Name: 배양 된 HL-1 심방 근육 세포 단층의 전압 및 칼슘 듀얼 채널 광학 매핑 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: 배우세요 HL-1 심방 세포 단층에서 전압 및 칼슘 듀얼 채널 광학 매핑 기법을 사용하여 심장 전기생리학적 특성을 동시에 시각화하고 분석하는 방법을.

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우리는 HL-1 세포 및 세부 유지 보수 프로토콜을 제공하기 위해 박사 Claycomb에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 또한 우리의 듀얼 채널 광학 매핑 시스템에 대한 몇 가지 액세서리를 만드는 그의 도움을 셀 영화 씨와 피트 카론를 생성하는 그들의 도움 씨 엘레나 카리 박사 세스 Robia에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 (XA에 10GRNT3770030 &amp; 12GRNT12050478) 미국 심장 협회 (American Heart Association), 국립 보건원 (XA에 HL113640) 및 (XA에) 로욜라 대학 연​​구 개발 기금에 의해 지원되었다.

1. 솔루션 준비 <ol><li> 노르 에피네프린 (NP) 솔루션 <ol><li> . 정제 밀리-Q (MQ) 물 25 ㎖에 30 mM의 아스코르브 산 (0.1475 g의 아스코르브 산 25 ml의에 순이익 40 mg을 녹이고 노르 에피네프린 (NP)은 민감한 빛 때문에이 솔루션을 준비하는 동안 직사광선에 노출을 피하십시오. </li><li> 0.22 μm의 주사기 필터 NP 용액 필터. -20 ° C에서 1 ml의 멸균 마이크로 튜브에 솔루션 및 저장 나누어지는. 냉동 후에, NP는 한 달 동안 안정하다. </li></ol></li><li> 보충 세척 및 최종 Claycomb 미디어 <ol><li> Claycomb 매체 43.5 ㎖로 시작하여 소 태아 혈청 (FBS) 5 ㎖, 페니실린 / 스트렙토 마이신을 0.5 ㎖, NP 0.5 ㎖의 1로 보충 : 최종 보충 Claycomb 배지 50 mL로 L 글루타민 희석 100. Claycomb 매체가 빛에 민감하기 때문에이 솔루션을 준비하는 동안 직사광선에 노출을 피하십시오. </li><li> 한모금과 동일한 조리법을 사용하여 세척 Claycomb 매체를 준비제외 대상으로 실시 Claycomb 매체는 5 % FBS를 추가하고 NP 및 L 글루타민 요소를 생략. 참고 : 직사광선에 노출하지 않고 4 ℃에서 저장 될 때 보충 최종 워시 Claycomb 미디어는 2 주 동안 좋다. </li></ol></li><li> 콩 트립신 억제 솔루션 <ol><li> 칼슘 - 무료 및 마그네슘이없는 둘 베코의 인산염 완충 생리 식염수 100 ㎖ (PBS)로 대두 트립신 억제제의 25 mg을 녹인다. </li><li> 0.22 μm의 주사기 필터를 사용하여 용액을 필터. 참고 : 4 ° C에서 저장 될 때 멸균 솔루션은 1 개월 안정적이다. </li></ol></li><li> 젤라틴 / 피브로넥틴 요리 코팅 용액 <ol><li> 0.02 % 젤라틴 있도록 MQ 물 500 ㎖ 중에 젤라틴 0.1 g을 녹이고. </li><li> 오토 클레이브 후, 0.02 % 젤라틴 199 ㎖ 중에 1 ml의 피브로넥틴을 희석하고 부드럽게 혼합한다. </li><li> 나누어지는 -20 ° C에서 젤라틴 별도의 튜브에 솔루션 및 저장의 6 ml의. </li></ol></li><li> 행크스 &#39;소금 솔루션 <ol><li> 파문을 사용하여판은, 염화나트륨 (136.9)의 KCl (5.366), KH 2 PO 4 (0.4409)의 NaH 2 PO 4 (0.4000), 황산 (0.8142), D-Glc를을 MQ 물 (밀리몰 / L)에 다음과 같은 염을 용해 (5.051)의 NaHCO3 (4.162), HEPES (5.042), 염화칼슘 2 (1.261). </li></ol></li><li> 칼슘에 민감한 염료 (Rhod2) 솔루션 <ol><li> Rhod2는 -20 ° C에서 원액 저장을 염색 할 DMSO 20 % 플루로 닉 F-127의 400 μL에 Rhod2 건조 분말 1 mg을 희석. </li><li> 실험을 시작하기 전에 최종 작업 솔루션을 만들기 위해 1000 행크스 &#39;소금 용액이 원액 1을 희석. </li></ol></li><li> 전압에 민감한 염료 (Rh237) 솔루션 <ol><li> -20 ° C에서 원액 및 저장을 할 DMSO 2 ㎖로 Rh237 5 ㎎을 희석. 실험을 시작하기 전에 최종 작업 용액을 만들기 위해 1000 행크스 식염수 : 원액 1 희석. </li></ol></li></ol> &amp; #(160); 참고 : 1-4 솔루션은 약간의 수정과 Claycomb HL-1 세포 배양 프로토콜을 기반으로합니다. 