. 4 &deg;C에 보관하십시오.</td></tr><tr><td>칩 기반 모세관 전기영동 시스템</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2940CA</td><td>Agilent 2100 BioAnalyzer는 ChIP-Seq 라이브러리의 품질을 확인하는 데 사용됩니다. 시약을 4°C로 유지합니다.</td></tr><tr><td>ChIP-Seq 라이브러리 준비 키트(KAPA Hyper Prep Kit)</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK8504</td><td>키트에는 KAPA 말단 복구 및 A-테일링 효소 혼합물, 말단 복구 및 A-테일링 완충액, DNA 리가제, 결찰 완충액, KAPA HiFi 핫스타트 레디믹스(2X) 및 KAPA 라이브러리 증폭 프라이머 믹스(10X)가 포함되어 있습니다(PCR 프라이머 참조). 어댑터는 포함되어 있지 않습니다. -20 &deg;C에서 보관하십시오.</td></tr><tr><td>ChIP-Seq 라이브러리 준비 키트(대체, ThruPLEX-FD 준비 키트)</td><td>Rubicon Genomics</td><td>R40048</td><td>키트는 자체 스템 루프 어댑터와 프라이머를 사용합니다. 이 키트는 중간 정제 단계를 제거하며 KAPA Hyper Prep Kit만큼 민감합니다. -20 &deg;C에서 보관하십시오.</td></tr><tr><td>Cluster3 (software)</td><td>de Hoon et al.</td><td>비상업적</td><td>http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster</td></tr><tr><td>FastQC (소프트웨어)</td><td>Simon Andrews</td><td>비상업적</td><td>http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc</td></tr><tr><td>형광계</td><td>생명 기술</td><td>Q32866</td><td>Qubit 2.0 형광</td></tr><tr><td>측정기 시약</td><td>생명 기술</td><td>Q32851</td><td>이 키트는 Qubit 형광측정기를 위한 농축 어세이 시약, 희석 완충액 및 사전 희석 DNA 표준물질을 제공합니다. DNA 표준물질을 4°C로 저장합니다. C, 실온에서 완충액 및 염료.</td></tr><tr><td>포름 알데히드</td><td>시그마</td><td>F8775-4X25ML</td><td>포름 알데히드 용액, 분자 생물학 용, H2O에서 36.5-38 %, 10-15 % 메탄올로 안정화. 실온에서 보관하십시오. 주의: 포름알데히드는 부식성이며 독성이 강합니다.</td></tr><tr><td>겔 (E-Gel EX agarose, 2%)</td><td>life technologies</td><td>G4010</td><td>11웰의 프리캐스트 겔, 개방 가능한 형식. 교차 오염을 방지하기 위해 사다리와 도서관 사이의 한 차선을 비워 두십시오. 젤은 실온에서 보관하십시오.</td></tr><tr>ChIP-Seq 라이브러리의 크기를 선택하기 위한 <td>겔 전기영동 시스템</td><td>생명 기술</td><td>G6465</td><td>E-Gel iBase 및 E-Gel Safe Imager 콤보 키트.</td></tr><tr><td>겔 추출 키트</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td>모든 시약은 실온에서 보관하십시오. 500 &micro를 사용하십시오. l: DNA를 추출하기 위한 2% 아가로스 젤 슬라이스 100mg당 QG 버퍼. MinElute 컬럼(MinElute PCR 정제 키트)을 사용하여 DNA를 두 번 용리합니다.</td></tr><tr><td>HOMER (소프트웨어)</td><td>Chris Benner</td><td>비상업적</td><td>http://homer.salk.edu/homer/index.html</td></tr><tr><td>하이브리드화 오븐</td><td>Techne</td><td>FHB1D</td><td>하이브리드라이저 HB-1D</td></tr><tr><td>IGV (소프트웨어)</td><td>Robinson et al.</td><td>비상업적</td><td>http://www.broadinstitute.org/igv/home</td></tr><tr><td>Illumina CASAVA-1.8 품질 필터 (소프트웨어)</td><td>Assaf Gordon</td><td>비상업적</td><td>http://cancan.cshl.edu/labmembers/gordon/fastq_illumina_filter</td></tr><tr><td>Java TreeView (소프트웨어)</td><td>Alok Saldanha</td><td>비상업적</td><td>http://jtreeview.sourceforge.net</td></tr><tr><td>실험실 잭</td><td>Edu-Lab</td><td>CH0642</td><td>이 잭은 초음파 처리를 위해 사운드 인클로저의 샘플을 올리는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>사다리, 100 bp</td><td>New England BioLabs</td><td>N3231</td><td>1x 용액을 실온에 보관하십시오. -20 &deg;C에서 재고를 보관하십시오.</td></tr><tr><td>사다리, 1kb</td><td>New England BioLabs</td><td>N3232</td><td>1x 용액을 실온에 보관하십시오. -20 &deg;C에서 재고를 보관하십시오.</td></tr><tr><td>저잔류 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>생명 기술</td><td>AM12450</td><td>Nonstick, RNase-free 마이크로분리 튜브, 1.5ml</td></tr><tr><td>MACS2(소프트웨어)</td><td>Tao Liu</td><td>비상업적</td><td>https://github.com/taoliu/MACS</td></tr><tr><td>Magnetic beads</td><td>life technologies</td><td>11201D</td><td>이 Dynabeads는 비드 표면에 공유 결합된 친화성 정제 다클론 양 anti-mouse IgG를 가진 초상자성 비드입니다. 4 &deg;C에 보관하십시오.</td></tr><tr><td>마그네틱 비드</td><td>라이프 테크놀로지</td><td>11203D</td><td>이 Dynabeads는 친화성 정제 다클론 양 anti-rabbit IgG가 비드 표면에 공유 결합된 초상자성 비드입니다. 4 &deg;C에 보관하십시오.</td></tr><tr><td>마그네틱 비드</td><td>life technologies</td><td>10001D</td><td>이 Dynabeads는 재조합 단백질 A가 비드 표면에 공유 결합된 초상자성 비드입니다. 4 &deg;C에 보관하십시오.</td></tr><tr><td>마그네틱 비드</td><td>생명 기술</td><td>10003D</td><td>이 Dynabeads는 재조합 단백질 G가 비드 표면에 공유 결합된 초상자성 비드입니다. 