Name: 면역 결핍 마우스의 구인두 칸디다증의 Th17 염증 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: 학습하세요 면역 결핍 마우스에 Th17 세포를 주입하고 Candida albicans를 경구 감염시켜 구인두 염증 모델을 구축하는 방법을. 유세포 분석과 면역조직화학을 통해 염증 반응을 평가하여 경구 면역치료 연구에 활용할 수 있습니다.

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유세포 분석기를 사용할 수 있게 해주신 Dr. Helene Bernstein에게 감사드립니다. 또한 유세포 분석 서비스에 대해 CFAR 유세포 분석 시설에 감사드립니다. 이 프로젝트는 CTSC 핵심 활용 기금과 PP에 대한 STERIS Corporation/University Hospitals-Division of Infectious diseases 보조금의 일부 지원을 받았습니다.

참고 : 마우스를 사용하여 실험 기관 동물 복지위원회 (IACUC) 가이드 라인에 따라 실시 하였다. (감염에 세 가지 일 이전) I N 체외 배양 된 Th17 세포와 마우스 - / - 1. 헝겊-1을 재구성 <ol><li> 수용성의 존재에 혼자 U-바닥 96 웰 플레이트, 또는 3 × 104 CD4 + CD25 + Foxp3의 + Tregs과 함께 공동 문화를에서 Th17 세포, 문화 CD4 + CD44low CD62Lhigh CD25- 나이브 T 세포 (× 104 3) 수립 α-CD3 (1 ㎍ / ㎖) α-CD28 (2 ㎍ / ㎖) Th17 조건 하에서 항체 및 항원 제시 세포 (IL-6 (25 NG / ㎖), TGF-의 β를 이용하여 편광 (이 NG / ㎖) , α-IFN-γ (2 ㎍ / ml) 및 α -IL-4 (2 ㎍ / ㎖)) 3~4일 대. 참고 : 나이브 세포와 T의, 규정 정렬 형광 활성화 된 셀을 사용하여 정렬 된 (FACS)자기 세포 분리 절차 D 배양 앞서 설명한 바와 같이 19-22. </li><li> 4 일에, 피펫을 사용하여 Th17 세포를 재 부유 한 후, 문화에서 그들을 수집하고, 멸균 조건을 원심 분리기. <ol><li> 자신의 생존과 표현형에 대한 검사 이러한 세포의 작은 나누어지는 가져 가라. 요오드화 프로피 듐 (중에는 200ng / ㎖)를 첨가하고, 유세포 분류법으로 즉시 평가 생존, R​​PMI 배지 500 μL에이를 재현 탁. restimulation 후 IL-17A 생산의 평가 유동 세포 계측법에 의해 표현형을 수행합니다 (6.3 절 참조). </li></ol></li><li> 달리 명시하지 않는 한 모든 원심 분리 단계에서 39 ° C에서 6 분 동안 480 XG에 멸균 PBS에서 세포 주 벌크 씻는다. </li><li> 6~8주 된 CD45.2 Rag1에 입양 전송을 위해 이러한 세포를 사용하여 - / - 면역 결핍 쥐. <ol><li> 찬 멸균 PBS를 사용하여 1 × 10 7 세포 / ㎖의 세포 밀도로 세포를 재현 탁. </li><li> intrap에 의한 세포의 100 μl를 주입eritoneal 주사 한 마우스가 1 × 10 6 세포를 수신하도록, 1 ㎖의 투베르쿨린 주사기에 25 G 바늘을 사용. 일부 마우스는 PBS 또는 Th17 세포를 받게됩니다, 다른 마우스는 TREG 세포와 공동 배양 Th17 세포를 받게됩니다. 참고 : 무균 모든 단계를 수행합니다. </li></ol></li></ol> 2. C. 성장 감염 알비 칸스 (일일 감염 이전에) <ol><li> 접종 전에 CAF2-1 C. 다섯 식민지를 분산 알비 칸스 실험실 멸균 PBS 현탁액 100 ㎕의 변형 및 멸균 국물에 서스펜션을 추가합니다. </li><li> C. 5 식민지를 접종 효모 질소 염기의 50 ㎖에 칸디다 알비 칸스 (아미노산없이 YNB) / 펩톤 / 덱 스트로스 브로 쓰 배지 및 130 rpm에서 15 내지 18 시간 동안 30 ℃에서 진탕 배양기에서 배양한다. </li><li> 즉, 균류의 성장을 표시 한, 백탁 국물 용 모니터. </li></ol> 3. 