Name: hiPSC 신경 리니지 특정 올림피아 기자의 효율적인 생성 사용 CRISPR / Cas9 및 Cas9 더블 Nickase 시스템 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 46 s
Description: 배우세요 CRISPR/Cas9 및 Cas9 더블 니카제 시스템을 사용하여 hiPSC 신경 리니지 특정 녹인 리포터를 효율적으로 생성하는 방법을. 이 기술은 동원 재조합을 통해 유전자 표적 효율성을 높여줍니다.

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이 연구는 신경외과, Memorial Hermann Foundation Staman Ogilvie Fund, 휴스턴에 있는 University of Texas Health Science Center의 Bentsen Stroke Center 및 Mission Connect TIRR Foundation의 지원을 받았습니다.

1. 벡터 타겟팅을 위한 설계 및 벡터 구성
<ol>
	<li>계통 특이적 마커가 결정되면 유전자의 게놈 염기서열을 찾고 그에 따라 상동성 암을 설계합니다. 5' 상동성 암의 길이는 ~1kb이고 3' 상동성 암의 길이는 ~1.5kb입니다(그림 1).</li>
	<li>subcloning을 통해 stop codon 직전의 게놈 염기서열 다운스트림에 리포터 카세트를 순차적으로 태그하여 내인성 발현이 변경되거나 중단되지 않도록 합니다. 리포터 또는 듀얼 리포터 카세트를 자가 절단 2A 펩타이드 서열(F2A, E2A 또는 T2A) 20,21 또는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)와 연결합니다. 
	참고: 리포터는 GFP, tdTomato, tagRFP, YFP, 루시퍼라제 또는 형광 단백질과 항생제 내성 카세트의 조합인 항생제 내성 카세트와 같은 형광 단백질을 포함할 수 있습니다. 그림 1에는 EGFP 및 네오마이신 내성 카세트로 태그가 지정된 인간 ALDH1L1 유전자에 대한 표적화 벡터를 구성하기 위한 예가 나와 있습니다.</li>
	<li>리포터의 다운스트림에 포지티브 선택 카세트를 추가합니다. positive selection은 양성 클론을 선택하고 분리한 후 표적 iPSC에서 절제되는 플록스된 항생제 내성 카세트입니다.</li>
	<li>3' homology arm 외부에 negative selection cassette를 포함합니다. 일반적인 음성 선택 카세트는 티미딘 키나아제(thymidine kinase), TK 및 디프테리아 독소 A(diphtheria toxin A, DTA) 22입니다.</li>
	<li>계통 마커의 염기서열을 포함하는 human BAC 클론을 획득하고 PCR 증폭으로 클론을 검증합니다. 재조합(recombinationering)을 사용하여 pKD46에 타겟화 벡터를 구축하여 타겟 부위 23을 풀다운합니다. 필요한 경우 다중 사이트 게이트웨이, 골든 게이트 전략23,24를 적용합니다.</li>
</ol>
2. CRISPR/Cas9 시스템용 sgRNA의 설계 및 벡터 구성.
<ol>
	<li>리포터를 만들기 위해 대상으로 할 계보별 마커를 결정합니다. NCBI 데이터베이스에서 cDNA 염기서열을 복사합니다. human BLAT 검색으로 이동하여 게놈 DNA 정렬을 획득합니다.</li>
	<li>"브라우저" 탭을 클릭하면 유전자의 조립을 볼 수 있습니다. "보기" 탭에서 "DNA"를 클릭하여 FASTA 형식의 전체 게놈 DNA 염기서열을 얻습니다.</li>
	<li>DNA 염기서열 내에서 정지 코돈을 찾으면 2A 염기서열과 리포터 카세트가 태그됩니다.</li>
	<li>stop codon의 vinicity(~100bp 측면 영역) 내에서 protospacer 인접 모티프(PAM, 즉 NGG)를 검색합니다. 두 가닥을 모두 스캔하여 적절한 NGG 염기서열을 찾습니다. 잠재적인 off-target 이벤트를 피하기 위해 업스트림 염기서열의 특이성을 고려하십시오. BLAST 및 CasOT와 같은 오픈 소스 도구를 사용합니다(자세한 내용은 5단계 참조).</li>
	<li>NGG 바로 업스트림에 있는 20개 염기의 염기서열을 복사하여 웹 디자인 도구인 ZiFit에 붙여넣어 human-gRNA-expression vector(U6 promoter 포함) MLM3636와 호환되는 돌출부가 있는 oligo를 설계합니다.</li>
	<li>정방향 올리고와 역방향 올리고를 모두 합성합니다 7.</li>
	<li>이중 가닥 sgRNA를 만들려면 70°C에서 15분 동안 두 올리고를 모두 변성시키고 점차적으로 RT로 냉각합니다. 50 μl 반응의 경우, 각각 22.5 μl의 정방향 및 역방향 올리고(스톡 농도는 0.1 mM)와 5 μl의 어닐링 완충액(100 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, 1.5 M NaCl, pH 8.0)을 첨가합니다.</li>
	<li>2.7단계에서 얻은 올리고를 BsmBI 분해된 human-gRNA-expression vector(U6 promoter 포함) MLM3636와 혼합 및 접합합니다. 20 μl 반응의 경우, Step 2.7의 올리고 1 μl, MLM3636 100 ng 및 T4 리가제 1 μl(400 U)를 추가합니다. RT O/N에서 배양합니다.</li>
	<li>42°C에서 30초 동안 열 충격으로 결찰 산물로 DH5α 수용 세포를 형질전환시킵니다. 37°C O/N에서 LB 한천 암피실린(100 μg/ml) 플레이트에서 박테리아를 성장시킵니다. 제조업체의 프로토콜에 따라 plasmid miniprep을 위한 3~5개의 콜로니를 선택합니다. 플라스미드 DNA의 염기서열을 분석하여 상용 공급업체를 사용하여 확인합니다. Maxiprep은 제조업체의 프로토콜에 따라 올바른 플라스미드를 사용합니다.</li>
	<li>T7 엔도뉴클레아제 1(T7E1) 분석으로 sgRNA를 평가합니다(자세한 내용은 4단계 참조). plasmid 및 sgRNA를 transfection하면 MLM3636 backbone에 내장된 U6 promoter에서 발현됩니다(자세한 내용은 6단계 참조).</li>
</ol>
3. Cas9n Double Nickase sgRNA의 설계 및 구성
<ol>
	<li>이중 니카제 Cas9n D10A 벡터 pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n (D10A)을 얻습니다.</li>
	<li>각 표적 궤적에 대해 한 쌍의 정방향 및 역방향 올리고를 설계합니다. 2단계에서 설명한 대로 NGG의 바로 업스트림에 있는 20개 염기의 염기 염기서열을 복사하여 웹 디자인 도구 ZiFit에 붙여넣습니다</li>.
	<li>pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n(D10A)과 호환되는 돌출부가 있는 올리고를 얻으려면 ZiFit 설계 도구에 표시된 정방향 및 역방향 올리고의 첫 번째 베이스와 마지막 베이스를 제거합니다.</li>
	<li>정방향 및 역방향 올리고 합성7. 이러한 올리고의 이름을 타겟 부위의 한쪽에 있는 PAM의 경우 f(n)-F, f(n)-R, 타겟 부위의 다른 쪽에 있는 PAM의 경우 r(n)-F, r(n)-R로 지정합니다. 이 중 n은 서로 다른 PAM을 지정하는 숫자이고, 소문자 f와 r은 센스(f) 또는 안티센스(r) 가닥에서 PAM의 위치를 나타내고, F와 R은 순방향 및 역방향 올리고를 나타냅니다.
	<ol>
		<li>T7E1 assay(4단계 참조)를 사용하여 여러 쌍(예: r5 및 f2)을 테스트하여 Cas9n에 사용할 최적화된 sgRNA 쌍을 식별합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>이중 가닥 sgRNA를 만들려면 70°C에서 15분 동안 두 올리고를 모두 변성시키고 점차적으로 RT로 냉각합니다. 50 μl 반응의 경우, 각각 22.5 μl의 정방향 및 역방향 올리고 (스톡 농도는 0.1 mM)와 5 μl의 어닐링 버퍼 (100 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, 1.5 M NaCl, pH 8.0)를 첨가한다.</li>
	<li>3.5단계에서 얻은 올리고를 BbsI-digested pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n(D10A)과 혼합 및 접합합니다. 20 μl 반응의 경우, Step 3.5의 sgRNA 1 μl, Cas9n (D10A) 100 ng, T4 ligase 1 μl (400 U)를 첨가합니다. RT O/N에서 배양합니다.</li>
	<li>42°C에서 30초 동안 열충격으로 DH5α 수용 세포를 결찰 산물로 형질전환시킵니다. 37°C O/N에서 LB 한천 암피실린(100μg/ml) 플레이트에서 박테리아를 성장시킵니다. 제조업체의 프로토콜에 따라 plasmid miniprep을 위한 3~5개의 콜로니를 선택합니다. 플라스미드 DNA의 염기서열을 분석하여 상용 공급업체를 사용하여 확인합니다. Maxiprep은 제조업체의 프로토콜에 따라 올바른 플라스미드를 사용합니다.</li>