4 &deg;C에 보관하십시오.</td></tr><tr><td>마그네틱 랙</td><td>라이프 테크놀로지</td>스 <td>12321 D</td><td>DynaMag-2 마그넷</td></tr><tr><td>MEME</td><td>베일리 외</td><td>비상업적</td><td>http://meme.nbcr.net/meme/</td></tr> <tr><td>Na3VO4</td><td>New England BioLabs</td><td>P0758</td><td>오르토바나데이트나트륨(100mM)은 단백질 포스포티로실 포스파르타아제에 일반적으로 사용되는 일반 억제제입니다. -20 &deg;C에서 보관하십시오.</td></tr><tr><td>NaF</td><td>New England BioLabs</td><td>P0759</td><td>불화나트륨(500mM)은 인산화릴 및 포스포스레오닐 인산가수분해효소의 일반 억제제로 일반적으로 사용됩니다. -20 &deg;C에서 보관하십시오.</td></tr><tr><td>NGS 기계</td><td>Illumina</td><td>SY-301-1301</td><td>게놈 분석기 IIx</td></tr><tr><td>NGS 기계 (고성능)</td><td>Illumina</td><td>SY-401-2501</td><td>HiSeq</td></tr><tr><td>Normal serum (항체 대조군)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2028</td><td>ChIP-qPCR 실험에서 염소 다클론 IgG 항체의 대조군으로 사용. 4 &deg;C에 보관하십시오.</td></tr><tr><td>Normal serum (항체 control)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2025</td><td>ChIP-qPCR 실험에서 마우스 polyclonal IgG 항체의 control로 사용합니다. 4 &deg;C에 보관하십시오.</td></tr><tr><td>Normal serum (항체 control)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2027</td><td>ChIP-qPCR 실험에서 토끼 polyclonal IgG 항체의 control로 사용. 4 &deg;C에 보관하십시오.</td></tr><tr><td>핵산 염색 용액</td><td>iNtRON</td><td>21141</td><td>1:50,000에서 RedSafe 핵산 염색 용액을 사용합니다. 실온에서 보관하십시오.</td></tr><tr><td>오렌지 G</td><td>시그마</td><td>O3756-25G</td><td>1-페닐라조-2-나프톨-6,8-디술폰산 디소듐 염. 4 &deg;C에 보관하십시오.</td></tr><tr>PCR에 의해 어댑터 결찰된 DNA 단편을 농축하기 위한 <td>PCR 프라이머</td>(예<td>: IDT 또는 Sigma</td><td></td><td>Primers): AATGATACGGCGACCACCGA*G 및 CAAGCAGAAGACGGCATACGA*G, 포스포로티오에이트 결합. 에단 포드(Ethan Ford)가 디자인한 프라이머. 5 &micro에서 프라이머를 결합하십시오. M씩 주세요. 5 &micro를 사용하십시오. L 50 &마이크로; l PCR 반응. -20 &deg;C에서 보관하십시오.</td></tr><tr><td>MinElute PCR 정제 키트&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28006</td><td>은 ChIP-qPCR 정제 및 전단 테스트 샘플입니다. MinElute 스핀 컬럼을 4 &deg에 저장합니다. C, 실온에서 다른 모든 완충액 및 수집 튜브.</td></tr><tr><td>페놀 : 클로로포름 : 이소 아밀 알코올 (25 : 24 : 1, pH 7.9)</td> <td>생명 과학 기술</td><td>AM9730</td><td>페놀 : 클로로포름 : IAA (25 : 24 : 1)는 pH 6.6에서 미리 혼합되어 공급됩니다. 제공된 Tris 알칼리 완충액을 사용하여 pH를 7.9로 높입니다. 4°C에 보관하십시오. 주의: 페놀:클로로포름:이소아밀 알코올은 부식성, 독성이 강하고 가연성입니다.</td></tr><tr><td>Primer3 (소프트웨어)</td><td>Steve Rozen & Helen Skaletsky</td><td>비상업적</td><td>http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi</td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 정제</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td>cOmplete, Mini, EDTA 프리. 10ml당 1정을 사용하십시오. 4 &deg;C에 보관하십시오.</td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 정제</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td>cOmplete, EDTA 무료. 50ml당 1정을 사용하십시오. 4 &deg;C에 보관하십시오.</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>life technologies</td><td>AM2548</td><td>proteinase K 용액 (20 &micro; g/&마이크로; l). -20 &deg;C에 저장하십시오.</td></tr><tr><td>RNase A</td><td>생명 기술</td><td>12091-039</td><td>RNase A (20 &micro; g/&마이크로; l). 실내 온도에 저장하십시오.</td></tr><tr><td>로테이터</td><td>: Stuart</td><td>SB3</td>, <td>Rotator SB3</td></tr>, <tr><td>SAMtools(소프트웨어)</td><td>Li et al.</td><td>비상업적</td><td>http://samtools.sourceforge.neta</td></tr><tr><td>고체상 가역적 고정 비드</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63882</td><td>Agencourt AMPure XP 비드는 ChIP-Seq 라이브러리에서 어댑터 이량체 오염을 최소화하는 데 사용됩니다. 4 &deg;C에 보관하십시오.</td></tr><tr><td>Sonicator 3000</td><td>Misonix / Qsonica</td><td></td><td>최신 모델을 사용할 수 있습니다. Q125, Q500 또는 Q700은 모두 가교 염색질 전단에 적합합니다.</td></tr><tr><td>사운드 인클로저</td><td>Misonix/Qsonica</td><td></td><td>옵션: 제조업체의 권장 사항에 따라 올바른 사운드 인클로저를 구하십시오.</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>eppendorf</td><td>22670000</td><td>24 x 1.5 mL tubes용 Thermomixer. 4°C부터 정확한 온도 제어; C 실온보다 높은 온도 99 &deg;C.</td></tr></tbody></table>