칸디다수확과 (감염의 날) 계수 절차 <ol><li> 15 ml의 튜브에 칸디다 균 배지 10 ㎖를 수집합니다. 큰 볼륨의 경우, 50 ㎖ 튜브에 칸디다를 수집합니다. </li><li> 달리 명시하지 않는 한 모든 단계에서 RT에서 5 분 동안 1,900 XG에 blastospores 원심 분리기. 상등액을 제거하여 원심 분리를 blastospores 펠렛. </li><li> 하나 이상의 튜브가있는 경우, 펠릿 멸균 PBS를 첨가 다중 튜브의 칸디다 blastospores 수영장 카운팅 및 PBS 10 ㎖로 재현 탁 그들을. </li><li> 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 blastospores의 20 μl를 타고 배 파라 포름 알데히드의 20 μl를 추가하고 15 ~ 20 분 동안 실온에서 품어. 현미경으로 혈구를 사용하여 고정 blastospores를 계산합니다. 참고 : 파라 포름 알데히드는 발암입니다. 만 흄 후드의 원액을 엽니 다. </li><li> 한편, t를 원심 분리하여, 두 번 이상 반복 세척 blastosporesPBS에서 밑단하고 blastospores을 펠렛. 감염에 대한 준비, ABSL1 후드, RT에서 15 ml의 튜브에 펠릿을 유지합니다. </li><li> 감염 blastospores을 재 부유에 대한 RT에서 일부 멸균 PBS를 남겨주세요. </li><li> 카운팅 한 후, 효모 세포 / ml의 X10이 8 blastospore 효모의 세포 수를 조정할 blastospore 펠렛을 멸균 PBS를 추가한다. 이는 쥐를 감염 사용될 blastospore 현탁액이다. 참고 : 무균 모든 단계를 수행합니다. </li></ol> 4. 마우스 감염 (셀 전송 후 3 ~ 5 일) 주 : 앞서 설명 된 바와 같이 19,23-25 ​​기본적인 감염 과정이 수행된다. <ol><li> - / - PBS 3 일 이전에 세포를받은 쥐 헝겊-1의 무게. </li><li> 자신의 체중을 이용하여 마취제의 용량을 계산합니다. INTR에 의해, 1 ㎖의 투베르쿨린 주사기에 25 G 바늘을 사용하여, 케타민 / 자일 라진 (xylazine)의 혼합물 (16.1 ㎎ / ㎖ 및 1.6 ㎎ / ㎖)을 투여하여 쥐를 마취aperitoneal 주입. <ol><li> 체중 10g 당 50 μL를 관리. (즉, 케타민 0.8 mg의 체중의 자일 라진 / 10g 또는 0.08 mg의 케타민과 80 mg의 체중 kg 당 자일 라진 8 mg을 각각). 발가락 핀치 응답을 마취 후 매 15 분을 준수하십시오. 참고 :이 투여 량은 감염 과정에 대한 충분한 마취의 60 ~ 90 분을 유도 할 것이다. </li><li> 건조로부터 각막을 방지하기 위해 마우스의 눈 안과 윤활유 연고를 적용합니다. 눈의 윤활유가 건조 수있는 바와 같이, 안과 윤활마다 45 분을 반복합니다. </li></ol></li><li> 마취 중 마우스의 재수 화를 돕기 위해 앞다리 피하 후면에 인접한 식염수 (0.9 %의 NaCl) 1ml를 주입한다. </li><li> 새로운, 깨끗한 케이지를 얻습니다. 일단 감염 새로운 케이지에 각 마우스를 배치, 한 번에 감염 절차를 하나의 마우스를 따르십시오. 제 PBS / 가짜 감염을 수행 한 다음 칸디다 감염 촉진제로 진행업. </li><li> 마취 마우스를 들고 혀의 기지를 공개하는 넓은 입을 엽니 다. <ol><li> 설하 90 분 동안 구강, PBS 또는 blastospore 현탁액 50 μL로 포화 3mm 직경 목화 공을 놓습니다. 코튼 볼이 움직이지 않는 것을 보장, 폐 울혈을 방지하기 위해 다시 쥐에게 15 분마다 전면 플립합니다. </li></ol></li><li> 구강에 가짜 또는 칸디다 균 접종 90 분을 보장하기 위해 모든 마우스에 대한 타이머를 설정합니다. </li><li> 가열 램프 (4피트 거리)에서 케이지, 열 젤 패드에 각 마우스에 보관하십시오. </li><li> 혀는 혀를 lacerating 치아를 방지하기 위해 치아 내부와 멀리 철회되어 있는지 확인합니다. </li><li> 90 분의 끝에서 마우스의 입에서 면봉을 제거한다. 75분보다 빨리 마​​취에서 회복 수있는 마우스 시계. 