	<li>T7E1 assay로 sgRNA를 평가합니다(자세한 내용은 Step 4 참조). plasmid 및 sgRNA를 사용한 transfection hiPSC는 Cas9n(D10A) backbone에 내장된 U6 promoter에서 발현됩니다(자세한 내용은 6단계 참조).</li>
</ol>
4. T7 Endonuclease1 (T7E1) Assay에 의한 sgRNA 평가
<ol>
	<li>24웰 플레이트 1개의 경우, 웰당 2 x 105 293FT 셀을 하루 전(-1일) 플레이트</li>화합니다.
	<li>transfection 당일(day 0)에 293FT 세포를 sgRNA plasmid 및 Cas9 발현 벡터와 함께 transfection합니다. sgRNA 벡터 0.5μg, Cas9 발현 벡터 JDS246(Cas9-003) 0.5μg, Lipofectamine 2000 1.5μl를 추가합니다.
	<ol>
		<li>negative control의 경우, sgRNA 벡터 대신 0.5 μg의 GFP 발현 벡터(예: pcDNA3 backbone에서 CMV promoter driven GFP)를 추가합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>72시간(3일차) 후 DNA 빠른 추출 완충액 100μl를 첨가하고 격렬하게 분쇄하여 세포를 수확합니다.</li>
	<li>혼합물을 68 ° C에서 15 분 동안 배양 한 다음 95 ° C에서 8 분 동안 배양합니다. 이것은 후속 PCR 실험을 위한 템플릿입니다.</li>
	<li>PAM을 둘러싸고 있는 염기서열을 증폭하기 위해 순방향 및 역방향 PCR 프라이머를 모두 설계합니다. 일반적으로 표적 PCR 산물의 길이는 약 400-500bp입니다. 올리고를 합성한다7.</li>
	<li>50μl PCR 반응의 경우 Step 4.5의 템플릿 1μl, Herculase II 0.5μl, DMSO 0.5μl, 5x 완충액 10μl, dNTP 믹스 0.5μl, 정방향 및 역방향 프라이머 믹스 1μl를 추가합니다.</li>
	<li>다음 PCR 매개변수를 사용하십시오: 98°C에서 2분 동안 2회, 98°C에서 20초 동안 35회, 59°C에서 20초 동안 59°C, 72°C에서 1분 동안 최종 연장 
	참고: 여기에 설명된 PCR 매개변수는 테스트된 여러 유전자에 대한 특정 산물을 생성합니다. 그러나 이러한 조건은 사용자가 선택한 관심 유전자에 따라 다릅니다. 게놈 DNA를 주형으로 사용하는 PCR은 종종 여분의 밴드가 나타나지 않도록 최적화해야 합니다. 이러한 여분의 띠는 T7E1 분석 후 절단 산물과 혼동될 수 있습니다.</li>
	<li>A260에서 분광계를 사용하여 PCR 산물의 DNA 농도를 측정합니다.</li>
	<li>400ng의 PCR 산물을 2μl의 Digestion buffer 2에 추가합니다. 19 μl의 최종 반응 부피에 ddH2O를 추가합니다. 끓는 물에서 5분 동안 배양합니다. 반응을 벤치에 놓고 RT(45-60분)로 자연스럽게 식힙니다.</li>
	<li>T7E1 1 μl(10 units/μl)를 첨가하고 37°C에서 15분 동안 배양합니다. 6x DNA 로딩 염료와 혼합된 0.25 M EDTA 2 μl를 첨가하여 반응을 중지합니다.</li>
	<li>아가로스 파우더 2.5g을 1xTAE 100ml에 녹입니다. 혼합물을 전자레인지에 넣고 젤 상자에 젤을 붓습니다. 젤이 형성될 때, 2.5% 아가로스 젤에 전체적인 20 μl 반응을 적재하십시오. 젤을 100-150V에서 30분 동안 실행합니다.</li>
	<li>자외선 아래에서 젤을 검사합니다(그림 3). T7E1은 일치하지 않는 부위를 절단합니다. 비상동성 말단 결합을 일으킨 sgRNA의 경우, PCR 산물은 음성 대조군(4.3단계에서 설명)에 비해 추가로 빠른 이동 대역(더 작은 크기)을 보여줍니다.</li>
	<li>Image J 소프트웨어를 사용하여 밴드 밀도를 비교하여 sgRNA 절단 효율과 삽입 및 삭제 비율(indel%)을 추정하고 순위를 매깁니다.
	<ol>
		<li>젤에서 실행되는 각 샘플에 대해 젤 밴드를 자르지 않은 밴드, 절단 밴드 1 및 절단 밴드 2로 지정합니다.</li>
		<li>소프트웨어 핸드북에 따라 ImageJ를 사용하여 각 대역의 밀도를 측정합니다.</li>
		<li>다음 공식을 사용하여 f컷을 계산합니다: fcut = (컷 밴드 1 + 컷 밴드 2) / (비컷 밴드 + 컷 밴드 1 + 컷 밴드 2)</li>
		<li>Indel=1- √(1-fcut) 공식을 사용하여 Indel%를 계산합니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 잠재적인 Off-target Site의 In Silico 예측
참고: Perl 기반 프로그램인 CasOT17이라는 온라인 오픈 소스 도구를 사용하여 잠재적인 오프 타겟 사이트를 예측할 수 있습니다.
<ol>
	<li>Windows 시스템의 경우 CasOT 프로그램과 인간 게놈 데이터베이스 파일을 로컬 하드 드라이브에 다운로드합니다.</li>
	<li>설계된 sgRNA의 타겟 파일을 FASTA 형식으로 준비합니다.</li>
	<li>"casot"라는 파일을 엽니다. 명령 창이 나타납니다. 지금은 그대로 두십시오.</li>
	<li>"opt-generator"라는 파일을 열어 옵션 문자열을 생성합니다. 대상 파일의 경로와 이름을 "-t" 또는 "-target" 옵션의 대화 상자에 붙여넣습니다.</li>
	<li>게놈 염기서열 파일의 경로를 "-g" 또는 "-genome" 옵션의 대화 상자에 붙여넣습니다.</li>
	<li>입력 값은 –s 또는 –seed(기본값은 2) 및 –n 또는 -nonseed(기본값은 255)입니다. 옵션 문자열이 생성되고 페이지 맨 위에 있는 상자에 나타납니다.</li>
	<li>옵션 문자열을 복사하여 5.3. 단계에 설명된 CasOT 명령 창에 붙여넣습니다.
	참고: 옵션 및 사용하는 컴퓨터에 따라 CasOT 프로그램을 실행하는 데 30-90분이 걸릴 수 있습니다. 완료되면 '<input_target_file>-<genome_file>-<off-target_related_options>'라는 폴더가 생성됩니다. 이 폴더에는 통계를 설명하는 ".stat" 파일과 자세한 검색 결과가 포함된 .csv(쉼표로 구분된 값) 파일의 두 파일이 포함됩니다.</off-target_related_options></genome_file></input_target_file></li>
	<li>스프레드시트 프로그램으로 .csv 파일을 엽니다. 염색체 및 게놈 위치, 부위 서열, 불일치(Mm) 유형, 불일치 염기의 총 수, 오프 타겟 부위와 관련된 엑손 정보와 같은 정보가 모든 오프 타겟 부위에 대한 파일에 제공됩니다.</li>
	<li>시드 또는 비시드 염기서열에서 <2mm가 있는 부위에 대한 PCR 프라이머를 설계합니다.</li>
	<li>다음 조건을 사용하여 선택된 양성 hiPSC 클론에 대해 PCR을 수행합니다: 98°C에서 2분 동안, 98°C에서 20초 동안 35회, 59°C에서 20초 동안, 72°C에서 1분 동안 72°C에서 5분 동안 최종 연장. 
	참고: 여기에 설명된 PCR 매개변수는 당사 실험실에서 테스트한 여러 유전자에 대한 특정 산물을 생성합니다. 그러나 이러한 조건은 사용자가 선택한 관심 유전자에 따라 다릅니다. 게놈 DNA를 주형으로 사용하는 PCR은 종종 여분의 밴드가 나타나지 않도록 최적화해야 합니다.</li>
	<li>PCR 산물의 염기서열을 분석하고, 염기서열분석 결과를 예측된 염기서열과 정렬하고, 돌연변이를 검색합니다. 돌연변이가 존재하면 off-target 이벤트가 식별됩니다.</li>
</ol>
6. 신경 계통 리포터를 만들기 위한 hiPSC의 전기천공법
<ol>
	<li>Geltrex 코팅 접시에 TeSR-E8 배지의 배양 hiPSC. 전기천공법 2일 전에 배지를 MEF-CM(Mouse embryonic fibroblasts conditioned medium) 배지로 변경합니다. 2ml의 Accutase에서 5분 동안 배양하고 세포를 수집합니다.</li>
	<li>다음 조건을 사용하여 선형화된 표적화 벡터, Cas9-003 발현 벡터 및 sgRNA 벡터로 hiPSC를 전기포공합니다: 1 x 107 hiPSC, 2.5 μg의 sgRNA, 2.5 μg의 Cas9 및 50 μg의 표적화 벡터를 co-transfection합니다. 이중 nickase 전략의 경우, 50 μg의 표적화 벡터, 각 sgRNA 2.5 μg을 추가합니다(벡터에 의해 동시 발현된 Cas9n 포함).</li>
	<li>설명된 대로 positive 및 negative selection으로 클론을 선택합니다24,25.</li>
	<li>Southern Blot Analysis 또는 장거리 게놈 PCR24,25로 양성 클론을 식별합니다.</li>
</ol>