염색질 레귤레이터 및 미국에서의 게놈 전체의 스냅 샷<em&gt; 아프리카 발톱 개구리</em칩 서열 번호&gt; 태아

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

염색질 조절인자의 모집과 염색질 상태를 특정 게놈 자리에 할당하는 것은 발달 중 세포 운명 결정과 조직 및 장기 형성에 중추적인 역할을 합니다. 생체 내에서 이러한 염색질 특징의 위치와 수준을 결정하는 것은 게놈 요소의 시공간 조절에 대한 귀중한 정보를 제공하고 in vitro에서 배아 조직 발달을 모방하려는 열망을 지원할 것입니다. 게놈 전체 및 고분해능 프로파일링에 가장 일반적으로 사용되는 방법은 염색질 면역침전과 차세대 염기서열분석(ChIP-Seq)입니다. 이 프로토콜은 ChIP-Seq 실험을 위해 개구리 Xenopus와 같은 난황이 풍부한 배아를 처리하는 방법을 간략하게 설명하고 염기서열분석 후 분석을 위한 간단한 명령줄을 제공합니다. 프로토콜이 포름알데히드 고정 조직에서 핵을 추출하는 효율성이 높기 때문에 이 방법을 사용하면 게놈 전체 프로파일링을 위한 충분한 ChIP 물질을 얻을 수 있도록 쉽게 업스케일링할 수 있습니다. 당사의 프로토콜은 전사 인자(transcription factor), 신호 매개체(signaling mediator), 전사 기계(transcription mechanism)의 구성 요소, 염색질 변형인자(chromatin modifier) 및 번역 후 히스톤 변형(post-translational histone modification)과 같은 다양한 DNA 결합 단백질을 매핑하는 데 성공적으로 사용되었으며, 이를 위해 다양한 배발생 단계에서 수행되었습니다. 마지막으로, 이 프로토콜은 점점 더 많은 게놈 어셈블리를 사용할 수 있게 됨에 따라 다른 모델 및 비모델 유기체에 널리 적용할 수 있어야 합니다.