이러한 경우에, 단지 케타민 (40 ㎎ / kg)으로 다시 마취. </li></ol> 5. 포스트 Procedur전자 (90 분 마취시) 모니터링 <ol><li> 90 분 마취 중 열 젤 패드를 사용합니다. <ol><li> 체온을 유지하고 질식을 방지하기 위하여, 생쥐는 보통 옥수수 냉이 마우스 침구에 복구 할 수 없다. </li></ol></li><li> 마취에서 회복 한 후, 뒷면에 두 개의 위치에 멸균 0.9 % 염화나트륨 피하의 추가 1 ml에 관리 할 수​​ 있습니다. </li><li> 다섯 PBS (가짜) 케이지 당 접종 한 마우스에 계속. 케이지 당 하우스 만 1-2 감염된 쥐. </li><li> 습관과 전반적인 건강을 정리, 체중의 변화를주의하는 것이 시술 후 매일 이니셜 절차 카드를 작성합니다. </li></ol> 6. 염증 평가 6.1) 체중 감소 <ol><li> 감염 절차 이전에 하루에 시작, 감염 동안 매일 마우스의 무게를. 참고 : 일반적으로, Th17 세포없이 T의, 규정에 주입 된 면역 결핍 마우스 (20)에 굴복인해 -30 %의 중량 손실은 19 진균 부담 증가 및 염증을 악화. </li></ol> 혀의 6.2) 조직학 득점 <ol><li> 자궁 경부 전위 다음 CO 2 질식하여 쥐를 희생. </li><li> 턱을 열고 가위와 집게로 혀를 해부하다. 혀를 잡아 무딘 집게를 사용하고, 가위 입의 뒤쪽으로 다가 사용하는 혀의 뒤쪽 끝을 절개. </li><li> 면역 세포 화학 헤 마톡 실린 및 에오신 혀 조직의 (H &amp; E) 염색의 경우, 얼음 차가운 PBS와 혀의 조직을 씻어. 15 ml의 튜브 / N을 2-3 방언을 10 % 포르말린 5 mL를 추가하고 O를 수정. <ol><li> 다음날, 포르말린을 제거하고, 하이퍼 고정을 방지하기 위해 70 % 에탄올 5 ml의 조직 몰입. 단면 및 파라핀 섹션의 염색, 파라핀 삽입을 계속 상용 서비스로 보내십시오. 참고 : 상업 조직학 서비스는 다음 단계를 수행하는 데 사용됩니다. </리&gt; </ol></li><li> 슬라이드 다시 상업 조직학 서비스에서 일단, 학년 광학 현미경 조직 절편을 관찰하여 염증. <ol><li> 0은 염증 되 않으며, 5 가장 심한 염증 인 상태 0-5 점수. 표 1을 사용하여 염증 점수. </li></ol></li></ol> Th17 세포에 의해 6.3) 사이토킨 생성 참고 : 과도한 TNF-α 생산은 과도한 면역 병리의 판독 중 하나입니다. 마우스를 적응 적 Th17 세포 만 전송되면, 그것은 Th17 세포에서 과도한 TNF-α의 생산과 관련된 면역 병리 발생된다. <ol><li> 전술 한 방법을 사용하여 비장 19,26, 경부 림프절, 겨드랑 lymphnodes, 혀에서 단일 세포 현탁액을 수집. </li><li> Brefeldin A (10 ㎍ / ㎖)으로 4 시간 동안 포르 볼 미리 스테이트 아세테이트 (PMA) (50 NG / ml) 및 이오 노마 이신 (500 NG / ㎖)와 함께 세포를 Restimulate는 L 첨가대서양 표준시 2 시간. PBS로 세포를 세척하고 제조업체의 지침에 따라 상용 고정 / 투과성으로 키트를 사용하여 고정한다. </li><li> 앞서 설명한 바와 같이 19를 형광 접합 된 항 TNF-α, IL-항 17a 및 ROR - γt 항체를 이용하여 세포 내 사이토 카인 염색법을 수행한다. </li><li> / ml의 최종 농도 3 μg의 - 간단히, 항 TNF-α, IL-항 17a 및 ROR - γt 항체, 각각의 AT (2) 항체의 칵테일 (1X)의 투과성으로 버퍼에 세포를 재현 탁. </li><li> RT에서 1 시간 동안 세포를 배양한다. </li><li> 배양 후, 1X의 투과성으로 버퍼로 세포를 씻어. </li><li> 유세포 분석을 0.5 % 소 혈청 알부민 500 μl의 PBS에서 세포 펠렛을 재현 탁. </li></ol>