2.과 Passaging 및 배양 HL-1 심방 근육 세포 Coverslips는 상 참고 : HL-1 세포 박사 Claycomb (루이지애나 주립 대학)에서 얻을 수 있습니다. <ol><li> T25 플라스크에 HL-1 세포 성장과 매일 보충 Claycomb 중간의 5 ml로 공급. 통로는 T25에서 세포 Claycomb HL-1 세포 배양 프로토콜 (후술) (10)에있어서 5 일마다 형틀. </li><li> 24 시간 T25 플라스크에서 세포 전에 12-well 배양 판에 장소 라운드 된 커버 (20mm 직경) 계대 배양 한 다음 37 ℃에서 하룻밤 젤라틴 / 피브로넥틴로 된 커버를 커버 할 완전히 합류와 준비가되어 있습니다. </li><li> 다음 날, 기음과 문화 판에서 젤라틴 / 피브로넥틴을 취소하고 잘 각각 보충 최종 Claycomb 매체의 1.5 ml로 교체합니다. </li><li> T25의이 배양에서 분할 세포대기음이 합류 문화를 포함하는 T25 플라스크 매체는 37 ° C에서 PBS 짧게 문화를 씻어 하루 5에서 전체 합류에 도달 한 후 전자 플라스크. </li><li> PBS 및 기음 셀과 직접 접촉을 피하기 위해 T25 플라스크의 바닥에 트립신 / EDTA를 피펫 팅하여 37 ° C에서 3 ml의 0.05 % 트립신 / EDTA를 추가한다. 1 분 동안 37 ° C에서 품어. </li><li> 흡인에 의해 트립신 / EDTA를 제거하고 T25 플라스크 당 다른 트립신의 1.3 ㎖ / EDTA를 추가합니다. 1 분 동안 실온에서 배양한다. 현미경으로 검사하고 세포가 여전히 플라스크에 부착하는 경우, 완전히 남아있는 세포를 이동시키다 누릅니다. </li><li> 15 ㎖의 원심 분리 관으로 플라스크에서 세포와 세포를 전송에 대두 트립신 억제제의 1.3 ML을 추가합니다. 워시 Claycomb 매체의 5 mL를 빈 플라스크를 씻어. 15 ㎖의 원심 분리기 튜브에 세포에 린스를 추가합니다. 5 분 동안 500 XG에 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 뜨는을 기음과 원심 분리 한 후 세포 펠렛을 다시 중단보충 최종 Claycomb 배지 6 ㎖ 중의. </li><li> 세포 계대의 세포 현탁액 0.5 ml로 12- 웰 플레이트의 각 웰을 시드. 매일 신선한 보충 최종 Claycomb 매체와 세포를 공급. 주 : 밀접 세포의 성장을 모니터링 전형적 세포 단층을 4 일째에 합류 상태에 도달하고 자발적인 활동이 계속 표시. 이후, 배양 된 단층은 하루 4-5 광학 매핑을위한 준비가 될 것입니다. </li></ol> 셀 3.로드 칼슘 및 전압에 민감한 염료 <ol><li> 광학적 맵핑 연구 부드럽게 12 웰 세포 배양 플레이트로부터 커버 슬립을 제거하고 행크스 식염수로 세정. </li><li> 칼슘 민감성 염료 Rhod2으로 세포를 염색하기 위해, 3 ㎖와 커버 슬립에서 세포 단층을 부화 산소를 30 분 동안 수욕에서 37 ° C에서 Rhod2 작업 용액 (5 % CO 2 / 95 % O 2 가스로 버블 링) . </li><li> V m에 민감한 염료와 세포를 얼룩Rh237는 또 다른 15 분 동안 수조에서 37 ° C에서 산소화 Rh237 작업 용액 3 ㎖에 Rhod2로드 셀 단층 몰입. </li></ol> 4. 듀얼 채널 광학 매핑 <ol><li> 거꾸로 형광 현미경에 순환 챔버로, V의 m과 칼슘 염료로 두 번 스테인드 세포 단층을 놓습니다. 35 ± 1 ℃에서 셀 챔버의 온도를 유지하기 위해 가열 된 순환 시스템을 사용한다. 챔버에 걸쳐 조심스럽게 0.3 ° C의 구배를 방지하기 위해 상기 챔버를 통해 순환하는 흐름의 속도를 조절하여 관류 액의 온도를 제어한다. <ol><li> V의 m / CA 신호를 기록하기 전에, 이전의 염색 공정에서 잔존 염료를 제거하기 위해 약 5 분 동안 신선한 행크스 용액으로 세포 단층을 세척한다. </li></ol></li><li> 행크스 염 용액과 SILV 가득 유리 피펫으로 이루어지는 쌍극 전극을 이용하여 페이스 건강한 세포 단층어 이전으로 피펫 팁 주위 코일 와이어 12,17 설명했다. </li><li> 약 1 MV를 서성 거려 임계 값을 기대 2 밀리의 200 ~ 500 밀리 초 펄스 폭의 사이클 길이의 페이스 건강한 세포 단일 층. 주 : 단층 배양의 각 배치에 대해 적어도 2 개의 비 처리 된 단층은 셀 배치의 조건을 검사하는 데 사용되어야한다. 건강한 제어 단일 층은 200 ~ 500 밀리의주기 길이에 전기 페이싱에 의해 포착 할 수 있어야합니다. 