색채 금 나노 입자 분석에 적용 구조 전환 앱 타머를 선택하는 방법
February 28th, 2015
조정 가능한 엄격성 마그네틱 비드 선택 방법을 기반으로 저분자 타겟에 대한 구조 스위칭 압타머를 선택하기 위한 프로토콜이 제공됩니다. 구조 스위칭 특성으로 선택된 Aptamers는 설명된 금 나노입자 분석과 같이 표적의 존재를 알리기 위해 구조적 변화가 필요한 분석에 유용합니다.
다음 실험의 전반적인 목표는 표적 결합 시 압타머 확인의 변화를 신호로 신호화하여 작동하는 감지 플랫폼에서 인식 요소로 통합을 위한 구조 스위칭 apti를 생성하는 것입니다. 이는 비오틴화된 포획 프로브와 상보적인 DNA 라이브러리를 연쇄상구균 타빈(strep tabin) 코팅된 마그네틱 비드에 추가하여 비드 표면의 DNA 라이브러리를 고정화함으로써 달성됩니다. 다음으로, 자석을 용액에 적용하여 비드에 남아 있는 비결합 서열로부터 결합 서열을 분할합니다.
그런 다음 유지된 염기서열은 다음 선별 라운드를 위해 정제 및 증폭됩니다. 몇 차례의 선택 후 부정 선택 단계가 프로세스에 추가됩니다. 여러 차례의 선택 후, 선택된 aptr은 금 나노 입자 표적 검출 분석을 기반으로 표적 결합시 구조적 변화를 보여줍니다.
용액 기반 cell X와 같은 기존 기술에 비해 이 기술의 장점은 표적을 견고한 지지대에 고정시킬 필요가 없다는 것입니다. 따라서 이 기술의 함의는 개인의 생리적 상태에 대한 위험 평가에 있으며, 코르티솔이 스트레스의 지표이기 때문에 건강 문제를 평가할 수 있기 때문입니다. 이 프로토콜, 특히 표적 및 대조군을 위해 항상 새로 준비된 DNA 솔루션을 사용하십시오.
DNA를 준비할 때는 특별한 주의가 필요합니다. DNA 라이브러리의 100마이크로리터 분취액을 열순환기 튜브로 옮기고 온도 혼합기에서 섭씨 95도에서 5분 동안 가열합니다. 그런 다음 이 DNA를 사용하기 전에 필요할 때까지 튜브를 얼음으로 옮기고 분광 광도계에서 정확한 농도를 결정합니다.
다음으로, 마그네틱 비드, 와류 스트렙 인코딩 된 마그네틱 비드를 준비하고 400 마이크로 리터를 새로운 마이크로 원심 분리기 튜브로 옮깁니다. 이 튜브를 자석에 2분 동안 놓고 상층액을 제거한 다음 비드를 세척합니다. 400마이크로리터의 결합 완충액을 추가하고 와류로 세척을 완료합니다.
자석을 사용하여 비드를 분리하고 상층액을 버립니다. 이 세탁 과정을 세 번 반복합니다. 다음으로, 마그네틱 비드에 캡처 프로브를 고정합니다.
먼저 Resus를 50마이크로몰 포획 프로브로 비드와 400마이크로리터의 결합 완충액을 현탁시킵니다. 그런 다음 실온에서 부드럽게 저어 10분 동안 구슬을 배양합니다. 자유 포획 프로브를 제거하려면 세척당 400마이크로리터의 결합 버퍼를 사용하여 이전과 같이 비드를 세 번 더 세척합니다.
세 번 세척한 후 400마이크로리터의 버퍼를 더 추가하고 나머지 단계를 위해 100마이크로리터의 비드 용액을 수집하고 나머지는 섭씨 4도에서 저장합니다. 나머지는 최대 3주 동안 후속 선발 라운드에 사용할 수 있습니다. 더 많은 비드가 필요한 경우 이 선택 계획에서 엄격성을 높이기 위해 더 긴 프로브로 준비할 수 있습니다.