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</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

이 모델은 경구 C. 유도에 기초 알비 칸스 (Candida albicans) 감염 따라 Th17 염증. 때문에 T의, 규정의 부재로, Th17 세포에 의한 염증은 무제한이며 제대로 해결 면역 병리로 연결됩니다. 시험관이 Th17 세포가 입양 전송에 사용했다 편광 순진한 CD4 세포를 유도. 40 - 배양 된 CD4 + 세포의 50 %가 약 3 일 검출 가능한 IL-17A 식 (Th17 세포)를 보여 주며, 따라서 마우스에서 주사에 사용 하였다. 모델의 주요 이점은 Th17 세포가 효율적으로 T의 레지 주입으로 개선 될 수있는 특정 면역 병리 감염을 야기한다는 것이다. 따라서 모델은 양성 대조군으로 T의 레지 분사 면역 전략을 시험하기 위해 사용될 수있다. 염증은 쉽게 감염 마우스의 Th17 세포에 의한 체중 감소, 조직 병리학 점수 및 염증성 사이토킨 생성에 기초하여 평가된다. <p class="jove_cont...

구강 감염 및 염증은 암 및 심혈관 질환과 관련이 있으며 전반적인 인간 건강에 극적인 영향을 미칩니다2,3. C. albicans에 의한 기회감염 및 염증은 원발성 면역결핍증(PID)4,5, 치주염 6,7, 쇼그렌 증후군, 타액선 질환8,9과 같은 염증성 질환, 구강 편평세포암 10-12와 관련이 있습니다. C. albicans는 건강한 사람의 60%의 입에 무증상으로 서식하는 이형성 공생 균류이지만 숙주 방어가 약화될 때 감염을 일으키는 가장 흔한 진균 병원체입니다13-15. 이 질환은 AIDS 및 골반염 환자와 다른 면역 저하 환자에게 재발적이고 만성적인 감염 및 염증을 유발합니다. 공생체로서, 군집화 부하는 전체 구강 마이크로바이옴의 다양성 변화와 관련이 있습니다16. 병원체로서 급성 가성막질, 급성 위축성, 만성 위축성, 만성 비대/과형성 및 각구순염과 같은 여러 형태의 구인두 칸디다증을 유발합니다. 
C. albicans에 대한 보호는 숙주 면역 저항뿐만 아니라 칸디다 유도 면역 병리학을 적절하게 조절하는 능력에 의해 결정됩니다. C. albicans와 같은 공생동물은 다른 구강 염증 상태의 조절 및 악화에 기여하지만, 기회감염 중에 dysbiosis가 발생하는 메커니즘은 명확하지 않습니다. C. albicans17에 대한 기억 반응에서 적응 Th17 세포의 알려진 역할 외에도, 만성 감염 중 염증 병리의 시작 및 영속에서의 역할은 불분명합니다. 또한, 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome) 및 치주염(periodontitis)과 같은 구강 염증성 질환은 Th17 매개 병리학과 관련이 있습니다. 흥미롭게도 이러한 질병은 잦은 OPC와도 밀접한 관련이 있습니다. 그러나 Th17 세포 간의 상호 작용, OPC의 구강 면역 병리학 및 기타 구강 염증성 질환은 연구되지 않았습니다. 
구강 칸디다증의 1차 및 2차 감염에 대한 마우스 모델을 사용할 수 있지만, 특히 면역 결핍의 맥락에서 칸디다 감염과 관련된 Th17 염증을 연구하기 위한 마우스 모델은 사용할 수 없습니다. 이 연구는 마우스에서 구강 칸디다 감염과 관련된 구강 Th17 염증을 확립하는 방법을 제시합니다. 생쥐의 칸디다 감염은 곰팡이 병변, 혀의 염증, 음식 섭취 감소, 체중 감소 및 결국 빈사 상태가 특징입니다. 구강 병리학은 마우스 구강암 모델에서 상피 이형성증뿐만 아니라 만성 칸디드 감염 병변과 유사합니다12,18.

