쥐 뇌 조직 검사 정렬 형광 활성 셀을 사용하여 셀 타입 별 유전자 발현
May 28th, 2015
이 프로토콜의 목표는 형광 활성화 세포 분류(FACS) 기술을 사용하여 세포 유형별 유전자 발현, 후성유전학적 마커 및/또는 단백질 발현의 후속 분석을 위해 특정 유형의 신경 세포를 분류하는 것입니다.
이 절차의 전반적인 목표는 후속 분석을 위해 뇌 조직에서 개별 신경 세포 유형을 분리하는 것입니다. 이것은 먼저 신경 조직을 단일 세포 현탁액으로 해리함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계에서는 현탁액에서 미엘린을 제거한 다음 세포 유형 특이적 항체를 위해 세포를 염색합니다.
마지막 단계에서는 개별 세포 집단을 유세포 분석에 따라 분류합니다. 궁극적으로, 이 세포 유형 특이적 분리 방법을 통해 사용자는 세포 유형별 방식으로 유전자 또는 단백질 발현의 변화 또는 후성유전학적 변형을 분석할 수 있습니다. 이 방법은 어떤 세포 유형이 특정 수용체를 발현하는지, 어떤 단백질을 발현하는지, 어떤 세포 유형이 특정 후성유전학적 변형을 발현하는지와 같은 신경 과학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으므로 뇌의 세포 유형 특정 메커니즘을 더 잘 이해할 수 있습니다.
멸균 면도날을 사용하여 성인 뇌 조직에서 채취한 각 샘플을 30-400밀리그램의 작은 조각으로 깍둑썰기하여 6개의 웰 배양 플레이트의 뚜껑에 올려 신경 해리를 시작합니다. 그런 다음 조직을 칼슘 및 마그네슘이 없는 HBSS 1ml에 담그고 모든 조직을 채취한 후 피펫을 사용하여 샘플을 멸균 2ml 원심분리 튜브로 옮깁니다. 샘플을 원심분리하고 상층액을 흡인합니다.
1, 900 마이크로 리터의 따뜻한 효소를 첨가하십시오. 하나를 섞어 15분 동안 샘플을 배양합니다. 섭씨 37도의 수조에서 5분마다 여러 번 튜브를 뒤집어 침전된 조직 조각을 다시 부유시킵니다.
배양이 끝나면 갓 준비한 효소 30마이크로리터를 추가합니다. 각 샘플에 2개를 섞고 튜브를 부드럽게 뒤집습니다. 그런 다음 one이라고 표시된 해충 피펫을 사용하여 각 샘플을 30번의 상하 반복으로 해리합니다.
거품이 생성되지 않도록 주의하십시오. 섭씨 37도에서 5분마다 반전으로 샘플을 15분 더 배양한 다음 해충 피펫으로 샘플을 해리합니다. 두 번째는 방금 보여드린 것처럼 말입니다.
그런 다음 3번 피펫으로 전환하고 해리를 반복하고 샘플을 10분 더 배양합니다. 배양이 끝날 때 5분마다 반전이 있는 수조에서 단일 세포 현탁액을 80미크론 세포 여과기를 통해 15ml Falcon 튜브로 여과합니다. 마지막 샘플이 여과되었을 때 효소 반응을 중지하기 위해 10ml의 칼슘 및 마그네슘이 없는 HBSS로 각 여과기를 세척한 다음 튜브를 스핀다운하고 상층액을 흡인하여 세포에서 미엘린을 고갈시킵니다.
현탁액은 400마이크로리터의 미엘린 제거 완충액에 펠릿을 완전히 재현탁시키고 각 튜브에 적절한 양의 미엘린 제거 비드를 추가합니다. 세포와 비드가 완전히 혼합될 때까지 용액을 위아래로 피펫팅합니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 15분 동안 샘플을 배양합니다.
