hiPSC 신경 리니지 특정 올림피아 기자의 효율적인 생성 사용 CRISPR / Cas9 및 Cas9 더블 Nickase 시스템

이 절차의 전반적인 목표는 CRISPR Cas nine 매개 상동 재조합을 사용하여 계통 특이적 인간 유도 만능 줄기 세포 또는 H-I-P-S-C knockin 리포터를 생성하는 것입니다. 이는 먼저 타겟팅 벡터를 설계하고 구성함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 CRISPR Cas nine 시스템 또는 CAS nine N double Nick 케이스 시스템을 위한 단일 가이드 RNA를 설계하고 구성하는 것입니다.

2 93피트 그런 다음 세포를 single guide RNA 및 CAS nine 발현 벡터로 cot transfection하고 DNA를 추출하고 증폭하여 T seven ENDONUCLEASE one assay로 평가합니다. 마지막 단계는 잠재적인 off-target 부위에 대한 인실리코(in silico) 예측을 수행하는 것입니다. 사이트. 궁극적으로 HI PSC는 표적 벡터와 CRISPR Cas 9개의 시스템 구성 요소와 transfection되어 신경 계통 knockin 리포터 세포주를 만들 것입니다.

이 기술의 주요 장점은 기존의 상동 재조합과 같은 기존 방법에 비해 있습니다. 대신, CRISPR 캐스트 9개 매개 유전자 표적화는 훨씬 더 높은 표적 효율을 가지고 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 단일 GA rna를 설계하는 데 약간의 연습이 필요할 수 있기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.

유전자 편집을 위해 CRISPR Cas nine 개념이 최근에 도입되었고 계통 특이적 마커 결정에 따라 새로운 온라인 리소스 도구가 사용되기 때문에 단일 가이드 RA 설계 및 오프 타겟 부위의 sical 예측을 위한 단계를 배우기가 어렵기 때문에 이 방법의 시각적 시연이 중요합니다. 유전자의 게놈 염기서열을 찾고 그에 따라 상동성 암을 설계합니다. 이 예에서는 A LDH 1 L 1 게놈 자리가 사용됩니다.

표적화 구축물은 자가 절단에 의해 연결된 정지 코드 직전에 게놈 서열의 하류에 GFP를 서브클로닝함으로써 만들어지며, 2개의 펩티드 서열은 리포터의 하류에 F 플럭스 네오마이신 카세트와 같은 포지티브 선택 카세트를 추가하고, 리포터의 다운스트림은 음성 선택 카세트, 예를 들어 3개의 프라임 상동성 팔 외부의 티미딘 키나아제를 포함한다. 이 데모에서 사용되는 리포터 A LDH one L one을 대상으로 할 계통별 마커를 결정하여 이 절차를 시작합니다. NCBI 데이터베이스에서 CDNA 시퀀스를 복사합니다.

human blatt 검색으로 이동하여 게놈 DNA 정렬을 얻습니다. 브라우저 탭을 클릭하면 보기 탭에서 유전자 어셈블리를 볼 수 있습니다. DNA를 클릭하여 전체 게놈 DNA 염기서열을 빠른 형식으로 얻을 수 있습니다.

양방향 염기서열과 리포터 카세트가 태그될 DNA 염기서열 내에서 정지 코드를 찾습니다. 정지 코드 부근에서 프로토 스페이서, 인접 모티프 또는 Pam, 예를 들어 NGG를 검색하고, 두 가닥을 스캔하여 적절한 NGG 염기서열을 찾습니다. NGG의 바로 업스트림에 있는 20 베이시스의 염기서열을 복사하여 MLM 3 6 3 6 6과 호환되는 오버행이 있는 웹 디자인 도구 Z 핏 디자인 올리고에 붙여넣습니다.

U six promoter를 가진 인간 GRNA 발현 벡터. 정방향 및 역방향 올리고가 모두 합성된 후 50마이크로리터 반응을 위해 이중 가닥 단일 가이드 RNA를 만듭니다. 각각 22.5마이크로리터의 정방향 및 역방향 올리고와 5마이크로리터의 Anne 무릎 꿇기 완충액을 첨가하면 두 올리고가 모두 섭씨 70도에서 15분 동안 변성되고 점차 실온으로 냉각됩니다.

다음으로 올리고를 BSMB 1 소화 MLM 3 6 3 6과 혼합하고 접합합니다. 20 μl 반응의 경우 1 μl의 올리고, 100 nanog의 MLM 3, 6, 6, 3, 6 및 1 μl의 T, 4 ligase를 첨가하고 다음 날 실온에서 하룻밤 동안 배양하고 DH 5 alpha component cell을 42°C에서 30초 동안 열 충격으로 ligation product로 변형시킵니다. LB 오거 암피실린 플레이트에서 박테리아를 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 성장시킵니다.