예를 들어, 13라운드 이후에 더 긴 프로브가 사용되었으며, 이 시점에서 다른 엄격함을 사용하여 상당한 농축이 달성되었습니다. 보관에서 가져온 비드를 사용할 때는 세척당 200마이크로리터의 결합 완충액을 사용하여 작업 부분 표본을 두 번 세척하는 것으로 시작합니다. 그렇지 않으면 갓 만든 구슬은 이미 깨끗합니다.
이제 100마이크로리터의 스냅 쿨 DNA를 비드에 추가하고 부드러운 교반으로 실온에서 30분 동안 배양합니다. 배양 후 상층액을 버리기 전에 비드를 분리하십시오. 비드에 얼마나 많은 DNA가 결합되어 있는지 결정하기 위해 DNA의 농도를 계산합니다.
다음으로, 200마이크로리터의 바인딩 버퍼로 비드를 세 번 세척합니다. 바인딩 버퍼가 매번 5분 동안 부드럽게 저어주어 비드를 세척하도록 합니다. 그런 다음 100 마이크로 몰의 결합 완충액에서 표적 분자를 준비하고 이 제제의 표적 분자인 200 마이크로리터에 비드를 재현탁합니다.
이 경우, 코르티솔은 일반적으로 첫 번째 선택 라운드에 매우 집중되어 있습니다. 주변 조건에서 부드러운 교반으로 30분 동안 타겟과 함께 비드를 배양합니다. 배양 후, 타겟 암시 시퀀스를 포함하는 snat을 저장합니다.
농축을 한 번씩 한 번씩 최종 상층액에서 샘플을 채취하여 모니터링을 위해 프로세스를 모니터링합니다. 투석으로 상등액에서 코르티솔을 제거합니다. 매 라운드 후 타겟 분자가 260 나노미터에서 DNA 흡광도 측정을 방해하지 않는 경우 이를 건너뛸 수 있으며, 양성 선택 단계에서 수집된 상등액을 템플릿으로 사용하여 PCR로 타겟 결합 DNA를 증폭합니다.
최적의 증폭 수를 결정하기 위해 예비적으로 항상 작은 테스트 PCR을 실행합니다. 각 주기 후에 10마이크로리터 샘플을 채취하여 샘플을 25 염기쌍 래더와 비교합니다. 여기서 라이브러리는 10번째 주기 이후에 증폭된 산물이 보이는 동안 85개의 염기쌍에서 실행되어야 하므로 더 적은 주기를 사용해야 합니다.
이 결과는 라운드마다 다를 수 있으므로 항상 테스트 실행이 필요합니다. 그런 다음 8개의 스트립 튜브를 사용하여 선택한 사이클 수를 사용하여 대규모 PCR을 수행합니다. 6 - 8 밀리리터의 반응 혼합물을 증폭하여 다음 선별 라운드에 필요한 양의 앰플리콘(1 - 2.5 나노몰의 DNA)을 얻습니다.
젤을 사용하여 PCR 산물의 샘플을 다시 확인합니다. 그런 다음 비자성 스트렙 코팅 비드를 사용하여 대부분의 제품을 단일 가닥 DNA로 변환합니다. 300마이크로리터의 구슬을 프리츠로 막은 작은 기둥에 넣습니다.
그런 다음 루어 잠금 주사기를 사용하여 5ml의 바인딩 버퍼로 비드를 부드럽게 씻습니다. 컬럼을 세척하기 위해 용액을 변경할 때 컬럼에서 주사기를 제거하고 주사기에서 플런저를 제거하십시오. 이것은 비드의 불필요한 방해를 방지합니다.
컬럼당 1ml의 PCR 산물을 생산할 수 있는 충분한 bead 컬럼을 생성하고 세척합니다. 부드러운 압력을 사용하여 PCR 산물을 컬럼에 통과시킵니다. DNA 산물은 안티센스 가닥에 부착된 구슬에 의해 유지됩니다.
그런 다음 DNA 결합 완충액을 5ml의 결합 완충액으로 세척하여 모든 PCR 성분을 제거하고, 결합 풀 DNA만 남겨두고 컬럼의 DNA를 혼성화하고 0.2 몰 수산화나트륨 0.5ml를 추가합니다. 그런 다음 뉴클레아제가 없는 물로 준비된 탈염 컬럼을 사용하여 eit에서 단일 가닥 DNA를 탈염합니다. 초기 0.5ml의 플로우 스루를 버리십시오.
