쥐 뇌 조직 검사 정렬 형광 활성 셀을 사용하여 셀 타입 별 유전자 발현

본 절차의 전반적인 목적은 이후 분석을 위해 뇌 조직으로부터 개별 신경 세포 유형을 분리하는 것입니다. 이는 먼저 신경 조직을 단일 세포 현탁액으로 해리함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계에서는 현탁액에서 미엘린을 제거한 후, 세포 유형 특이적 항체로 세포를 염색합니다.

마지막 단계에서는 유세포 분석법(flow cytometry)을 통해 개별 세포 집단을 분리합니다. 궁극적으로 이러한 세포 유형 특이적 분리 방법은 사용자가 특정 세포 유형에 따른 유전자 또는 단백질 발현의 변화나 후성유전학적 변형을 분석할 수 있게 해줍니다. 이 방법은 뇌의 세포 유형 특이적 메커니즘을 더 잘 이해하기 위해 어떤 세포 유형이 특정 수용체를 발현하는지, 어떤 세포 유형이 특정 단백질을 발현하는지, 그리고 어떤 세포 유형이 특정 후성유전학적 변형을 나타내는지와 같은 신경과학 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

멸균된 면도날을 사용하여 성체 뇌 조직에서 채취한 각 샘플을 6-웰 배양 플레이트 뚜껑 위에서 30~400 mg의 작은 조각으로 다져 신경 해리를 시작합니다. 그런 다음 조직을 1 mL의 칼슘 및 마그네슘 제거 HBSS에 담그고, 모든 조직이 수집되면 피펫을 사용하여 샘플을 멸균된 2 mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 샘플을 원심분리하고 상층액을 흡입하여 제거합니다.

따뜻한 효소 1,900 µL를 첨가합니다. 이를 혼합한 후 샘플을 15분 동안 배양합니다. 37 °C 항온수조에서 5분마다 튜브를 여러 번 뒤집어 가라앉은 조직 조각들을 재부유시킵니다.

배양 종료 후, 갓 준비한 효소 30 µL를 첨가하십시오. 각 샘플에 두 번씩 섞어준 뒤 튜브를 부드럽게 반전시킵니다. 그런 다음 1번으로 표시된 페스팁 파이펫을 사용하여, 각 샘플을 30회 상하로 파이펫팅하여 분리하십시오.

기포가 생성되지 않도록 주의하십시오. 샘플을 37 °C에서 15분 동안 더 배양하며, 5분마다 도립 혼합해 줍니다. 그 다음, 시연한 바와 같이 2번 페스트 피펫(pest pipette)을 사용하여 샘플을 해리시킵니다.

그 다음 3번 피펫으로 교체하여 해리를 반복하고, 샘플을 10분 더 배양합니다. 배양 종료 시까지 5분마다 도립 혼합하며 항온수조에서 배양한 후, 단일 세포 현탁액을 80 $\mu$m 세포 스트레이너를 통해 15 mL Falcon 튜브에 여과합니다. 각 스트레이너를 10 mL의 칼슘 및 마그네슘 제거 HBSS로 세척하여 효소 반응을 중단시키고, 마지막 샘플의 여과가 완료되면 튜브를 원심 분리한 후 상층액을 흡입하여 세포로부터 마이엘린을 제거합니다.

펠릿을 400 µL의 myelin removal buffer에 완전히 재현탁하고, 각 튜브에 적절한 양의 myelin removal beads를 첨가합니다. 세포와 비드가 충분히 섞일 때까지 용액을 피펫팅합니다. 그런 다음 시료를 4 °C에서 15분 동안 배양합니다.

배양 후, 세포를 회전시키는 동안 각 샘플을 5 mL의 myelin removal buffer로 세척합니다. 자성 분리기의 자기장 내에 샘플당 하나의 컬럼을 배치하고, 각 컬럼 상단에 깨끗한 80 µm 필터를 올립니다. 각 필터와 컬럼을 1 mL의 myelin removal buffer로 3회 헹구어 내며, 모든 통과액은 폐기물 용기에 수집합니다. 마지막 헹굼 단계 후에, 용출액을 수집하기 위해 각 컬럼 바로 아래에 5 mL 폴리스티렌 라운드 바텀 튜브를 배치합니다.