<table><tbody><tr><td>CAF-2</td><td>University of Pittsburgh (Sarah Gaffen)</td><td>-</td><td>칸디다 문화</td></tr><tr><td>U-bottom 96 웰 플레이트&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>055588</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>a-CD3에 사용됩니다.</td><td>eBiosciences</td><td>16-0031-85</td><td>Th17 조건 a-CD28에 대한 세포의 분극;</td></tr><tr><td></td><td>eBiosciences</td><td>16-0281-85</td><td>Th17 조건으로의 세포 편광</td></tr><tr><td>m-IL-6</td><td>Bio Basic</td><td>RC232</td><td>Th17 조건</td></tr><tr><td>h-TGF-b&nbsp로의</td> 세포 편광;<td>R& D</td><td>240-B</td><td>Th17 조건</td></tr><tr><td>a-IFN-g&nbsp에</td> 대한 세포의 분극;<td>eBiosciences</td><td>16-7311-85</td><td>Th17 조건</td></tr><tr><td>a-IL-4&nbsp에</td> 대한 세포의 분극;<td>eBiosciences</td><td>16-7041-85</td><td>Th17 조건으로의 세포 분극</td></tr><tr><td>&-IL17A ef660</td><td>eBiosciences</td><td>50-7177-82</td><td>세포 배양에 사용 - 1:50</td></tr><tr><td>&alpha;-TNFa-PE-Cy7</td><td>eBiosciences</td><td>25-7423-41</td><td>세포 배양에 사용 - 1:100</td></tr><tr><td>&alpha;-RORgt PE&nbsp;</td><td>eBiosciences</td><td>12-6981-82</td><td>세포 배양에 사용 - 1:50</td></tr><tr><td>YNB w/o 아미노산)/펩톤/덱스트로스 브로스 매체&nbsp;</td><td>바이오 베이직</td><td>S507. SIZE</td><td>칸디다 성장을 위한 메디움</td></tr><tr><td>셰이커 인큐베이터&nbsp;</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Innova 4300</td><td>칸디다</td></tr><tr><td>15 ml 튜브</td>용 배양 성장 <td>Bio Basic</td><td>BT888-SY</td><td>세포 배양 및 칸디다 성장에 사용</td></tr><tr><td>50 ml 튜브</td><td>Bio Basic</td><td>CT 788-YS</td><td>세포 배양 및 칸디다 성장에 사용</td></tr><tr><td>탁상용 원심분리기</td><td>VWR International LLC</td><td>82017-654</td><td>칸디다 펠릿화용 -900 g</td></tr><tr><td>Allegra 원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td>392302</td><td>세포 배양 - 480g</td></tr><tr><td>1.5ml 에펜도르프 튜브</td><td>Bio Basic</td><td>BT620-NS</td><td>칸디다의 최종 농도 준비</td></tr><tr><td>2x 파라포름알데히드</td><td>전자 현미경 과학</td><td>15710</td><td>계수용 칸디다 고정</td></tr><tr><td>혈구계</td><td>VWR International LLC</td><td>15170-172</td><td>셀</td></tr><tr><td>계수 PBS - 인산염 완충 식염수</td><td>바이오 베이직</td><td>PD8117</td><td>완충액</td></tr><tr><td>케타민/자일라진의 제조&nbsp;</td><td>Case Western Reserve University - 동물 자원 센터</td><td>-</td><td>ARC에서 승인한 마취</td></tr><tr><td>안과 윤활제 연고에 대한 프로토콜 획득&nbsp;</td><td>건조를 방지하기 위한 동물용</td> <td>Allergan-Eye</td><td></td> 연고</tr><tr><td>식염수 (0.9% NaCl)</td><td>G Biosciences</td><td>786-561</td><td>탈수 방지를 위해 동물에게 투여됨</td></tr><tr><td>3mm 직경의 솜털 공&nbsp;</td><td>VWR International LLC</td><td>BP7603</td><td>칸디다 감염용 3mm 공</td></tr><tr><td>히트 젤 패드</td><td>케이스 웨스턴 리저브 대학교 - 동물 자원 센터</td><td>-</td><td>체온 유지 및 빠른 회복을 위해</td></tr><tr><td>헤마톡실린과 에오신 염색</td><td>Histoserv - MD</td><td>-</td><td>조직 조직학</td></tr><tr><td>10% 포르말린&nbsp;</td><td>전자 현미경 과학</td><td>JC1111/MC</td><td>조직 조직학</td></tr><tr><td>70% 에탄올&nbsp;</td><td>VWR International LLC</td><td>97064-490</td><td>살균 목적</td></tr><tr><td>PMA - Phorbol 12-myristate 13-acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585-1MG</td><td>세포 복원</td></tr><tr><td>Ionomycin</td><td>Life Technologies</td><td>124222 1mg</td><td>세포 복원</td></tr><tr><td>고정 투과 가능성 키트</td><td>eBiosciences</td><td>E16913-106</td><td>유세포 분석</td></tr><tr><td>투베르쿨린 주사기용 고정 세포</td><td>BD Biosciences</td><td>309659</td><td>마우스 주입</td></tr><tr><td>25 G x 3/8 바늘</td><td>BD Biosciences</td><td>309626</td><td>마우스 주입</td></tr><tr><td>Rag1 -/- 마우스</td><td>Jackson laboratories</td><td>재고 번호: 002216</td><td>수령인 마우스</td></tr><tr><td>CD45.1 congenic 마우스</td><td>Jackson laboratories</td><td>재고 번호:002014&nbsp;</td><td>공여체 Th17 세포</td></tr><tr><td>CB17-SCID 마우스</td><td>잭슨 연구소</td><td>재고 번호: 001303</td><td>수혜자 마우스</td></tr><tr><td>Balb/c 마우스</td><td>잭슨 연구소</td><td>재고 번호: 000651</td><td>기증자 Th17 세포</td></tr></tbody></table>