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<li>Carey, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+murine+and+human+somatic+cells+using+a+single+polycistronic+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of murine and human somatic cells using a single polycistronic vector.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 157-162 (2009).</li>
<li>Yagi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+negative+selection+for+homologous+recombinants+using+diphtheria+toxin+A+fragment+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A novel negative selection for homologous recombinants using diphtheria toxin A fragment gene.</a> Analytical Biochemistry. 214, 77-86 (1993).</li>
<li>Wu, S., Ying, G., Wu, Q., Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+constructing+gene+targeting+vectors%3A+generating+knockout+mice+for+the+cadherin+family+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A protocol for constructing gene targeting vectors: generating knockout mice for the cadherin family and beyond.</a> Nature Protocols. 3, 1056-1076 (2008).</li>
<li>Xue, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+targeted+neuroglial+reporter+line+generated+by+homologous+recombination+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">A targeted neuroglial reporter line generated by homologous recombination in human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 27, 1836-1846 (2009).</li>
<li>Liu, Y., Jiang, P., Deng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OLIG+gene+targeting+in+human+pluripotent+stem+cells+for+motor+neuron+and+oligodendrocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">OLIG gene targeting in human pluripotent stem cells for motor neuron and oligodendrocyte differentiation.</a> Nature Protocols. 6, 640-655 (2011).</li>
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유전자 표적화는 유전자 기능을 특성화하는 데 필수적인 도구입니다. 그러나 상대적으로 낮은 효율성으로 인해 노동 집약적이고 시간이 많이 걸리는 작업이 필요합니다. 최근에는 CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas(CRISPR 연관) 시스템과 같은 게놈 편집 도구의 개발로 표적화 효율성이 크게 향상되었습니다. 이 원고는 CRISPR/Cas 시스템 보조 상동 재조합을 사용하여 계통 특이적 인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSC) 리포터를 생성하기 위한 프로토콜을 설명합니다. CRISPR/Cas 시스템 매개 게놈 편집을 사용하여 신경 계통 리포터 라인을 만드는 데 필요한 구성 요소를 얻기 위한 단계가 설명되며, Cas9 및 Cas9n 이중 니카제 시스템 모두에 대한 표적 벡터 및 단일 가이드 RNA의 구성에 중점을 둡니다.
CRISPR/Cas9 시스템은 hiPSC의 다양한 유전 공학 요구 사항을 충족할 수 있습니다. 녹아웃 및 노킨(예...

CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/CAS(CRISPR-associated) 시스템은 다른 게놈 편집 도구와 함께 최근 몇 년 동안 인간 게놈 조작에 혁명을 일으켰습니다1-7. CRISPR/Cas9 시스템의 주요 구성 요소는 단일 가이드 RNA(sgRNA)와 Cas9입니다. Cas9은 RNA 유도 II형 DNA 엔도뉴클레아제입니다. 여기에는 HNH와 RuvC라는 두 개의 뉴클레아제 도메인이 있으며, 이는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 7-10 옆의 특정 게놈 영역에서 DNA 이중 가닥 절단(DSB)을 만드는 역할을 합니다. sgRNA는 박테리아(예: 연쇄상구균 화농성체)와 고세균에서 확인된 두 개의 적응 면역 RNA 분자인 crRNA와 tracrRNA의 기능을 결합하여 외인성 소스의 DNA 침입에 맞서 싸웁니다9-11. 적절하게 설계되어 포유류 세포에 동시 도입되면 sgRNA는 PAM 염기서열을 인식하고, 표적 DNA의 상보적 가닥과 염기쌍을 이루고, Cas9를 유도 및 transactivate하여 PAM7의 바로 상류에 있는 두 DNA 가닥을 절단합니다. 그 후, DSB를 복구하기 위해 상동 유도 재조합(HDR, 표적화 벡터가 있는 경우) 또는 비상동 말단 결합(NHEJ)이 발생합니다. cDNA, 리포터 카세트 또는 항생제 내성 단편과 같은 전이유전자를 통합하고 형질전환 또는 넉인 라인을 만들 수 있습니다.
CRISPR/Cas9 시스템은 매우 효율적이고 비교적 특이적이지만, 바람직하지 않은 off-target 활동이 보고되었습니다12-15. off-target 이벤트를 최소화하기 위해 Cas9 nickase (Cas9n)도9,10,14,16,17로 엔지니어링되었습니다. Cas9n(Cas9 D10A 또는 Cas9 H840A)은 두 개의 뉴클레아제 도메인 중 하나에 돌연변이가 있는 Cas9 효소로, DNA의 한 가닥에서만 흠집을 유발합니다. 두 가닥에서 절단을 달성하기 위해 두 개의 sgRNA는 두 개의 서로 다른 DNA 가닥의 가까운 loci에서 별도로 절단하는 한 쌍의 nickase를 안내하도록 설계되었습니다. "더블 니킹(double nicking)" 전략은 기존 Cas9 플랫폼보다 더 엄격한 설계가 필요하며, 유전자 편집 실험을 위한 높은 효율성과 높은 특이성을 제공합니다.
이 원고는 CRISPR/Cas 시스템 보조 상동 재조합을 사용하여 계통 특이적 인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSC) 리포터를 생성하기 위한 프로토콜을 설명합니다. CRISPR/Cas 시스템 매개 게놈 편집을 사용하여 신경 계통 리포터 라인을 만드는 데 필요한 구성 요소를 얻는 단계가 표적 벡터 및 sgRNA의 구성에 중점을 두고 설명됩니다. 이 프로토콜은 건강한 개인과 CNS 질환 환자로부터 유래한 세포주를 포함한 여러 hiPSC 계통에서 성공적으로 반복되었습니다. 본 연구실에서 표적으로 하는 유전자는 OLIG2, HB9(MNX1), NEUROG2, SOX1, ALDH1L1 및 SOD1입니다. hiPSC에서 CRISPR/Cas 시스템 매개 상동 재조합의 표적 효율은 20-40%이며, 이는 이전 보고서1,18,19와 일치합니다. 기존 유전자 표적화 실험에서 1-2%의 일반적인 효율과 비교하여 표적화 효율이 크게 개선되었습니다.