다음 날에는 플라스미드 준비를 위해 3-5개의 콜로니를 선택합니다. 그 후, 플라스미드 DNA는 상용 염기서열분석에 의해 확인되고 표준 맥시 준비 프로토콜을 사용하여 올바른 플라스미드를 준비하여 이 절차를 시작하고, CRISPR Cas nine 시스템에 대해 입증된 것과 동일한 절차에 따라 각 표적 유전자 자리에 대해 한 쌍의 정방향 및 역방향 올리고를 설계합니다. LDH 1 L 1이 여기에서 다시 예가 될 것입니다.

NGG의 바로 업스트림에 있는 20개 염기의 염기 염기서열을 복사하여 웹에 붙여넣습니다. 설계 도구 Z는 벡터와 호환되는 오버 행크를 가진 올리고를 얻기 위해 적합합니다. Z fit 설계 도구에 표시된 정방향 올리고와 역방향 올리고의 첫 번째 기저와 마지막 기저를 제거합니다.

정방향 올리고와 역방향 올리고를 합성하고 다음과 같이 이름을 지정합니다. 소문자 FN 대문자 F 및 소문자 FN 대문자 R PAM의 경우 대상 사이트의 한쪽에, 소문자 R 및 대문자 F 및 소문자 R 및 대문자 R 이들 N의 대상 사이트의 다른 쪽에있는 PAM의 경우 서로 다른 PAM을 지정하는 숫자이며, 소문자 f 및 r은 감지 또는 반 감지 가닥에서 PAM의 위치를 나타내고 대문자 f 및 r은 전방을 나타냅니다. 역 올리고. T seven E one assay를 사용하여 CAS nine n에 사용할 최적화된 single guide RNA 쌍을 확인한 후, 50 microliter 반응을 위한 이중 가닥 single guide RNA를 만들고 각각 22.5 microlit의 forward 및 reverse oligo와 5 microliter의 kneeling buffer를 추가합니다.

두 올리고를 모두 섭씨 70도에서 15분 동안 변성시키고 점차 실온으로 냉각합니다. 올리고를 bbbs와 혼합하고 접합합니다. 1개의 소화된 이중 나스 CAS 9개의 ND 10 벡터.

20 microlit 반응의 경우, 1 microlit의 single guide RNA, 100 nanogram의 bbbs, 1 개의 digested vector 및 1 microliter의 T 4 ligase를 첨가하고, 하룻밤 동안 42°C에서 30초 동안 열 충격에 의해 ligation product로 DH 5 alpha component cell을 형질전환시킵니다. lb 한천 암피실린에서 박테리아를 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 성장시킵니다. 다음 날에는 플라스미드 준비를 위해 3-5개의 콜로니를 선택합니다.

그 후, 상용 염기서열분석 공급업체에 의해 플라스미드 DNA를 확인하고 표준 맥시 준비 프로토콜을 사용하여 올바른 플라스미드를 준비하여 이 분석을 시작합니다. 0.5 μg의 단일 가이드 RNA 벡터 및 CAS 9 발현 벡터에서 단일 가이드 RNA 벡터 0.5 μg, CAS 9 발현 벡터 0.5 μg 및 lipectomy 2000 1.5 마이크로 리터에서 2 93 ft 세포를 Co transfection. 세포를 섭씨 37도에서 72시간 동안 배양합니다.

72시간 후 각 웰에서 배양 배지를 제거하여 세포를 수확합니다. 100마이크로리터의 DNA 빠른 추출 버퍼와 트리어 등급을 추가하면 세포가 튜브로 격렬하게 전달됩니다. 혼합물을 섭씨 68도에서 15분 동안 배양한 다음 섭씨 95도에서 8분 동안 배양합니다.

이것은 후속 PCR 실험을 위한 템플릿입니다. 프로토 스페이서 인접 모티프 측면에 있는 염기서열을 증폭하도록 PCR을 설정합니다. 50 마이크로리터 반응의 경우, 1 마이크로리터의 템플릿, 0.5 마이크로리터의 Hercules, 2개의 0.5 마이크로리터의 DMSO를 결합하고, 10 마이크로리터의 5 x 버퍼, 0.5 마이크로리터의 A-D-N-T-P 혼합물 및 1 마이크로리터의 정방향 및 역방향 프라이머 혼합물을 결합합니다.