프로토콜은 잘 실행되는 경우 여기 제시된 동등한 결과가 예상되는 사용 및 항체 칩 품질 등급 (설명 참조)이다. 이 프로토콜은 포름 알데히드 고정 아프리카 발톱 개구리의 배아에서 핵의 추출 및 초음파에 의한 염색질의 효율적인 전단 (그림 1A-C)를 할 수 있습니다. 전단 염색질은 주로 100 내지 1000 염기쌍의 범위 및 BP (도 1C) 300 내지 500 피킹 DNA 단편의 비대칭 분포를 나타낸다. 면역 DNA의 최소 50 페이지가 성공적으로 비슷한 크기의 DNA를 삽입 (그림 2A)와 인덱스 쌍 엔드 칩-SEQ 라이브러리를 만들기 위해 필요합니다. 도서관은 약 12​​0 bp의 electropherogram에서 볼 수 있습니다 어댑터 이량 체의 크게 결여해야한다. 시퀀싱 합성에 의한시 읽기 사전 처리는 게놈 (그림 2B, C)에 매핑됩니다. 성공적인 실험과에서 <em&gt; X. tropicalis 배아는 하나의 엔드의 일반적 50-70%는 최대한 두 불일치와 7.1의 게놈 어셈블리에 고유하게 매핑 할 수 있습니다 (40) 혈압 읽습니다. 입력 게놈에 걸쳐 매우 균일하게 정렬 읽는 동안, 칩의 정렬은 관심 염색질 기능의 측면 가닥 별 부화에 결과를 읽습니다. 조각을 모두 5 &#39;말단 (그림 2C) 25 서열 때문입니다. 평균 단편 크기에 방향을 읽는 정렬을 확장하는 것은 같은 전사 인자 바인딩 이벤트와 같은 하나의 크로 마틴 기능에 대한 정확한 프로파일을 생성합니다. IGV 또는 기타 호환 게놈 브라우저 시각화 할 때 이러한 DNA의 점유는 피크로 나타납니다. MACS 등 피크 발신자는 이들 피크 (도 3a)의 위치를 결정하기 위해 사용된다. 수십 결합 부위의 수천이 방법은 X에서 결정되었습니다 tropicalis 게놈 같은 VegT (26) T-상자 전사 인자에 대한. 칩 qPCR에의 체험관사항 칩-SEQ (그림 3B)에 의해 발견 된 지역 농축을 확인해야합니다. 칩 서열 번호 실험 염색질 기능의 게놈 전체의 특성을 탐구 할 수 있습니다. 예를 들어, 전사 개시 및 종결 부위로 게놈 요소를 판독 분포를 산출하는 임의의 유전자 주위 공간 결합 선호도 (도 3c)를 강조 할 수있다. 마찬가지로, 피크 위치에서 읽기 분포의 히트 맵은 게놈 전체 규모 (그림 3D)에서 다른 염색질 기능을 비교하는 데 사용됩니다. 특정 전사 인자는 잠재적 인 공동 요인 (그림 3E)의 공동 풍부한 주제를 포함하여 이러한 종류의 정보를 검색 할 수 있습니다 게놈 DNA 기본 피크의 DNA 서열 특히. 드 노보 모티브 분석을 결합한다. 표적 유전자의 대다수는 DNA의 하부에 점유보다는 더 높은 레벨 (도 3f)를 도시한다. 이 규모없는 기능은 그럴 사이에서 매우 일반적인 것 같다anscription 인자와 표적 유전자의 작은 부분을 직접 생물학적 관련성 27,28으로 조절되는 것을 제시한다. 이러한 추가 Xenopus의 배아 (그림 3G)에서 염색질 기능의 생물학적 기능에 대한 통찰력을 공개 할 수있다 표적 유전자의 발현 차이 등 풍부한 GO의 조건이나 다른 속성의 분석. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52535/52535fig1highres.jpg" /> 아프리카 발톱 개구리의 배아 1. 염색질 면역 침전 과정을 그림. (A) 배아 포름 알데히드 고정 공유 바인드 (가교)에 관심 게놈 DNA와 관련된 단백질의 발달 단계에있다. 핵 추출 (B)시, 가교 염색질 바인딩 게놈 DNA 또는 측면에서는 DN을 최소화하여 염색질 변형 사이트를 좁힐 조각난시퀀스 (C). 그 후, 염색질 조각은이자 (D)의 에피토프를 포함하는 사람들을 풍요롭게 칩 수준의 항체와 면역 있습니다. 공동 면역 DNA가 단백질을 제거하고 NGS (그림 2)의 칩 조각 라이브러리를 작성하기 전에 (E)를 정제한다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52535/52535fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52535/52535fig2highres.jpg" /> 그림 2. 칩 서열 번호 라이브러리 준비, 시퀀싱 합성에 의한, 매핑 및 피크를 호출합니다. (A) electropherogram는 250 bp의 450의 DNA 템플릿과 좋은 칩 서열 번호 라이브러리를 표시합니다. 