면역 결핍 마우스의 구인두 칸디다증의 th17 염증 모델

Th17 Inflammation Model of Oropharyngeal Candidiasis in Immunodeficient Mice

구인두 칸디다증(OPC) 질환은 숙주 면역 저항이 부족할 뿐만 아니라 감염 유발 면역 병리학의 적절한 조절이 없기 때문에 발생합니다. Th17 세포는 항진균 방어와 관련이 있지만 면역 병리학에서 그 역할은 불분명합니다. 본 연구는 면역결핍 마우스에서 구강 칸디달 감염과 관련된 구강 Th17 면역병리학을 확립하는 방법을 제시한다. 이 방법은 시험관 배양된 Th17 세포로 림프구감소성 마우스를 재구성한 후 칸디다 알비칸스(C. albicans)로 경구 감염시키는 것을 기반으로 합니다. 결과는 억제되지 않은 Th17 세포가 염증 및 병리학을 유발하고 체중 감소, 전염증성 사이토카인 생성, 혀 조직 병리학 및 사망률을 포함한 여러 측정 가능한 판독과 관련이 있음을 보여주며, 이 모델이 OPC 면역병리학 연구에 유용할 수 있음을 보여줍니다. 조절 세포의 입양 전달(Tregs)은 염증 반응을 제어하고 감소시키며, 이 모델이 구강 염증에 대항하기 위한 새로운 전략을 테스트하는 데 사용될 수 있음을 보여줍니다. 이 모델은 다른 구강 질환의 맥락에서 일반적으로 구강 Th17 면역병리학을 연구하는 데에도 적용할 수 있습니다.

이 모델에서, 걸 레-1의 칸디다 -infected 마우스 및 감염되지 않은 쥐 모두 - / - 면역 결핍 배경이 적응 적 감염 3-5 일 전에 Th17 세포를 옮겼다. 10-12 마우스의 총 위장 감염이 각 그룹의 생쥐 및 칸디다 감염, 각 그룹에서 4-5으로, 실험에 사용 하였다. 주입 Th17 세포는 각각 (도 1a)을 Thy1.1 또는 CD45.1 염색법을 사용하여 생체 내에서 추적 된되도록 나이브 세포, CD45.1 congenic Thy1.1 또는 마우스로부터 유래 하였다. 공동 양도 된 T는, 규정 CD45.1 Th17 세포로부터 구별되도록 CD45.2 마우스로부터 유도 하였다. 일부 실험에서, CB-17 SCID Thy1.2받는 마우스는 Thy1.1을 Balb / C 마우스 및 congenic Thy1.2 마우스로부터 수득 된 T, 규정에 의한 Th17 공여체 ...

숙주 면역 저항을 연구하기 위해 칸디다 감염 모델을 사용할 수 있지만, 칸디다 감염과 관련하여 T 세포 매개 면역병리학을 연구하기 위한 모델은 없습니다. 여기에서는 면역결핍 마우스에서 구강 칸디다 감염과 관련된 Th17 면역병리학을 확립하는 방법을 설명합니다.

면역 결핍 마우스의 구인두 칸디다증의 Th17 염증 모델

Oropharyngeal Candidiasis (OPC) disease is caused not only due to the lack of host immune resistance, but also the absence of appropriate regulation of ...