제어 단층 전기적으로 진행되어야하지 않으면,이 셀 전체 일괄 광학적 맵핑 실험에 적합하지 않을 수 있다는 것을 시사한다. </li><li> V의 m 및 CA 민감한 염료 모두를 여기 시키는데, 여기 필터 (파장 510 ㎚ / 40) 및 다이크로 익 미러 (561 ㎚)과 결합 된 LED 광원 (520 nm 파장)를 사용한다. <ol><li> V m을 구성 요소로 다이크로 익 미러 (594 ㎚)과 칼슘 성분과 40X 목표 및 분할을 통해 세포에 의해 방출되는 형광 신호를 수집합니다.대역 통과 필터와 칼슘 채널에서 긴 통과 필터 (700 ㎚) 및 출사 광 V의 m 채널에서 방출 된 광을 필터 (40분의 585 ㎚). </li><li> 두 개의 CCD 카메라 (; RedShirt 이미지 80 X 80 픽셀, 1000 FPS)를 사용하여 필터링 된 형광 빛을 수집합니다. </li><li> 염료 광표백을 방지하기 위해, 노광 시간을 제한하기 위해 각 시야마다에 2 초 미만에 대한 기록을 만든다. 여기에, 일반적으로 이미지를 각각의 단층에 대 한 4 개의 서로 다른 영역. </li></ol></li></ol> V m 또는 칼슘 녹음 5. 데이터 처리 <ol><li> 모두 V의 m 및 CA 신호 (80 X 80 픽셀)의 경우, 배경 잡음을 줄이기 위해 다른 기록 시점에서 1 휘도 값으로 강도 스물 다섯 (5 × 5)의 값이 인접한 화소의 평균. 주 : 데이터를 평균화 한 후, 개별 활동 전위 또는 CA 과도의 각 기록 시점 평균화 × 16 16 강도 값들을 평균화 포함하는 데이터 매트릭스 (수득50 ㎛의 공간 해상도와 데이터 채널). </li><li> V m의 기록 또는 CA 신호의 활성화 시간 (AT)를 정의. <ol><li> 전술 한 바와 같이 개별 활동 전위 또는 CA 과도의 활성화 시간 (AT)를 정의하기 위해, V의 m 또는 주문품 MATLAB 기반 알고리즘을 사용하여 칼슘 신호의 피크 진폭의 50 %의 시간을 결정한다. (12) </li><li> 수동으로 프로그램 분석 중 발생할 수있는 오류를 제거하기 위해 분석의 AT를 교정. </li><li> 행렬에서 정의 저장소 사용되는 소프트웨어에 각각 기록 된 활동 전위 칼슘 과도의 (16 × 16 데이터 채널 평균). </li></ol></li><li> 이전에 약간의 수정과 함께 설명 된 바와 같이 12, 18, ​​20, 22 필드 벡터 분석 방법을 사용하여 AT 행렬에 활동 전위 또는 칼슘 과도 전도 속도 (CV) 벡터를 계산한다. <ol><li> (5 × 데이터를 그 지점에서 주변에 데이터 채널의 상대적인 CV 벡터를 계산; 도 5는 이웃 MATLAB 프로그램 (12, 18) 내에서 최소 제곱 알고리즘을 이용하여) 표면 AT 활성화 시간 (다항식의 매끄러운 표면을 시뮬레이션하기 위해) 데이터 채널을 평균화. </li><li> 아래의 수식을 사용하여 전도 벡터를 계산 포뮬러 1 : <img alt="식 (1)" fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/52542/52542eq1.jpg" /> 화학식 2 : θ θ를 (DY / dT를) / (DX / dT를)] 주 : Ve로는 X 축 및 Y 축에 투영 CV 벡터이고; DX / dT를는 X 축에 CV 벡터의 투영이고; DY / dT를는 Y 축에 CV 벡터의 투영이다. T는 AT면이고; X, Y 좌표의 2-D 참조; X = T ∂T / ∂x는 X에 대해 T의 편미분이고; T의 Y = ∂T / ∂y는 Y에 대하여 T의 편미분이고; CV θ는 벡터의 최종 방향이다. </li><li> 나침반에 10도 섹터를 커버 각각 36 경로,에 AT 행렬의 그룹 모든 벡터. &lt;/ 리&gt; <li> (36) 전도 경로 중 CV 벡터의 최대의 인구를 포함하는 경로를 선택합니다. 단일 층의 CV를 나타 내기 위해이 경로의 평균 CV를 계산합니다. </li></ol></li></ol> 웨이브 프론트 전파 6. 시각화 <ol><li> MATLAB 소프트웨어를 사용하여 피크 값에 대해 상이한 기록 된 시점에서 각각의 활동 전위 또는 CA 과도의 신호 강도를 정규화한다. </li><li> 일시적 사용 MATLAB 소프트웨어의 16 × 16 매트릭스의 강도에 기록 된 모든 시점의 정규화 된 강도 데이터를 저장한다. </li><li> surf.m 기능을 사용하여 각 기록 시점의 저장 강도 매트릭스에서 색상 코딩 된 강도 맵을 구축합니다. 참고 : 강도지도에서 빨간색 V m 또는 칼슘 신호의 높은 강도를 나타내며, 파란색 형광 신호의 낮은 강도를 반영한다. </li><li> avifile.m 기능을 사용하여 .avi 파일을 만듭니다. </li><li> 모든 I 절감addframe.m 함수를 사용하여 활동 전위 또는 CA 과도 상이한 기록 시점에서지도 ntensity. 주 :이 시점에서, V의 m 및 CA 전파 개의 분리 AVI 파일이 생성 될 것이다. </li></ol>