<table><tbody><tr><td>pStart-K</td><td>애드진</td><td>20346</td><td></td></tr><tr><td>pWS-TK6&nbsp;</td><td>애드진</td><td>20350</td><td></td></tr><tr><td>pKD3&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>45604</td><td></td></tr><tr><td>pKD46</td><td>대장균 유전자 재고 센터, CGSC</td><td>7634</td><td></td></tr><tr><td>PGK-neo-bpA 서열&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>13442</td><td></td></tr><tr><td>표적 유전자의 인간 BAC 클론&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td>https://bacpac.chori.org</tr><tr><td>JDS246 (Cas9-003), 포유류 코돈에 최적화된 연쇄상구균 화농성 Cas9-3X 플래그</td><td>Addgene</td><td>43861</td><td></td></tr><tr><td>MLM3636, U6 프로모터를 가진 Human-gRNA-ExpressionVector&nbsp;</td><td>추가진</td><td>43860</td><td></td></tr><tr><td>pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n(D10A)</td><td>추가진</td><td>42335</td><td></td></tr><tr><td>sgRNA 설계, ZiFit</td><td>http://zifit.partners.org/ZiFiT/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Off 표적 예측 도구 CasOT</td><td>http://eendb.zfgenetics.org/casot/download.php</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perl</td><td>http://www.perl.org/get.html</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NCBI</td><td>http://www.ncbi.nlm.nih.gov/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>BLAT</td><td>https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sgRNA 프라이머 합성</td><td>시그마</td><td></td><td></td></tr><tr><td>원샷 Top10 Electrocomp E. Coli 유능 세포</td><td>생명 기술</td><td>C4040-50</td><td></td></tr><tr><td>AccuPrime Pfx SupperMix</td><td>생명 과학 기술</td><td>12344-040</td><td></td></tr><tr><td>제한 효소</td><td>NEB와 Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zymoclean 젤 DNA 회수 키트</td><td>Zymo Researech</td><td>D4007</td><td></td></tr><tr><td>DNA 빠른 추출 버퍼&nbsp;</td><td>진원지</td><td>QE0905T</td><td></td></tr><tr><td>Herculase II Fusion DNA Polymerases</td><td>Agilent Technologies</td><td>600675</td><td></td></tr><tr><td>Digestion buffer 2</td><td>New England Biolab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6X DNA Loading Dye</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>TeSR-E8 Kit for hESC/hiPSC Maintenance</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>05940</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarose&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>16500-100</td><td></td></tr><tr><td>50xTAE</td><td>Life Technologies</td><td>B49</td><td></td></tr><tr><td>필수 8 중간&nbsp;</td><td>라이프 테크놀로지</td>스 <td>A1517001</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' 칼슘과 마그네슘이 없는 인산염 완충 식염수&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>A12856-01</td><td></td></tr><tr><td>D-MEM/F12 with Glutamax&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>10565018</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax와 D-MEM&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>10566040</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum-ES 세포 인증&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>10439</td><td></td></tr><tr><td>Knockout 세럼 교체품&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>10828010</td><td></td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올 1000X&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>비필수 아미노산&nbsp;</td><td>생명 기술</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Stempro Accutase&nbsp;</td><td>라이프 테크놀로지</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>디스파스&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 트립신- EDTA 솔루션&nbsp;</td><td>라이프 테크놀로지</td>스 <td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>겔트렉스&nbsp;</td><td>라이프 테크놀로지&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>12760-013</td><td></td></tr><tr><td>ROCK 억제제 Y-27632</td><td>Millipore</td><td>&nbsp; &nbsp; SCM075</td><td></td></tr><tr><td>SMC4 시약&nbsp;</td><td>BD</td><td>354357</td><td></td></tr><tr><td>네오마이신 저항성 MEF&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>PMEF-NL</td><td></td></tr><tr><td>하이그로마이신 저항성 MEF&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>PMEF-HL</td><td></td></tr><tr><td>G418 (Geneticin)</td><td>LifeTechnologies</td><td>11811</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin B&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>10687010</td><td></td></tr><tr><td>FIAU (Fialuridine, 1-2-Deoxy-2-fluoro-&szlig;-D-arabinofuranosyl-5-iodouracil</td><td>&nbsp; Moravek 생화학 및 방사성 화학 물질</td><td>&nbsp; &nbsp; M251</td><td></td></tr><tr><td>Electroporator: 유전자 펄서 Xcell&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.4cm 전기천공법 큐벳&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2088</td><td></td></tr><tr><td>DIG-High prime DNA 라벨링 및 검출 스타터 키트 II&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11585614910</td><td></td></tr><tr><td>혼성화 변성 솔루션&nbsp;</td><td>VWR</td><td>82021-478</td><td></td></tr><tr><td>PCR DIG 프로브 합성 키트&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11636090910</td><td></td></tr><tr><td>DIG 워시 세트&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11585762001</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Digoxigenin (DIG-AP)</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>CSPD 화학발광 시스템&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11755633001</td><td></td></tr><tr><td>DIG 세척 및 블록 버퍼 세트&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11585762001</td><td></td></tr><tr><td>50X TAE 버퍼&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>24710030</td><td></td></tr><tr><td>블로팅 버퍼 (25 mM Tris pH 7.4,&nbsp; 0.15 M NaCl,&nbsp; 0.1% Tween20)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hoefer Ultraviolet Crosslinker&nbsp;</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>03-500-308</td><td></td></tr><tr><td>스페르미딘&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>AC13274-0010</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl 2M (pH 7.5)</td><td>VWR</td><td>&nbsp; &nbsp; 200064-506</td><td></td></tr><tr><td>덴빌 사이언티픽 블루 바이오 필름 8x10&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>nc9550782</td><td></td></tr><tr><td>DNA 분자량 마커 II (DIG 라벨링)</td> <td>Roche</td><td>11218590910</td><td></td></tr><tr><td>Amersham 블로팅 멤브레인 Hybond-N+&nbsp;</td><td>Roche</td><td>95038-400</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex 유리 건조 트레이&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>15-242A</td><td></td></tr><tr><td>Kimberly-Clark C-fold 종이 타월&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>06-666-32B</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 3MM 종이 (26X41)</td><td>Fisher</td><td>&nbsp; &nbsp; 05-713-336</td><td></td></tr><tr><td>혼성화 백&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11666649001</td><td></td></tr><tr><td>혼성화 튜브&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>13-247-300</td><td></td></tr><tr><td>하이브리드화 오븐 로티세리 쉐이크 'n' 스택&nbsp;</td><td>피셔</td><td>HBMSOV14110</td><td></td></tr></tbody></table>