배양 후 세포가 회전하는 동안 5ml의 미엘린 제거 버퍼로 각 샘플을 세척한 후 각 샘플에 대해 하나의 컬럼을 자기 분류기의 자기장에 놓고 각 컬럼 위에 깨끗한 80미크론 필터를 놓습니다. 각 필터와 컬럼을 1ml의 미엘린 제거 버퍼로 세 번 헹구고 모든 흐름을 폐기물 용기에 수집합니다. 최종 헹굼 후 각 컬럼 바로 아래에 5ml의 폴리스티렌 원형 바닥 튜브를 배치하여 용리액을 수집합니다.
그런 다음 샘플에서 명명된 슈퍼를 흡인하고 펠릿을 500마이크로리터의 미엘린 제거 완충액에 재현탁합니다. 즉시 세포 현탁액을 컬럼에 적용하여 아래 튜브에 세포를 수집합니다. 그런 다음 각 필터와 컬럼을 1ml의 미엘린 제거제, 세척당 완충액으로 4번 헹굽니다.
마지막 세척 후, 세포를 스핀다운하고 상층액을 흡인하여 유세포 분석으로 분류하기 위해 세포를 염색합니다. 각 샘플을 약 2초 동안 소용돌이치게 하여 펠릿을 해리하고 각 튜브에서 1마이크로리터의 세포를 개별 튜브로 이동합니다. 염색 대조군의 경우, 염색 대조군을 포함하여 각 튜브에 5마이크로리터의 FC 블록을 즉시 첨가하십시오.
그런 다음 샘플을 다시 와류로 가열하고 섭씨 4도에서 배양합니다. 5분 후, 적절한 1차 항체 칵테일 100마이크로리터를 추가합니다. 항체를 빛으로부터 보호하기 위해 튜브를 덮고 섭씨 4도에서 20분 동안 세포를 배양합니다.
배양이 끝나면 2ml의 세척 버퍼로 샘플을 세척한 다음 상등액을 흡인하고 각 샘플에 적절한 2차 항체 100마이크로리터로 라벨을 붙입니다. 튜브를 덮고 섭씨 4도에서 15분 동안 놓습니다. 그런 다음 2 밀리리터의 세척 버퍼로 샘플을 세척하고 샘플을 원심 분리 한 다음 흡입합니다.
상등액 Resus, 250 마이크로 리터의 멸균 PBS에 펠릿을 현탁시키고 여기에 세포를 분류합니다 단일 남성 해마의 신경 세포 집단을 대표 흐름으로 분류하면 세포가 전방 및 측면 산란 특성에 따라 가능한 모든 이벤트에서 먼저 게이트되었습니다. 다음으로, 개별 세포 유형의 정확한 분류를 허용하기 위해 단일 세포 또는 단일 세포를 크기에 따라 임의의 이중선 또는 더 큰 세포 덩어리로부터 게이트하고, 단일 세포를 CD 11, B 양성 및 CD 11 B 음성 세포 집단으로 분류하고, CD 11 B 음성 세포를 GT 1 및 TH 1 양성 세포로 추가 분류했습니다. 그런 다음 분석 프로그램을 사용하여 각 집단의 총 이벤트 수와 부모 집단의 백분율을 결정하여 분류된 세포의 순도를 확인했습니다.
이 특정 예에서, 대체 세포 유형 특이적 유전자의 상대적 유전자 발현은 실시간 PCR에 의해 분석되었습니다. 예상대로 이러한 데이터는 분류된 세포의 순도를 확인했을 뿐만 아니라 조사된 뇌 영역 전반에 걸쳐 몇 가지 흥미로운 차이점을 식별했습니다. 종류의 순도를 확인한 후, 다른 관심 유전자의 발현을 측정하여 이들이 발현되는 특정 세포 유형 또는 세포 유형 특이적 방식으로 처리 후 발현이 변경되는지 여부를 결정할 수 있습니다.