이러한 템플릿은 보편적 (58 BP)에 의해 형벌 관심의 DNA 삽입 및 인덱스 (63 BP) 어댑터를 수반한다. (B) </동일한 템플릿을 포함하는 각 클러스터와 클러스터의 강한&gt; 수백만, 가역, 독특한 형광과 동일한 종료 속성을 가진 네 개의 뉴클레오티드의 존재에 기초하여 시퀀스 기본이다. 형광 이미지 읽기에 궁극적으로 조립 해당 기지를, 전화를 실시간으로 처리됩니다. (C)는 만 유일하게 아프리카 발톱 개구리의 게놈지도가 유지되는 것을 읽습니다. 모든 단편은 5 &#39;말단으로부터 순서가되기 때문에, 칩의 매핑은 관심 염색질 기능의 측면 가닥 특정 피크의 결과를 판독한다. 이에 따라, 피크 호출자가 정확하게 크로 마틴 기능을 현지화 평균 조각 길이로 읽어 면역에서 유래하고 확장 농축을 감지합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52535/52535fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img aLT = &quot;그림 3&quot;SRC = &quot;/ 파일 / ftp_upload / 52535 / 52535fig3highres.jpg&quot;/&gt; 그림 3. 접합체의 T-상자 전사 인자 VegT (zVegT). 모두 여기에 표시된 수가 10 만명 정규화 읽어 고유 매핑과 비 중복이 읽습니다. (A) 발췌에 의한 후 염기 서열 분석 및 데이터 시각화의 예 zVegT의 게놈 전체 프로필 X에서 바인딩 (Nieuwkoop 및 페이버 (29) 후 12.5로 무대 11) tropicalis 낭배 배아. 각 피크, 확장 된 읽기의 더미 업, 하나의 결합 부위를 나타냅니다. 이들 피크는 1 % 미만의 오류 발견 레이트 (FDR)와 MACS2 의해 호출된다. 각 mesp 유전자 바인딩 매우 인접 상류 zVegT를 보여줍니다,하지만 mespa 및 mespb는 그 단계 (RNA-SEQ 데이터 30)에 의해 표현된다. (B) zVegT의 DNA 점유율 수준 여러 유전자 ​​좌에서 칩 qPCR에 의해 결정 (비 포함 KB 상류 β 액틴의 -bound 지역 0.5) 확인 합니칩 서열 번호에 의해 발견 된 특정 농축을 RM은. (A)에서 (빨간색 막대)라고 피크 mespa에 대한 결과를 비교한다. DNA 점유 레벨은 모두 입력의 비율, VegT 항체 (IgG의 이소 타입의 토끼 폴리 클로 날) 및 항체 제어 (정상 토끼의 IgG)와 칩 (Chip) 칩으로 보여집니다. 오차 막대는 두 개의 생물학적 반복 실험의 표준 편차를 반영한다. (C) Metagene 분석 주위에 다른 게놈 영역 및 유전자 기관 내 프로모터 상대에 바인딩 우선 zVegT을 (태그 25 bp의 이상 비닝)를 보여줍니다. (D)는 히트 맵은 K-평균을 보여줍니다 클러스터 (K = 5) DNA 점유율 수준 낭배 단계에서 모든 zVegT 바인딩 지역에 zVegT과 된 Smad2 /의 Smad3 (칩 서열 번호 데이터 31) 상대의 (태그는 25 bp의 이상 비닝). 히트 맵은 드 노보 모티브 분석 zVegT-의 38 %에 결합 모티프 정식 T-상자 전사 인자를 발견 2 기반 BP 당 5 태그를 중심으로. (E) 로그입니다기본 모티브 스코어 배경 서열에서 5 %의 비율로 발견 정규화 경우 결합 영역. 정식 된 Smad2 / Smad3이 결합 모티프가 거의 농축되지 않은 반면, 밀도지도, zVegT 결합 부위의 중앙에 T-상자 모티브 가장 높은 농축을 보여줍니다. (F) 히스토그램은 각 표적 유전자에 대해 계산된다 zVegT의 DNA 점유율 수준을 보여줍니다 [-] 모든 피크 (+/- 200 BP) 5킬로바이트 상류 사이에서. 전사 시작 사이트를 대응하고 1킬로바이트 하류 [+] (G) 가장 높은 DNA 점유율 내 -5 킬로바이트 수준과 1킬로바이트 아르와 최고 300 유전자 초기 배아 발달의 생물학적 과정에 대한 풍부. 이 용어가 zVegT의 추정 함수와 함께 줄에 이동합니다. FDR은 양측 피셔의 정확한 테스트를 기반으로 여러 테스트를 위해 수정됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52535/52535fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