그 다음 샘플에서 상층액을 흡입하여 제거하고, 펠릿을 500 µL의 myelin removal buffer에 재부유시킵니다. 세포 현탁액을 즉시 컬럼에 도포하여 아래 튜브에 세포를 수집합니다. 그런 후 각 필터와 컬럼을 1 mL의 myelin removal buffer로 4회 세척합니다.

마지막 세척 후, 세포를 원심 분리하고 상층액을 흡입하여 유세포 분석 정렬을 위한 세포 염색을 준비합니다. 각 샘플을 약 2초간 볼텍싱하여 펠렛을 분산시킨 후, 각 튜브에서 1 µL의 세포를 개별 튜브로 옮깁니다. 염색 대조군을 포함하여 각 튜브에 즉시 5 µL의 FC block을 첨가합니다.

그런 다음 샘플을 다시 볼텍싱하고 4 °C에서 배양합니다. 5분 후, 적절한 1차 항체 칵테일 100 µL를 첨가합니다. 항체가 빛에 노출되지 않도록 튜브를 덮고 4 °C에서 20분 동안 세포를 배양합니다.

배양이 끝나면 샘플을 2 mL의 세척 완충액으로 세척한 다음, 상층액을 흡입하여 제거하고 각 샘플에 적절한 2차 항체 100 µL를 분주합니다. 튜브의 뚜껑을 닫고 4 °C에서 15분 동안 보관합니다. 그런 다음 샘플을 2 mL의 세척 완충액으로 세척하고 원심분리한 후, 상층액을 흡입하여 제거합니다.

상층액 제거 후, 펠렛을 250 µL의 멸균 PBS에 재현탁하고 세포를 분리합니다. 여기 단일 수컷 해마에서 유세포 분석으로 분리된 신경 세포군들의 대표적인 결과가 나타나 있습니다. 세포는 먼저 전방 산란광(forward scatter)과 측방 산란광(side scatter) 특성을 기반으로 모든 가능한 이벤트에서 게이팅되었습니다. 다음으로, 개별 세포 유형의 정확한 분리를 위해 크기를 기준으로 단일 세포(singlets)를 이중 세포(doublets)나 더 큰 세포 덩어리로부터 게이팅하였습니다. 이후 단일 세포를 CD 11B 양성 및 CD 11B 음성 세포군으로 분리하였으며, CD 11B 음성 세포를 다시 GFAP 양성 및 TH 양성 세포로 추가 분리하였습니다. 그다음 분석 프로그램을 사용하여 각 세포군의 총 이벤트 수와 모집단 대비 백분율을 결정함으로써 분리된 세포의 순도를 확인하였습니다.

본 예시에서는 real-time PCR을 통해 세포 유형 특이적 대체 유전자들의 상대적 유전자 발현을 분석하였습니다. 예상대로, 이 데이터는 분리된 세포의 순도를 확인시켜 주었을 뿐만 아니라, 조사 대상인 뇌 영역 간의 흥미로운 차이점들을 확인해 주었습니다. 분리 순도가 확인된 후에는, 관심 있는 다른 유전자들의 발현량을 측정하여 해당 유전자들이 어떤 특정 세포 유형에서 발현되는지, 또는 처리에 따라 특정 세포 유형에서 발현이 변화하는지 여부를 결정할 수 있습니다.

예를 들어, 여기서는 해마와 소뇌의 뉴런을 식별하는 데 자주 사용되는 칼슘 결합 단백질인 cow binding의 발현을 조사하였습니다. 이 영상을 시청한 후에는 적절한 세포 표면 항체를 사용하여 여기에 제시된 신경 세포와 같이 관심 있는 특정 신경 세포 유형을 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.