PCR이 완료되고 PCR 산물의 DNA 농도가 400나노그램의 PCR 산물에서 2마이크로리터의 분해 버퍼 2로 측정된 경우 프로토콜에 설명된 매개변수에 따라 PCR을 수행하고 최종 반응에 DD H2O를 추가합니다. 19 마이크로 리터의 부피는 끓는 물에서 5 분 동안 배양합니다. 반응을 벤치에 45-60분 동안 그대로 두어 실온으로 자연적으로 냉각시킵니다.

다음으로, 1 마이크로 리터의 T 7 E 1을 넣고 섭씨 37도에서 15 분 동안 배양합니다. 6개의 XDNA 로딩 염료와 혼합된 0.25몰 EDTA 2마이크로리터를 첨가하여 반응을 중지합니다. 전체 20마이크로리터 반응을 2.5%AROS 젤에 로드합니다.

젤을 100-150볼트에서 30분 동안 작동시킵니다. UV 광선 아래에서 겔을 검사하여 단일 가이드 RNA 매개 절단을 평가합니다. 그 후, 선형화된 표적화 벡터 CAS 9 0 0 3 발현 벡터 및 적절한 단일 가이드 RNA 벡터 또는 벡터를 사용하여 전기 인간 유도 만능 줄기세포 또는 HI PSC에 의한 신경 계통 리포터를 생성합니다.잠재적인 오프 타겟 사이트는 진주 기반 프로그램인 CS ot라는 온라인 오픈 소스 도구를 사용하여 예측할 수 있습니다.

윈도우 시스템의 경우 CS OT 프로그램과 인간 게놈 데이터베이스 파일을 로컬 하드 드라이브에 다운로드합니다. 설계된 single guide RNA의 타겟 파일을 FASTA 형식으로 준비합니다. cas ot라는 파일을 엽니다.

명령 창이 나타납니다. 지금은 그대로 두십시오. 그런 다음 opt generator라는 파일을 엽니다.

옵션 문자열을 생성하려면 대상 파일의 경로와 이름을 빼기 T 또는 빼기 대상 옵션의 대화 상자에 붙여넣습니다. 게놈 염기서열 파일의 경로를 마이너스 G 또는 마이너스 게놈 옵션의 대화 상자에 붙여넣습니다. 옵션 문자열을 복사하여 CAS OT 명령 창에 붙여넣습니다.

앞서 cas OT 프로그램 완료 시 표시된 것처럼 run 폴더가 생성됩니다. 스프레드시트 프로그램을 사용하여 폴더 내의 CSV 파일을 엽니다. 이 파일에는 모든 off-target site, 염색체 및 게놈 위치에 대한 다음 정보가 포함되어 있습니다.

site mismatched type의 염기서열, transection 전 off-target site와 관련된 mismatched bases 및 exon 정보의 총 수. 안녕하세요 PSC입니다. 단일 가이드 RNA는 T seven E one assay에 의해 2 93 ft cell에서 평가됩니다.

이 대표적인 결과에서, 단일 가이드 RNA는 human oli를 표적으로 하도록 설계되었습니다. 2개의 유전자 lane's 1 - 3은 CAS nine 발현 벡터로 transfection되고, lane 4 - 11은 CAS nine N nase 발현 벡터로 transfection됩니다. GFP는 컨트롤로 사용됩니다.

2열에는 oli를 위한 single guide RNA가 포함되어 있습니다. CAS nine lane 5를 사용한 2개의 표적화는 결합 감각 가닥만 포함합니다. 6번 레인은 단일 가이드 RNA 결합 안티센스 가닥만 포함하고 9번 및 10번 레인은 두 DNA 가닥 모두에 대한 한 쌍의 단일 가이드 RNA를 포함합니다.

소화되지 않은 PCR 산물은 2 열에서 약 614 염기쌍입니다. PCR 산물의 일부는 약 470개의 염기쌍과 140개의 염기쌍으로 구성된 두 개의 밴드로 분해되며, 레인의 9와 10에서 33%의 삽입 및 삭제 비율이 있습니다. 소화된 두 개의 밴드는 약 410개의 염기쌍과 200개의 염기쌍으로 구성되며, 삽입 및 삭제 비율은 3에서 8% 사이입니다.일단 벡터와 단일 가이드만 설계하고 평가하면 약 일주일 안에 완료할 수 있습니다.

개발 후 적절하게 수행됩니다. 이 기술은 줄기세포 생물학 분야의 연구자들이 인간 시스템의 발달 및 질병에 대한 광범위한 유전자 기능을 할 수 있는 길을 열었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 CRISPR Cas nine 및 CAS nine N double N 시스템을 위한 단일 가이드 어레이를 설계하고 구성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.