방법 염색질 규제 및 염색질 상태의 문제는 생체 내에서 유전자가 세포 운명 결정이 배아에서 어떻게 만들어 지는지 초기에 대한 우리의 이해의 열쇠입니다 영향을 미칩니다. 칩 서열 번호 - 글로벌 수준입니다 Xenopus의 배아 여기 설명에서 크로 마틴의 기능을 조사하기 가장 인기있는 방법.

The recruitment of chromatin regulators and the assignment of chromatin states to specific genomic loci are pivotal to cell fate decisions and tissue and ...

일반적으로 ChIP-seq(chromatin immunoprecipitation의 약자)로 알려진 이 절차의 목표는 차세대 염기서열분석(next-generation sequencing)으로 알려져 있으며, opus 배아에서 염색질 조절인자와 염색질 상태의 게놈 전체 위치를 결정하는 것입니다. 이것은 먼저 zap 배아를 고정시켜 DNA 관련 단백질을 게놈에 공유 연결함으로써 달성됩니다. 다음으로, 핵이 추출되고 염색질이 용해되어 초음파 처리에 의해 공유됩니다.이 시점에서 관심 있는 DNA 연결 단백질은 면역침전과 광범위한 세척에 의해 정제됩니다. 마지막 단계는 정제된 DNA 단편에서 색인화된 ChIP-seq 라이브러리를 만드는 것입니다. 궁극적으로, 소위 res라고 불리는 이러한 DNA 단편의 수백만 개의 5개의 프라임 남성이 병렬로 염기서열 분석되고 게놈에 정렬되며 평균 단편 길이로 확장됩니다.소위 피크(peak)라고 하는 res의 국소 농축은 관심 단백질의 모든 부위 특이적 DNA 점유를 식별하여 게놈 전체 특성에 대한 연구를 확장하기로 결정했습니다. 따라서 이 프로토콜은 에뮤 배아의 게놈 전체 염색질 구조에 대한 자세한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 염기서열 분석된 게놈을 가진 다른 유기체에도 잠재적으로 적용될 수 있습니다.증서 배아부터 시작하십시오. 이 시점까지의 세부 정보는 텍스트 프로토콜에 제공됩니다. 8ml 유리 바이알에 옮겨 담아 0.01 XMMR로 세척합니다.세척 후 1%파라 포름알데히드와 0.01 XMMR로 배아를 고정합니다. 실내 온도에서 최소 15분에서 40분 이상 수정하지 않도록 합니다. 배아를 차가운 0.01 XMMR로 세 번 세척하여 수정을 종료합니다.배아가 용액의 표면에 닿지 않도록 하십시오. 표면 장력으로 인해 파열될 수 있습니다. 고정액이 씻겨 나가면 마이크로 쓰레기 튜브에 250개의 배아를 분취합니다. 그런 다음 가능한 한 0.01 XMMR의 저체중을 늘리고 염색질 추출을 진행하여 일시 중지합니다.여기서 배아를 250마이크로리터의 차가운 HEG 완충액에 동일시합니다. 완충액에 정착한 배아는 액체 질소로 스냅 냉동하고 섭씨 영하 80도에서 보관할 수 있습니다. E one buffer에서 고정된 배아를 균질화하는 것으로 시작합니다.업스케일링 및 버퍼 준비에 대한 자세한 내용은 텍스트 프로토콜에 제공됩니다. 다음 원심분리기. 섭씨 4도에서 균질화는 흡입 및 사테를 버리고 펠릿을 E 1에 다시 현탁시킵니다.다시 말하지만, 샘플을 얼음 위에 10분 동안 보관합니다. 원심분리를 반복하고 이번에는 Reese가 E two에서 팔레트를 일시 중단합니다. 균질화가 얼음 위에서 식는 동안 10분 동안 기다립니다.그런 다음 원심분리를 다시 반복하고 Reese는 펠릿을 E three에 현탁시킵니다. 이번에는 10분 더 식힌 후 현탁액이 상당히 투명하게 보여야 하는데, 이 시점까지 오닐 세제가 남아 있는 난황 혈소판의 대부분을 용해시키기 때문입니다. 이제 원심분리를 반복합니다. 앙드레.펠릿을 E 3의 1-3 밀리리터에 현탁시킵니다. 필요한 경우 마지막 원심분리 단계를 사용하여 원하는 가교 결합 핵에서 모든 펠릿을 분리합니다. 이 현탁액에는 또한 색소 과립과 일부 잔류 난황 혈소판이 포함되어 있습니다.이러한 과립과 난황 혈소판은 원심 분리에 의한 초음파 처리 후 염색질에서 분리됩니다. 이제 샘플을 얼음 위에 보관하고 염색질 단편화를 진행합니다. 또는 스냅, 임시 저장을 위해 샘플을 동결합니다.먼저 E 3의 샘플을 맞춤형 폴리스티렌 튜브로 옮깁니다. 