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이해 상충이 선언되지 않았습니다.

이 문서에서는 칼슘 및 전압에 민감한 형광 염료로 염색 배양 HL-1 심방의 심근 세포 단일 층에 광학 매핑의 주요 측면에 대해 설명합니다. 또한, 최적의 HL-1 세포 단층, 매핑 장치의 설정을 배양하는 배양 된 단층을 매핑 및 데이터 분석을 포함한다. 성공적으로 배양 된 세포를 매핑, 키는 균일하게 분포 된 세포 단층을 제조하는 공정이다. 커버 슬립에의 세포를 파종 할 때, 균일하게 세포를 분산해야합니다. 이 가장 전기 페이싱에 응답으로 항상 완벽하게 성장하고 완전하게 융합 세포 단일 층을 매핑합니다. 이는 염료를로드하는 동안 산소 세포를 유지하는 것도 중요하지만, 산소 버블이 죽이거나 커버 슬립에서 그들을시키다 수 있으므로 셀과 직접 접촉해서는 안된다. 염료 concentrati을 증가시키면서, 염료 농도를 낮추고 신호 크기를 감소시키고 신호 대 잡음 비율을 감소시킬 것이다 광 강도를 감소온 신호 크기를 증가시킬뿐만 아니라, 소음을 증가 광 강도를 강화. 이 때문에, 형...