예를 들어, 여기에서는 해마와 소뇌의 뉴런을 식별하는 데 자주 사용되는 칼슘 결합 단백질인 암소 결합의 발현을 조사했습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 적절한 세포 표면 항체를 사용하여 여기에 표시된 신경 세포와 같은 특정 관심 신경 세포 유형을 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
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개요
이 프로토콜은 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 사용하여 뇌 조직에서 특정 유형의 신경 세포를 분리하는 방법을 설명합니다. 이 절차는 세포 유형별 유전자 발현, 후성 유전 마커 및 단백질 발현의 후속 분석을 가능하게 합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 세포 생물학
- 유전자 발현 분석
배경
- 신경 세포 유형의 분리는 뇌 메커니즘을 이해하는 데 중요합니다.
- 세포 유형별 분석은 수용체 및 단백질 발현의 차이를 밝힐 수 있습니다.
- FACS는 개별 세포 집단의 정확한 분류를 가능하게 합니다.
- 이 방법은 신경 세포의 후성 유전 변형 연구를 돕습니다.
연구 목적
- 세부 분석을 위해 개별 신경 세포 유형을 분리합니다.
- 특정 세포 집단의 유전자 및 단백질 발현을 조사합니다.
- 뇌의 세포 유형별 메커니즘에 대한 이해를 향상시킵니다.
사용된 방법
- 신경 조직을 단일 세포 현탁액으로 분리합니다.
- 세포 현탁액에서 미엘린을 제거합니다.
- 세포 유형별 항체로 세포를 염색합니다.
- 유동 세포 분석을 사용하여 개별 세포 집단을 분류합니다.
주요 결과
- 뚜렷한 신경 세포 유형의 성공적인 분리.
- 세포 유형별 유전자 발현 변화를 분석하는 능력.
- 특정 수용체 및 단백질을 발현하는 세포 유형의 식별.
- 다양한 신경 집단에서 후성 유전 변형에 대한 통찰.
결론
- FACS 기술은 신경 세포 유형을 분리하는 데 효과적입니다.
- 이 방법은 세포 유형별 메커니즘을 연구하기 위한 기반을 제공합니다.
- 미래 연구는 이 접근 방식을 활용하여 다양한 신경 과학 질문을 탐구할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Understanding cell-type-specific mechanisms in the brain is critical for de-risking target validation in neuroscience drug discovery. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) enables precise isolation of neural populations, supporting mechanistic de-risking by linking gene expression changes to specific cell types. This approach enhances predictive confidence in target selection by revealing cell-type-specific expression patterns that may be masked in whole-tissue analyses.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by determining which neural cell types express specific receptors, proteins, or epigenetic markers.
- Operational Value: Enables biological de-risking through direct measurement of target engagement in defined cell populations.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying cell-type-specific expression patterns that inform target prioritization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated neural cell populations for downstream screening of compounds affecting gene or protein expression.
- Operational Value: Standardizes input material for assays, improving reproducibility and reducing variability in readouts.
- Scalability: Enables platform reuse across multiple targets and brain regions through consistent cell isolation workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance by preserving cell-type-specific epigenetic and expression profiles from discovery through validation.
- Operational Value: Provides quantitative, sortable outputs that align with translational biomarker strategies.
- Risk Mitigation: Supports risk-adjusted advancement decisions by confirming target expression in relevant human-equivalent cell types.
Pipeline & Workflow Integration
FACS integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, enabling cell-type-specific readouts that inform go/no-go decisions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating cell types to assess target expression and pathway activity.
- Screening: Delivers purified cell populations for assay readiness, ensuring consistent compound evaluation.
- Analytics: Generates quantitative data on gene, protein, and epigenetic expression for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity through preserved cell-type-specific molecular profiles.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation capability applicable across multiple neuroscience projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility of neural cell preparations.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency in early discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on cell-type-specific target validation data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neural tissue dissociation, flow cytometry, and antibody panel design.
- Depends on access to cell sorters, centrifugation equipment, and myelin removal reagents.
- Necessitates cross-team standardization of staining protocols and gating strategies.
- Involves adaptation considerations for different brain regions and cell surface markers.
- Limited by tissue availability and viability constraints during enzymatic dissociation.