hipsc 신경 리니지 특정 올림피아 기자의 효율적인 생성 사용 crispr / cas9 및 cas9 더블 nickase 시스템

Efficient Generation of hiPSC Neural Lineage Specific Knockin Reporters Using the CRISPR/Cas9 and Cas9 Double Nickase System

유전자 타겟팅은 현대 생물 의학 연구에서 유전자 기능을 특성화하기위한 중요한 방법입니다. 그러나, 인간의 세포에서 표적 유전자의 효율은 원하는 속도로 인간 세포주의 생성을 방지, 저왔다. 지난 2 년은 CRISPR (Interspaced 짧은 회문 반복 정기적으로 클러스터) / CAS (CRISPR 관련) 시스템으로 게놈 편집 도구에 의해 유전자 조작의 효율성을 향상에 신속한 진행을 목격했다. 이 원고는 상동 재조합 지원 CRISPR / CAS 시스템을 사용하여 혈통 특정 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC) 기자를 생성하기위한 프로토콜을 설명합니다. , CRISPR / CAS 시스템을 사용하여 신경 계통 리포터 라인을 만들기 위해 필요한 구성 요소를 획득 타겟팅 벡터 및 RNA는 단일 가이드의 구조에 초점을위한 절차가 설명된다. 이 프로토콜은 hiPSCs에서 플랫폼 구축 돌연변이 보정을 확장 할 수있다.