고유 칼슘 (Ca) 및 전압 (V의 m) 듀얼 채널 광학 매핑 기술 1-5 동시에 그대로 마음과 배양 세포 단일 층에 모두 V의 m과 칼슘 신호를 기록 할 수있는 효율적인 도구로 부상하고있다. 이 기술은 가능한 더 부정맥의 전기 생리 기본 메커니즘을 이해하기 위해 칼슘 과도 활동 전위와의 관계에 관한 강력한 정보를 얻을 수있다. 배양 세포 단일 층은 심장 전기 생리학 및 부정맥의 기본 메커니즘을 연구하는 유용한 셀룰러 모델로 입증했다. 4,6-8 HL-1 세포가 잘 특성화 심방 근육 세포 배양 라인입니다. HL-1 세포는 형태 학적, 전기 생리 및 성인 심방 근육 세포의 약리학 적 특성을 포함하는 차별화 된 유전자형과 표현형을 유지한다. 이 세포들은 importa을 포함한 심장 유전자와 단백질을 표현NT 심장 이온 채널 (즉, L- 및 T 형 칼슘 채널) 9 sarcomeric 수축성 단백질의 성숙 이성체가 정상적으로 등의 성인 심방 근육 세포에서 발견 우리는 이전에보고했다. (10-13) 또한, HL-1 세포가 될 수 2 차원 (2-D) 심근 세포의 단층을 형성하기 위해 배양 하였다. 따라서, 배양 된 HL-1 단층을 사용할 때의 장점은 1) 상대적으로 낮은 비용과 더 쉽게 분리 및 일차 배양 신생아 심근 세포보다 심근 세포 배양 라인을 유지하기; 2) 세포가 단층은 심장의 3-D 구조로 인한 구조의 복잡성을 감소시킨다; 3) 세포 단층은 그대로 심장에서 발생하는 간질 섬유화의 간섭을 제거 할 수 있습니다. 이것은 간질 섬유 아세포 행렬의 간섭없이 근세포의 특정 그룹의 전기 생리 학적 기능을 절개하는데 사용될 수있다; 막 다른 골목에서 약리학 또는 유전자 조작에서 기능적 결과 4) 평가여 체계적인 세포 단층을 효과적으로 달성 할 수있다. 따라서, HL-1 세포는 심근 세포 생리학의 다양한 측면뿐만 아니라 페이싱에 의한 비정상적인 전기적 활동을 연구하는데 널리 사용되는 셀룰러 모델이되고있다. 외부에 응답 13-16 그러나, 특별한 취급 및 관리 문화에 필요한 건강한 세포 단일 층 광학 매핑 연구를위한 전기 서성 거려. 또한, 이중 형광 염료 염색 과정은 쉽게 세포 배양 합류 단층의 무결성을 손상시킬 수있다. 따라서, 배양 HL-1 단일 층에서 수행 V의 m / CA 듀얼 채널 광학 매핑은 큰 도전이었다. 이 방법의 목적은 성공적으로 배양 HL-1 단층 듀얼 채널 광 맵핑을 수행하기위한 주요 단계를 제공하는 것이다. 여기에서 우리는 HL-1 세포 단층 준비, 배양 세포 단층의 듀얼 채널 광학 매핑 및 매핑 데이터 처리에 최적화 된 프로토콜에 대한 광범위한 정보를 제공하고 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Rhod2 건조 분말</td><td>AAT Bioquest</td><td>21062</td><td></td></tr><tr><td>pluronic</td><td>AAT Bioquest</td><td>20050</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>Rh237</td><td>Invitrogen</td><td>S-1109</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>HEPEs</td><td>시그마</td><td>H3375</td><td></td></tr></tbody></table>

배양 된 hl-1 심방 근육 세포 단층의 전압 및 칼슘 듀얼 채널 광학 매핑

Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

광학 매핑은 하트 생체 EX 모두 그대로에 배양 심근 세포 단층에서 심장의 전기 활동을 검출하는 유용한 기술로 입증되었다. HL-1 세포는 심장 생리학 널리 다양한 양상을 연구하기위한 2 차원 모델 세포로서 사용되어왔다. 그러나, 배양 HL-1 심방 세포 단층의 한 시야에서 동시에 광학적지도 칼슘 (Ca) 과도 및 활동 전위에 큰 도전이었다. 특별한 처리 및 관리에 전기적 및 광학적 캡처 매핑 될 수 건강한 세포를 준비 할 필요가 있기 때문이다. 따라서, 우리는 듀얼 채널 광학 매핑을위한 최적의 작업 프로토콜을 개발했습니다. 이 논문에서는 듀얼 채널 광 매핑 실험을 수행하는 방법을 상세히 설명 하였다. 이 프로토콜은 부정맥 개발 활동 전위의 전파 및 CA 역학의 이해를 향상시키는 유용한 도구이다.

영화 1에서 입증 된 바와 같이 배양 합류 단층는 일반 고유 리듬을 나타낸다. 우리는 다음 완전히 합류 HL-1 단층에서 V의 m / CA 듀얼 채널 광학 매핑을 수행 하였다. 그림 1a는 기록 하나에서 V의 m과 칼슘 신호의 예 흔적을 보여줍니다 이길. 균일하게 전파 V의 m 및 듀얼 채널 광 매핑 시스템을 이용하여 칼슘 신호의 대표적인 등시성지도는도 1b 및도 1c에 도시되어있다. 균일 활동 전위 전파 및 CA 과도의 대표적인 이미지는 연대순 동일한 HL-1 단층 배양에서 얻었다. 마지막으로, 영화 2와 3은 HL-1 융합 단층에 균일하게 전파 활동 전위 (영화 2) 칼슘 과도 (동영상 3)의 애니메이션 예를 제공합니다. <p class="jove_content" fo:keep-...