이 절차의 전반적인 목표는 병리적 TH17 세포에 의해 매개되는 감염 의존성 구강 염증 모델을 개발하는 것입니다. 이는 먼저 면역결핍 생쥐에 TH17 세포를 주입함으로써 수행됩니다. 다음 단계로 Candida albicans 진균을 배양하고, 분생포자(blastospores)를 수집하여 PBS로 준비합니다.마지막 단계로, 주입된 th 17 세포의 증식을 유도하고 구강 염증을 일으키기 위해 마우스에 blasto 포자를 경구 투여합니다. 결과 분석을 위한 혀 조직의 유세포 분석 및 면역조직화학 분석 결과, TH 17이 주입된 마우스는 체중 감소와 혀 염증 증상을 보였습니다. 따라서 이 마우스 모델을 이용한 본 기술의 응용 가능성은 구강 면역 치료로 확장될 수 있습니다.TH 17 염증 모델은 다른 구강 질환의 맥락에서 TH 17 염증을 연구하는 데에도 사용될 수 있으며, 본 실험 절차는 저와 nitrogen vascular, 그리고 제 실험실의 post-structural fellow가 시연할 것입니다. 이 절차에서는 TH 17 세포 배양을 위해 FACS 정렬된 naive T 세포와 선택적으로 treg 세포가 필요합니다. CD4 양성, CD44 저발현, CD62L 고발현, CD25 음성인 naive T 세포를 UBO 96-well 플레이트에 웰당 30,000 cells씩 분주하고 TH 17 조건에서 3~4일 동안 배양합니다. 대조군으로, TH 17 세포를 생성하기 위해 동일한 배양 조건에서 30,000개의 CD4 양성, CD25 양성, FOX P3 양성 treg 세포를 naive T 세포와 함께 배양할 수 있습니다. 4일간의 배양 후, 피펫을 사용하여 TH 17 세포를 수집합니다.세포 생존력을 확인하기 위해 소량의 aliquot를 따로 보관합니다. 이 세포들을 0.5 mL의 RPMI에 부유시키고 100 ng의 propidium iodide를 첨가합니다. FACS 분석을 위해, 대부분의 세포를 수확하여 세포 주입 준비를 합니다.세포의 대부분을 PBS로 세척하고 원심분리한 후 마우스 주입을 위해 준비합니다. 차가운 PBS에 1mL당 1,000만 개의 세포가 되도록 농도를 맞춘 후, 25게이지 바늘을 사용하여 세포 현탁액 100 µL를 마우스의 복강 내에 주입합니다. 다른 마우스에는 PBS 또는 대조군 TH17 treg 공배양 세포를 주입합니다. 주입 3~5일 후의 전날에 마우스에 C. albicans를 감염시킬 계획을 세웁니다.마우스에 C albicans를 감염시키기 위해, CAF 2-1 실험실 균주 5개 콜로니를 100 µL의 멸균 PBS에 분산시킨 후, 이 현탁액을 20 mL의 멸균 배지에 첨가합니다. 접종된 배지를 30 °C에서 130 RPM으로 교반하며 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 배양액 10 mL를 15 mL 튜브에 수집한 후, 1900 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다.실온에서 펠릿에는 분생포자가 포함되어 있으며 상층액은 폐기해야 합니다. 수집된 모든 분생포자를 10 milliliters의 멸균 PBS에 모으고 20 microliter의 Eloqua를 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. Eloqua에 20 microliters의 two XPFA를 첨가하고 15~20분 동안 고정한 후, 고정 시간 동안 혈구계수기(hemo cytometer)를 사용하여 분생포자의 수를 측정합니다.PBS를 사용하여 blasto spores의 대부분을 최소 2회 더 세척합니다. 세포 수를 확인하기 전까지 blasto spore 펠렛을 AB SL one 후드 내의 상온에 보관합니다. 그 후 상온의 PBS를 사용하여 blasto spores를 200 million cells per milliliter 농도로 재현탁합니다.마우스에 감염시킬 수 있도록 세포를 준비 상태로 유지하십시오. 이 방법은 이전에 검토되었으나, 본 섹션에서 간략하게 다시 다루겠습니다. 먼저 마우스를 마취하고 마취 상태를 확인한 후 안연고를 도포하십시오.45분 후에 다시 도포해야 합니다. 다음으로 피하 주사를 실시합니다. 마우스를 한 마리씩 처리하며 수분 공급을 위해 생리식염수 1 mL를 주입하십시오.먼저 sham 그룹을 감염시킨 후 candida 그룹을 감염시킵니다. 50 µL의 PBS 또는 blasto spore 현탁액으로 적셔 직경 3 mm의 면봉 솜을 준비합니다. 그런 다음 혀 기저부에 접근하여 준비한 면봉 솜을 배치합니다.혀가 치아에 의해 찢어지지 않도록 안쪽으로 밀어 넣어 치아와 떨어지게 합니다. 그 다음 마우스를 가열 패드가 설치된 개별 회복 케이지로 옮깁니다. 케이지에 옥수수 속대 베딩을 사용해서는 안 되며, 그렇지 않으면 열 패드의 열이 충분히 전달되지 않습니다. 회복 케이지 위치에서 4피트 위에 가열 램프를 배치합니다.탈지면은 90분 동안 제자리에 유지되어야 합니다. 각 마우스마다 별도의 90분 카운트다운 타이머를 설정해야 합니다. 이 시간 동안 폐 충혈을 방지하기 위해 15분마다 각 마우스의 몸을 좌우로 뒤집어 주어야 합니다.따라서 전체 과정에서 가장 중요한 단계는 접종 시간 내내 솜뭉치가 제자리에 유지되도록 하는 것입니다. 마우스가 마취에서 너무 빨리 깨어나기 시작하면 케타민만을 사용하여 다시 마취하십시오. 90분 후, 솜뭉치를 제거하고 동물의 회복 상태를 관찰하십시오.회복 후, 추가적인 수분 공급을 위해 등 부위의 두 군데에 식염수 1 mL를 추가로 투여합니다. 시술 후, 허벅지 1.1 또는 CD 45.1 마우스에서 유래한 naive T 세포를 사용하는 최대 5마리의 가접종(sham inoculated) 마우스가 케이지를 함께 사용할 수 있습니다. 설명된 절차를 따랐으며, 주입된 T 세포는 각각의 마커를 사용하여 추적되었습니다.공동 이식된 Treg는 CD 45.2 마우스에서 유래되었으며, 해당 마커만으로 추적되었습니다. 칸디다(candida)에 감염된 마우스에서는 주입된 TH 17 세포의 모집 및 증식이 나타났습니다. 감염 후 체중 감소를 추적하였습니다.TH 17 세포만 주입된 마우스는 체중이 점진적으로 감소했으며 일부는 안락사를 시켜야 했습니다. 반면, 다른 그룹의 체중 감소는 결국 중단되었습니다. Treg 공배양 세포를 주입받은 마우스는 감염 4일 후 TNF alpha 생성 세포가 훨씬 더 적게 나타났습니다.TNF Alpha 생성 세포가 지속적으로 존재한다는 점은 TH 17만 주입한 마우스에서 감염과 염증이 해결되지 않았음을 보여줍니다. Treg를 주입한 마우스의 혀에서는 염증성 침윤이 훨씬 적게 나타났으며 진균 성장 또한 감소했습니다. 동일한 시점에서 염증성 침윤이 지속적으로 관찰되는 것은 TH 17만 주입한 마우스의 감염과 염증이 해결되지 않았음을 나타냅니다. 이 감염 기술을 숙달하면, 마우스 4마리를 기준으로 3시간이 소요되며, 추가로 감염시킬 마우스 한 마리당 15분이 더 소요됩니다.