초음파 처리의 경우 짧은 온도계 클램프를 사용하여 얼음물이 담긴 800 밀리리터 비이커에 튜브를 연결하여 초음파 처리 중에 호출 상태를 유지합니다. 비커를 잭에 놓고 잭을 조정하여 음파의 팁이 샘플에 약 2/3 정도 잠기도록 합니다.초음파 팁이 튜브 벽에 닿지 않아야 합니다. 총 7 분 동안 16 인치 테이퍼 마이크로 팁 초음파 처리 된 3000이 장착 된 Sonicate 3000에서 제조업체의 권장 매개 변수부터 시작하여 초음파 처리를 최적화하십시오. 초음파 처리 사이에 한 번에 30초.샘플을 잠시 동안 그대로 두십시오. 각 초음파 처리를 1의 거듭 제곱으로 시작하고 점차 2에서 4 사이로 증가시킵니다. 샘플이 거품을 일으키기 시작하면 튜브를 재배치하고 계속하기 전에 거품이 사라지도록 합니다.초음파 처리 후 염색질이 용해되고 전단됩니다.1.5ml를 미리 냉각시켜 마이크로 쓰레기 튜브에 넣고 최고 속도로 원심분리기를 가열합니다. 섭씨 4도에서 5분 동안 SNA를 수집하여 사전 냉각 튜브로 옮깁니다. 펠릿을 버리십시오.50마이크로리터의 SUP natant를 사용하여 단편화를 육안으로 평가하고 나머지는 면역침전을 위해 저장합니다. 먼저 10-30마이크로리터의 she 염색질 SUP를 새 튜브로 옮겨 입력 샘플로 사용합니다. 그런 다음 세포 100만 개당 약 1마이크로그램의 칩 등급 항체를 나머지 염색질에 추가합니다.염색질 항체 샘플을 하룻밤 동안 섭씨 4도에서 10RPM으로 배양합니다. 다음날, 항체 호환 마그네틱 비드를 E 3에서 섭씨 4도에서 5분 동안 세척합니다. 세척된 비드에서 제조업체가 제안한 비드 농도를 사용하여 항체 사전 배양된 염색질을 섭씨 4도에서 4시간 동안 회전시키면서 배양합니다.그런 다음 냉각된 리퍼 버퍼를 사용하여 비드를 10회 세척합니다. 자석을 20-30초 동안 사용하여 세척 사이에 비드를 분리합니다. 해결책은 명확해야 합니다.리퍼 버퍼 세척을 따라 냉각된 10 버퍼를 사용하여 한 번 세척합니다. 그런 다음 10 버퍼의 작은 부피에 있는 비드를 새 튜브로 옮깁니다. 비드를 분리하고 잔류 완충액을 버립니다.면역 침전된 염색질을 분리하기 위해. Reese는 50-100 마이크로 리터의 SDS 용액 완충액으로 비드를 구부리고 열 믹서로 튜브를 와류로 만듭니다. 그런 다음 튜브를 30초 동안 최고 속도로 원심분리하고 면역 침전된 염색질 용리액이 포함된 스내트를 수집합니다.SDS 솔루션을 반복하고 한 번 단계를 거친 다음 모든 용리액을 결합합니다. 그런 다음 이 프로토콜에 따른 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 DNA 추출, ChIP-seq, 라이브러리 준비 및 차세대 염기서열분석을 진행하면 공유 염색질은 주로 100 - 1000 염기쌍에 이르는 DNA 단편의 비대칭 분포를 보여주며 300 - 500 염기쌍 사이에서 최고조에 달합니다. 유사한 크기의 DNA 삽입물이 있는 인덱스 쌍을 이루는 N ChIP-seq 라이브러리를 성공적으로 만들려면 최소 50피코그램의 면역 침전 DNA가 필요합니다.라이브러리에는 어댑터 이량체가 거의 없어야 하며, 이는 약 120개의 염기쌍에서 전기표기법에서 볼 수 있습니다. ChIP-seq 라이브러리의 염기서열분석은 수백만 개의 짧은 DNA 염기서열, 이른바 reads를 줄입니다. 이들은 게놈에 매핑되고 입력 읽기는 게놈을 따라 균일하게 정렬됩니다.칩 판독은 관심 있는 염색질 특징(chromatin feature)을 측면에 있는 가닥 특이적 농축(strand specific enrichments)을 보여줍니다. 판독 방향의 정렬을 평균 단편 크기로 확장하면 전사 인자 결합 이벤트와 같은 단일 염색질 기능에 대한 정확한 프로파일이 감소합니다. 이것들은 제노의 열대 배아의 위장 목록 단계에서 채식 차에 대해 여기에서 볼 수 있듯이 게놈 브라우저에서 피크로 나타납니다.ChIP-seq 실험을 통해 피크의 기저에 있는 농축된 DNA 염기서열 모티프와 같은 염색질 특징의 게놈 전체 특성을 탐색하거나 유전자 표적의 유전자 온톨로지 분석을 수행할 수 있습니다. 이 방법은 연구자들이 매우 높은 해상도로 게놈 넓은 규모로 배아 염색질 풍경을 탐구할 수 있는 길을 열어줍니다.