상동성 팔(homology arms), 리포터 카세트, 양성 및 음성 선택 카세트를 포함한 모든 필수 구성 요소를 갖춘 타겟팅 벡터를 제작합니다 (그림 1). 내인성 게놈 유전자좌를 기반으로, 여러 개(2~3개)의 sgRNA(Cas9 시스템 사용 시) 또는 sgRNA 쌍(Cas9n 이중 니카제 전략 사용 시)을 설계하여 인간-gRNA-발현 벡터 MLM3636 또는 pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n (D10A) 백본에 삽입하여 제작합니다 (그림 2). hiPSC에 형질전환시키기 전, 293FT 세포에서 T7E1 분석을 통해 sgRNA를 평가합니다 (그림 3). 오프타겟(off-target) 부위를 예측합니다. in silico 과정(단계 5)을 통해 예측된 잠재적 오프타겟 부위가 적고, 절단 효율이 적절한(indel%가 10-30% 사이인) sgRNA를 사용하여 전기천공법으로 hiPSC에 형질전환시...

CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/CAS(CRISPR-associated) 시스템과 같은 게놈 편집 도구는 인간 유도 만능 줄기세포(hiPSC)의 유전자 표적화 효율성을 크게 향상시켰습니다. 이 원고는 CRISPR/Cas 시스템 보조 상동 재조합을 사용하여 계통 특이적 hiPSC 리포터를 생성하는 프로토콜을 설명합니다.

hiPSC 신경 리니지 특정 올림피아 기자의 효율적인 생성 사용 CRISPR / Cas9 및 Cas9 더블 Nickase 시스템

Gene targeting is a critical approach for characterizing gene functions in modern biomedical research. However, the efficiency of gene targeting in human ...

본 절차의 전반적인 목표는 CRISPR Cas9 매개 상동 재조합을 이용하여 계통 특이적 인간 유도만능줄기세포(H-I-P-S-C) 넉인 리포터를 생성하는 것입니다. 이는 먼저 타겟팅 벡터를 설계하고 구축함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 CRISPR Cas9 시스템 또는 Cas9n 이중 닉케이스(double Nickase) 시스템을 위한 단일 가이드 RNA를 설계하고 구축하는 것입니다.이후 2 93 FT.Cells에 단일 가이드 RNA와 CAS nine 발현 벡터를 공동 transfection하고, DNA를 추출 및 증폭하여 T seven ENDONUCLEASE one assay로 평가합니다. 마지막 단계는 잠재적인 오프타겟 부위에 대한 in silico 예측을 수행하는 것입니다. 최종적으로 HI PSCs에 타겟팅 벡터와 CRISPR Cas nine 시스템 구성 요소를 transfection하여 신경 계통 노크인 리포터 세포주를 제작합니다.이 기술이 기존의 전통적인 상동 재조합과 같은 방법들에 비해 갖는 주요 장점은 CRISPR-Cas9 매개 유전자 타겟팅의 타겟팅 효율이 훨씬 더 높다는 점입니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자는 단일 gRNA를 설계하는 데 어느 정도 연습이 필요하므로 어려움을 겪을 수 있습니다.CRISPR Cas nine 개념이 유전자 편집에 도입된 지 얼마 되지 않았고 새로운 온라인 리소스 도구들이 활용되고 있기 때문에, 단일 가이드 RNA 설계 및 오프 타겟 사이트의 물리적 예측 단계는 학습하기 어렵습니다. 따라서 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 계통 특이적 마커가 결정되면, 해당 유전자의 게놈 서열을 찾아 이에 따라 상동성 암(homology arms)을 설계하십시오. 본 예제에서는 ALDH1L1 게놈 유전자좌가 사용됩니다.타겟팅 컨스트럭트는 정지 코돈 바로 앞의 게놈 서열 하단에 GFP를 서브클로닝하여 제작하며, 이는 자가 절단 2A 펩타이드 서열로 연결됩니다. 리포터 하단에 F-fluxed neomycin 카세트와 같은 양성 선택 카세트를 추가하고, 3프라임 상동성 팔(homology arm) 외부에 thymidine kinase와 같은 음성 선택 카세트를 포함합니다. 리포터로 제작할 계통 특이적 마커를 결정하는 것으로 이 절차를 시작하십시오. 본 시연에서는 LDH1 L1이 사용되었습니다. NCBI 데이터베이스에서 cDNA 서열을 복사하십시오.인간 blatt

efficient-generation-hipsc-neural-lineage-specific-knockin-reporters

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

프로토콜은 iCRISPR 플랫폼을 사용 hPSC 돌연변이 라인을 생성하고 설명하는 글루코스 응답 형 β 세포로 hPSCs 차별화. hPSC 지시 분화와 게놈 편집 기술을 결합하면 인간 발달 및 질병 진행의 계보 결정의 역할의 체계적인 분석을위한 강력한 플랫폼을 제공합니다.