이 기사에서는 배양된 HL-1 심방 세포 단층에서 이중 채널 광학 매핑을 수행하는 데 사용되는 기술에 대해 설명합니다. 이 고유한 프로토콜을 사용하면 배양 단층의 전기생리학적 특성을 자세히 감지하고 분석하기 위해 동일한 영역에서 칼슘(Ca) 및 전압(Vm) 활성을 동시에 시각화할 수 있습니다.

배양 된 HL-1 심방 근육 세포 단층의 전압 및 칼슘 듀얼 채널 광학 매핑

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte ...

본 실험 과정의 전반적인 목적은 칼슘 및 전압 염료가 모두 로딩된 HL one 심방 단일층에서 막 전위와 칼슘 과도 현상을 동시에 매핑하는 것입니다. 이를 위해 먼저 커버슬립 위에 HL one 세포를 배양하여 적절한 합류 밀도에 도달하게 합니다. 두 번째 단계는 세포 내에 칼슘 및 전압 민감성 염료를 로딩하는 것입니다.다음으로, HL-1 단일층을 양극 전극으로 자극합니다. 마지막 단계는 형광 현미경을 통해 활동 전위와 칼슘 과도 신호를 기록하는 것입니다. 최종적으로, 활동 전위와 칼슘 과도 추적선을 종합하여 시간에 따른 합쳐진 단일층 전체의 신호 전파를 보여줄 수 있습니다.이 방법은 칼슘, 일시적 변화(transients) 및 활동 전위가 어떻게 연관되어 있는지와 같은 심장 전기생리학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 다양한 약물 처리를 거친 배양된 HL-1 세포의 전기생리학적 특성에서, 이 방법은 활동 전위 및 칼슘 일시적 변화의 전파 패턴에 대해 미시적 수준의 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한, 병리적으로 리모델링된 인간의 심장이나 부정맥 유발 동물 모델과 같은 생물학적 시스템에도 적용할 수 있습니다.일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자들은 hhl one 세포가 마우스 심장 표현형을 유지하며 배양하기 까다롭고 세심한 최적화가 필요하기 때문에 어려움을 겪습니다. 배양 계대 및 단층 배양을 위한 프로토콜이 필요합니다. 먼저 텍스트 프로토콜에 명시된 대로 실험에 필요한 모든 스톡 용액을 제조하고, HL one 세포를 T 25 플라스크에서 배양하며 매일 5 mL의 신선한 보충된 claycomb 배지로 교체하십시오.세포는 HL-1 세포가 완전히 합류(confluency)하기 24시간 전인 5일 차에 계대 배양할 준비가 되어야 합니다. 12웰 배양 플레이트의 각 웰에 직경 20 mm의 원형 커버슬립을 넣습니다. 각 웰에 젤라틴 피브로넥틴 용액 1 mL를 첨가하여 커버슬립을 코팅한 후, 플레이트를 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.다음 날 배양 플레이트의 웰에서 젤라틴 피브로넥틴 용액을 흡입하여 제거한 후, 각 웰에 보충된 최종 clay home 배지 1.5 milliliters를 첨가합니다. 이어서 HL one 세포가 들어 있는 T 25 플라스크에서 배지를 흡입하여 제거하고, 37 °C의 PBS로 배양물을 짧게 세척합니다. 플라스크에서 PBS를 흡입하여 제거하고, 세포가 흐트러지지 않도록 T 25 플라스크 바닥에 trypsin EDTA 용액 3 milliliters를 첨가합니다. 플라스크를 조심스럽게 내리고 회전시켜 세포가 용액으로 덮이게 한 다음, 플라스크를 37 °C 인큐베이터에 1분 동안 둡니다.다음으로, 세포가 손상되지 않도록 배양액에서 trypsin EDTA 용액을 조심스럽게 흡입하여 제거합니다. 그런 다음 플라스크에 trypsin EDTA 용액 1.3 mL를 추가로 넣습니다. 플라스크를 실온에서 1분 더 배양합니다.현미경으로 세포를 관찰하여 플라스크 표면에서 세포가 떨어져 나왔는지 확인합니다. 여전히 부착되어 있는 세포가 있다면 플라스크를 가볍게 두드려 떼어냅니다. 모든 세포가 떨어져 나오면, 세포에 대두 트립신 억제제 용액 1.3 milliliters를 첨가한 후, 세포를 15 milliliter 원심분리 튜브로 옮깁니다.빈 플라스크를 5 mL의 세척 배지로 헹구고, 헹군 액을 튜브 내의 세포에 추가합니다. 튜브를 500 ×g에서 5분 동안 원심분리한 후, 세포 펠릿이 흐트러지지 않도록 상층액을 흡입하여 제거합니다. 세포 펠릿을 6 mL의 보충 배지에 부드럽게 재부유시킵니다.