genome-wide-snapshot-chromatin-regulators-states-xenopus-embryos-chip

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

ESC의 차별은 셀 타입의 특정 구조의 변화와 염색질의 구성과 일치한다. 이러한 변화의 감지는 stemcellness 및 세포 분화를 정의하는 메커니즘에 중요한 통찰력을 제공합니다. 염색질 immunoprecipitation (칩)은 줄기 세포 분화를 기본 분자 메커니즘을 해부하다하는 소중한 방법을 나타냅니다.

인간 배아 줄기 세포에서 염색질의 Immunoprecipitation

우리는 마우스 배아 조직에서 조직 특정 유전자 발현의 시작하는 동안이나 이후에 조직 특정 유전자의 상호 작용 요소를 식별하는 방법은 염색질의 immunoprecipitation (칩)을 보여줍니다. 그것이 정상적인 배아 발달 동안 발생으로이 프로토콜은 조직 특정 유전자 활성화의 연구에 대해 광범위하게 적용되어야합니다.

초기 마우스 배아를 사용하는 조직 특정 유전자에 대한 염색질의 Immunoprecipitation 분석

유전자 전사의 미세 조정 규정은 배아 세포 운명 결정의 기초가. 여기서, 우리는 줄기 세포와 마우스 배아 심장 개발 모두 심장 분화의 후생 유전 학적 조절을 조사하기 위해 사용 염색질 면역 침전 분석법을 설명한다.

배아 줄기 세포와 조직의 심장 차별화의 성적인 규정

여기, 우리는 chromatin immunoprecipitation (칩) 및 칩 seq 라이브러리 준비 프로토콜 낮은 풍부한 닭 배아 샘플에서 글로벌 epigenomic 프로 파일 생성을 설명 합니다.

낮은 풍부 배아 샘플 chromatin Immunoprecipitation (칩) 프로토콜

여기, 우리는 최적화 된 높은 처리량 칩 시퀀싱 프로토콜 및 냉동된 종양 조직 및 세포에서 게놈 넓은 chromatin 상태 패턴의 결정에 대 한 전산 분석 파이프라인을 설명합니다.

종양 조직에 높은 처리량 칩 시퀀스를 사용 하 여 Chromatin의 게놈 넓은 매핑 위한 통합된 플랫폼

이 작품 설명 프로토콜 위한 고해상도 제자리에 이 C 라이브러리에서의 세대 단단히 준비 사전 gastrulation 초파리 melanogaster 태아.

단단히 준비 초기 초파리 배아에서 게놈 넓은 Chromatin 구조 캡처 라이브러리의 생성

여기, 우리는 칩 Seq를 수행 하는 방법을 설명 및 CARIP-Seq, 다음-세대 시퀀싱, 라이브러리 준비 등 글로벌 epigenomic 및 chromatin 관련 RNA 생성 하 ES 세포에 지도.

CARIP-Seq와 칩 Seq: Chromatin 관련 된 RNAs 및 배아 줄기 세포에 단백질 DNA 상호 작용을 식별 하는 방법

이 방법은 세포주에서 PRC2 매개 염색질 도메인의 형성을 따르도록 설계되었으며, 이 방법은 다른 많은 시스템에 적응될 수 있다.

크로마틴 도메인의 드 노보 형성을 연구하는 방법

게놈 전반에 걸친 단백질 결합 위치의 정확한 결정은 유전자 조절을 이해하는 데 중요합니다. 여기서는 외핵증 소화(ChIP-exo)를 사용한 크로마틴-면역침전DNA를 치료하는 게놈 매핑 방법을 설명하고 있으며, 이어서 고처리량 시퀀싱을 한다. 이 방법은 포유류 뉴런에서 근거리 쌍 매핑 해상도 및 높은 신호 대 잡음 비와 단백질 DNA 상호 작용을 검출합니다.

크롬 마틴 면역 침전 -엑소뉴클레아제 (ChIP-Exo)를 사용하여 마우스 줄기 세포 유래 뉴런에서 단백질 DNA 상호 작용의 고해상도 매핑

이 프로토콜은 초기 인핸서 전사체를 정량화하기 위한 간소화된 계산 파이프라인을 제공합니다. 염색질 접근성, 염색질 특징 및 전사 데이터를 통합함으로써 복잡한 유전자 내 영역에서 인핸서 활성에 대한 정확한 검출 및 가닥 특이적 분석을 가능하게 하는 동시에 광범위한 생물정보학 교육 없이도 연구자가 접근할 수 있습니다.

마우스 배아 줄기 세포에서 유전자 간/유전자 내 인핸서 RNA 정량화를 위한 계산 파이프라인

여기서는 30 μL 벌레 펠릿만을 사용하여 L4 단계 Caenorhabditis elegans 전체충에 구현할 수 있는 빠르고 간단한 ATAC-seq 프로토콜을 제시합니다.

Caenorhabditis Elegans L4 유충 전체에서의 염색질 접근성 프로파일링

배우세요 Xenopus 태아에서 ChIP-Seq을 이용한 염색질 레귤레이터의 게놈 전체 위치 결정 방법입니다. 이 프로토콜은 초기 배아 발달 중 유전자 발현 조절 메커니즘을 연구하는 데 활용됩니다.

염색질 레귤레이터 및 미국에서의 게놈 전체의 스냅 샷

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