인간의 췌장 개발에 리니지의 결정 요인을 들여다보기위한 게놈 편집 및 hPSCs의 감독 차별화

체세포를 유 전적으로 조작하는 능력의 최근 진보는 기본 및 응용 연구에 큰 가능성을 안겨줍니다. 여기, 우리는 선택 마커의 사용 여부에 관계없이 포유류 세포주에서 CRISP / Cas9 생성 녹아웃 생산 및 스크리닝을위한 두 가지 접근법을 제시한다.

포유류 세포에서 CRISPR / Cas9 매개 유전자 knockouts의 선택 의존 및 독립적 생성

이 CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins 및 수정된 된 특성을 사용 하 여 편집 다음 프로토콜 자세히 설명 발자국 없는 유도 만능 줄기 세포 (Ipsc)의 세대 급지대 무료 조건에서 인간의 췌장암 세포에서 단일 셀 복제합니다.

효율적인 생성 및 급지대 무료 Ipsc CRISPR Cas9 시스템을 사용 하 여 인간의 췌 장 세포에서의 편집

프로토콜에 대 한 빠른 마우스에서 유전자 장애 CRISPR/Cas9-중재 하 고 인간의 기본 조 혈 모 세포가이 문서에서 설명 하는. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins sgRNAs 녹음 방송 생체 외에서 그리고 상업적인 Cas9를 통해 생성 된 electroporation 통해 소개 된다. 높은 편집 효율성 제한 시간 및 금융 비용으로 달성 된다.

CRISPR/Cas9에 의해 Murine 인간과 조 혈 조상 세포의 고효율 유전자 장애

설명된 것은 CRISPR/Cas9 시스템에 의한 뮤린 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC)의 고효율 게놈 편집을 위한 프로토콜로 조혈 시스템 별 유전자 수정을 통해 마우스 모델 시스템을 신속하게 개발합니다.

질병 모델에서 조혈 세포의 연구를 위한 렌티바이러스 CRISPR/Cas9 매개 게놈 편집

이 프로토콜은 인간 다능성 줄기 세포에서 CRISPR-CAS9를 사용하여 정의된 이형 이형 또는 동형접합 뉴클레오티드 변화의 생성을 용이하게 하는 방법을 제공한다.

인간 다능성 줄기 세포에서 CRISPR-CAS9를 사용하여 정의된 게놈 수정 생성

여기에서는 piggyBac계 공여 플라스미드와 Cas9 nickase 돌연변이체를 이용한 인간 만능줄기세포에서 원활한 유전자 편집을 위한 상세한 방법을 설명한다. 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)에서 간세포 핵 인자 4 알파 (HNF4α) 유전자좌의 엑손 8에 2 점 돌연변이가 도입되었다.

원활한 게놈 편집을 사용하여 인간 만능 줄기 세포에 점 돌연변이 도입

이 프로토콜은 형광 기자 및 세포 분류를 사용하여 대식세포 및 T 세포주에서 노크-인 실험을 단순화합니다. 2개의 플라스미드는 면역 세포에 있는 Rosa26 메뚜기에서 영구적으로 통합되는 EBFP2를 표현하는 EBFP2를 표현하는 상동성 재조합 기증자 플라스미드와 CRISPR/Cas9- 및 DsRed2 표현 플라스미드와 균등하게 재조합 기증자 플라스미드인 이러한 단순화된 노크-인 실험에 사용됩니다.

CRISPR/Cas9 및 대식세포 및 T 세포주에서 세포 분류에 의한 유전자 노크인

현재 프로토콜은 유전자 카세트 knock-in 및 floxed 마우스를 효율적으로 생산하기 위한 CRISPR-Cas9 및 기증자 DNA의 접합체 미세주입을 설명합니다.

생쥐에서 유전자 카세트 knock-in 및 Flox 대립 유전자를 생성하기위한 접합체 미세 주입

CRISPR 관련 프로토콜이 점점 더 유용해지고 접근성이 높아짐에 따라 특정 실험 조건에서 복잡성과 장애물이 여전히 발생할 수 있습니다. 이 프로토콜은 CRISPR/Cas9을 사용하여 수용체 상호 작용 세린/트레오닌-단백질 키나아제 1(RIPK1/RIP1) 녹아웃 인간 세포주를 생성하는 방법을 간략하게 설명하고 이 과정에서 직면할 수 있는 잠재적인 문제를 강조합니다.

CRISPR-Cas9 시스템을 사용한 RIP1 Knockout U937 세포주 생성

THP-1 세포주는 다양한 생물학 관련 연구 분야에서 인간 단핵구/대식세포의 기능을 조사하기 위한 모델로 널리 사용됩니다. 이 논문에서는 효율적인 CRISPR-Cas9 기반 엔지니어링 및 단일 세포 클론 분리를 위한 프로토콜에 대해 설명하여 강력하고 재현 가능한 표현형 데이터를 생성할 수 있습니다.

THP-1 세포의 전기천공법 기반 CRISPR-Cas9 매개 유전자 녹아웃 및 단일 세포 클론 분리

배우세요 CRISPR/Cas9 및 Cas9 더블 니카제 시스템을 사용하여 hiPSC 신경 리니지 특정 녹인 리포터를 효율적으로 생성하는 방법을. 이 기술은 동원 재조합을 통해 유전자 표적 효율성을 높여줍니다.

hiPSC 신경 리니지 특정 올림피아 기자의 효율적인 생성 사용 CRISPR / Cas9 및 Cas9 더블 Nickase 시스템

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