배양 플레이트의 각 웰에 세포 현탁액 0.5 milliliters를 첨가합니다. 세포가 confluence 상태가 될 때까지 매일 배지를 교체하며 37 degrees Celsius에서 플레이트를 배양합니다. 작업용 염색액을 준비하려면 rhodamine 123 및 RH 123 스톡 용액을 Hank's salt solution으로 1:1000 비율로 희석합니다.현미경으로 12-웰 배양 플레이트를 관찰하여 HL-1 세포가 합쳐졌는지(confluent) 확인하십시오. 일반적으로 세포를 파종한 지 4일 후 세포가 합쳐지면, 웰에서 커버슬립을 조심스럽게 제거하고 헨크 염 용액(Hank's salt solution)으로 커버슬립을 헹굽니다. 헹군 커버슬립을 로드 2(road two) 워킹 솔루션 3 mL가 담긴 35 mm 페트리 접시에 넣으십시오.페트리 접시를 37 °C 항온수조에 넣고, 산소 공급을 위해 용액에 가스를 지속적으로 버블링합니다. 칼슘 민감성 염료로 세포를 염색하기 위해 30분 동안 배양합니다. 그 다음 커버슬립을 3 mL의 산소화된 RH 2 37 용액으로 옮겨 15분 동안 배양합니다.이제 세포 단일층이 칼슘 및 전압 민감성 염색약 모두로 염색되었을 것입니다. 이미징을 위해, 이중 염색된 세포 단일층이 부착된 커버슬립을 도립 형광 현미경의 순환 챔버에 배치하십시오. 챔버 전체의 온도 구배가 0.3 °C 이하로 유지되도록 챔버 내 유속을 조절하여 온도를 35 °C로 유지하십시오.세포 단층에 Hank 염 용액을 5분 동안 흘려 과잉 염료를 제거합니다. 단층을 세척한 후, 세포에 닿지 않도록 최대한 가깝게 용액 속에 양극 전극을 배치합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 단층의 상태를 테스트합니다.단일층을 부착합니다. 전극이 사이클당 최대 500 ms 동안 2 ms 폭의 펄스를 가하도록 설정합니다. 단일층에 페이싱을 하는 동안, 40배 대물렌즈로 세포를 촬영하고 칼슘 및 전압 민감성 염료를 여기시킵니다.excitation 필터 및 다이크로익 미러(dichroic mirror)와 결합된 LED 광원을 사용하여, 방출된 형광을 다이크로익 미러에 통과시켜 칼슘 및 전압 민감성 신호를 분리하고 두 대의 CCD 카메라로 형광 신호를 각각 수집합니다. 단층의 네 가지 서로 다른 영역을 촬영하여 전체 범위를 확보하고, 광퇴색(photobleaching)을 방지하기 위해 각 시야(field)당 신호 기록 시간을 2초 미만으로 유지하도록 주의하십시오.합류된 HL one 단층은 전극으로 자극을 주었을 때 규칙적인 수축 리듬을 보입니다. 500밀리초 주기의 HL one 단층 전기적 페이싱 단일 비트에 대해 전압 및 칼슘 신호를 기록하였습니다. 전압 신호의 시작은 칼슘 일시적 변화(calcium transient) 직전에 발생합니다. 반면 칼슘 신호는 전압 신호 표면보다 더 오래 지속됩니다.HL-1 세포 단층 전체의 전압 및 칼슘 형광 신호를 이용하여 강도 맵(Intensity maps)을 생성하였습니다. 200 millisecond의 시간 경과 동안, 파란색은 낮은 신호를, 빨간색은 높은 신호를 나타냅니다. 두 신호 모두 단층의 왼쪽에서 시작하여 단층의 오른쪽 방향으로 전파됩니다.시간이 지남에 따라, 활동 전위는 칼슘 신호 질량보다 훨씬 더 빠르게 전파되고 기저선으로 돌아옵니다. 적절하게 수행한다면 이 매핑 과정은 한 시간 내에 완료될 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때는 최적의 밀도를 가진 세포를 사용하고, 단층에 손상을 주지 않도록 페이싱 전극을 배치할 때 주의하는 것이 중요합니다.이 영상을 시청한 후, 칼슘 및 전압 민감성 염료를 모두 사용하여 광학 매핑이 가능한 HO 단일 심방 세포 단일층을 준비하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

voltage-calcium-dual-channel-optical-mapping-cultured-hl-1-atrial

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 문서는 파노라마 영상 시스템을 사용 Langendorff - perfused 토끼 마음에 광학 매핑 실험을 실시하기위한 기본 절차 및 듀얼 (전압과 칼슘) 이미징 양상을 설명합니다.