th17-inflammation-model-oropharyngeal-candidiasis-immunodeficient

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

의 실험 마우스 모델에서 질 접종 및 샘플 수집을위한 프로토콜 칸디다 질염

다른 T 세포의 하위 집합에서 별개의 이펙터 기능으로, TH17 세포는 중앙 염증성자가 면역 질환에 연루되어있다. 이 체외 TH17 분화 프로토콜은 순진 CD4 + T 림프구는 TH17 세포로 분화 할 수 있고, 또한자가 면역 및 호스트 응답에서 자신의 역할을 조사할지 여부를 결정하는 방법을 제공합니다.

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병원균 감염에 대한 숙주 면역 반응은 긴밀하게 규제 과정이다. 생쥐의 리포 다당류 폐 노광 모델을 이용해서, 그 질병 병인과 관련된 복잡한 메커니즘은 고해상도 평가를 수행하는 것이 가능하다.

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갤러리아 mellonella 전파 칸디 다에 대 한 무척 추 동물 모델 역할을 합니다. 여기, 우리는 감염 세부 프로토콜 및 모델의 효과 대 한 지원 데이터를 제공.

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여기에서, 우리는 독특하게 디자인된 온난화/억제 장치를 사용하여 설치류 꼬리 정맥 주사를 위한 효과적이고 효율적인 방법을 제시합니다. 혈관 확장 및 억제 과정의 개시를 간소화함으로써,이 프로토콜은 최소한의 고통을 가진 동물의 큰 그룹의 정확하고 적시에 정맥 주사를 허용합니다.

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위험한 병원체에 의한 보철 관절 주위 감염(PJI)은 임상 정형외과에서 흔합니다. 기존의 동물 모델로는 PJI의 실제 상황을 정확하게 시뮬레이션할 수 없습니다. 여기에서 우리는 PJI에 대한 새로운 치료제를 연구하고 개발하기 위해 Candida albicans 생물막 관련 PJI 마우스 모델을 구축했습니다.

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우리는 카테터에 생물막이 형성되고 C.albicans와 숙주 간의 상호 작용이 임상 CRI와 잘 상관되는 C.albicans 관련 카테터 관련 감염(CRI)의 마우스 모델을 확립합니다. 이 모델은 C.albicans 생물막 관련 CRI에 대한 치료법을 스크리닝하여 임상 혁신을 위한 토대를 마련하는 데 도움이 됩니다.

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마우스에서 Naive CD4+ T 세포를 병원성 Th17 세포로 체외에서 분화

본 프로토콜은 in vitro에서 숙주-병원체 상호 작용을 조사하기 위한 유기형 조직 모델의 적용을 개략적으로 설명합니다. 특히, 설명된 모델 시스템은 구강 건강 대 질병의 맥락에서 생물막(치석)과 관련된 미생물에 노출된 다층 구강 상피를 사용합니다.

In vitro에서 숙주-병원체 상호 작용을 조사하기 위한 유기형 조직 모델 시스템

학습하세요 면역 결핍 마우스에 Th17 세포를 주입하고 Candida albicans를 경구 감염시켜 구인두 염증 모델을 구축하는 방법을. 유세포 분석과 면역조직화학을 통해 염증 반응을 평가하여 경구 면역치료 연구에 활용할 수 있습니다.

면역 결핍 마우스의 구인두 칸디다증의 Th17 염증 모델

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