Langendorff - perfused 토끼 하트의 Multiparametric 광 매핑

그대로 고립 Langendorff에 transmembrane 잠재력 (VM)과 일시적인 세포 내 칼슘 (CAT)의 광학 매핑하는 동안이 종이 자세히 해부 절차를, 수단 설치, 그리고 실험 조건 마우스 마음을 perfused.

마우스 중심에 액션 후보와 칼슘 과도의 광학 매핑

이 문서에서는 랑겐 돌프 - 관류 토끼 심장의 상세한 프로토콜과 횡단 전위 (V 분)의 이중 광학 매핑 및 무료 내 근질 세망 (SR)에 필요한 장비 칼슘을 설명합니다. 이 방법은 그대로 심장에 직접 관찰 및 V (M)의 정량 및 SR 칼슘 역학 수 있습니다.

인트라 근질 그물 자리 칼슘의 광학 매핑<sup&gt; 2 +</sup&gt;와 랑겐 돌프 - 관류 토끼 심장에 막 횡단 잠재력

이 프로토콜 설명 electrophysiological murine atria는 높은 시간적, 공간적 해상도, 막 전압의 듀얼 녹음을 포함 한 광학 매핑 시스템을 활용 하 여 평가 하 고 캘리포니아2 + 에서 과도 프로그램 특수 전극 카 테 터를 통해 자극입니다.

고해상도 광학 매핑 Murine Atria electrophysiological 평가

우리는 뮤린 근세포를 분리하는 방법론과 동시 디지털 세포 기하학 측정을 통해 형광 광도계를 사용하여 sarcomere 단축 추적과 동시에 전압 또는 칼슘 흔적을 얻는 방법을 제시합니다.

고립 된 뮤린 심실 근세포의 광학 이미징

이 프로토콜은 전임상 약물 검사를 위해 인간의 심장 조각을 단면화 및 배양하는 절차를 설명하고 이러한 조각에서 동시에 세포간 전압 및 세포내 칼슘 신호를 기록하기 위한 광학 매핑의 사용을 자세히 설명합니다.

인간 조직형 심장 슬라이스의 이중 전압 및 칼슘 광학 매핑에 의한 전임상 심장 전극생리학 평가

여기서는 고속 모듈식 광혈약 시스템을 사용하여 유도된 다능줄기 세포 유래 심근세포로부터의 작용 잠재력의 광학 획득 및 특성화를 설명합니다.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포에서 단세포 광학 작용 잠재적 측정

마우스 모델을 사용하면 부정맥 발생의 주요 메커니즘을 연구 할 수 있습니다. 이를 위해 패치 클램프 측정을 수행하기 위해 고품질 심근 세포가 필요합니다. 여기에서는 역행 효소 기반 Langendorff 관류를 통해 쥐 심방 및 심실 근세포를 분리하는 방법을 설명하며, 이를 통해 칼슘 과도 현상과 L형 칼슘 전류를 동시에 측정할 수 있습니다.

Ca2+ 과도 현상 및 L형 칼슘 전류의 동시 측정을 위한 고품질 쥐 심방 및 심실 근세포의 분리

이 프로토콜은 높은 시간 및 공간 분해능으로 막관통 전압 및 세포 내 Ca2+ 과도 현상의 전기 생리학적 측정을 포함하여 카테콜아민성 다형성 심실 빈맥의 영향을 받는 야생형 및 녹인 동물에서 얻은 마우스 심장의 이중 염료 광학 매핑을 소개합니다.

Catecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia의 RyR2R2474S Knock-In 마우스의 심장에 대한 이중 염료 광학 매핑

빛을 사용하여 심장 세포와 조직을 제어하면 비접촉 자극이 가능하여 세포의 자연 상태와 기능을 보존할 수 있으므로 기본 연구와 치료 응용 분야 모두에 유용한 접근 방식이 됩니다.

비유전적 광학 자극을 통한 Ca2+ 전파를 연구하기 위한 심장 미세생리학적 시스템

배우세요 HL-1 심방 세포 단층에서 전압 및 칼슘 듀얼 채널 광학 매핑 기법을 사용하여 심장 전기생리학적 특성을 동시에 시각화하고 분석하는 방법을.

배양 된 HL-1 심방 근육 세포 단층의 전압 및 칼슘 듀얼 채널 광학 매핑

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