그런 다음 컬럼에 뉴클레아제가 없는 물 1ml를 통과시켜 탈염된 DNA를 수집합니다. 수집된 DNA의 흡광도를 측정하고 다음 선별 라운드를 위해 준비합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이, 수집된 단일 가닥 DNA는 이제 capture probe로 준비된 새로 준비된 beads의 부분 표본에 다시 추가됩니다.
두 번째 선발은 첫 번째 선발과 유사하며 코르티솔 농도가 더 낮습니다. 그러나 세 번째 라운드부터는 긍정적 선택 전에 부정 선택 단계를 통합합니다. 첫 번째 negative selection의 경우, 결합 완충액에 있는 1마이크로몰 프로게스테론 200마이크로리터를 비드에 추가합니다.
그것은 구조적으로 유사하지만 코르티솔과 구별됩니다. 후속 라운드에서는 실온에서 30분 동안 혼합물을 부드럽게 흔든 후 프로게스테론 농도를 높입니다. supinate를 버리고 200 마이크로 리터의 결합 완충액을 사용하여 비드를 두 번 세척합니다.
그런 다음 포지티브 선택을 진행합니다. 앞서 라운드가 진행됨에 따라 설명한 바와 같이, 기판의 농도는 선택 과정의 엄격성에 영향을 미치기 위해 다양했습니다. 자세한 내용은 텍스트 프로토콜에서 설명합니다.
다음으로, 텍스트 프로토콜에 따라 코르티솔 검출을 위한 금 나노 입자 분석을 수행합니다. 이 빠르고 간단한 색상 메트릭 판독은 타겟 바인딩 시 압타머의 구조적 변화에 의존합니다. 따라서, 구조 스위칭 특성을 가진 abers를 선택하는 방법의 능력을 평가하기 위한 메트릭을 제공합니다.
금 나노 입자 분석의 또 다른 장점은 작은 분자에 공통적인 미세몰 친화력 압타머가 해리 상수보다 훨씬 낮은 수준에서 검출될 수 있도록 신호를 증폭한다는 것입니다. 다음 선택 프로토콜은 코르티솔에 특이적인 abers를 분리하는 데 사용되었습니다. 투석 및 농축 모니터링은 이후 선택 단계 후 표적 분자의 용출 증가를 보여주기 위해 사용되었습니다.
최종 단계에서 더 적은 표적 분자와 더 긴 포획 프로브를 사용했을 때 용리율 감소가 관찰되었습니다. 차세대 염기서열분석(Next generation sequencing)을 사용하여 여러 차례의 라운드 후에 유출된 DNA를 분석했습니다. 여섯 번째 선발 라운드 이후 초기에는 낮은 비율의 염기서열에서 복제 수가 증가했으며, 이는 13라운드 후에 20개의 빈으로 순위가 매겨졌습니다.
훨씬 더 많은 비율의 에이버가 높은 사본 수였습니다. 그런 다음 선택 프로세스를 더 엄격하게 만듭니다. 14라운드와 15라운드에서 선발된 에이버의 거의 절반이 복제 수 빈도의 첫 번째 순위에 있었습니다.
이 시점에서 30, 000 실행에 약 3000 개의 고유 한 시퀀스가있었습니다. 선택된 AP를 금 나노 입자로 배양한 후 표적을 첨가하거나 비교 대조군 기질을 첨가했습니다. 이 분석은 AP가 콜산보다 코티솔에 대해 더 특이성을 가졌거나 이 절차를 시도하는 동안에 더 특이성을 가졌다는 것을 보여주었습니다.
각 라운드에서 선택의 엄격성을 제어하고 PCR 주기 수를 최적화하는 것이 중요합니다. 이 동영상을 시청한 후에는 구조 스위칭 AP를 선택하고 금 나노입자 검출 분석을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
개요
이 기사는 마그네틱 비드 선택 방법을 사용하여 소분자 표적을 위한 구조 전환 압타머를 선택하는 프로토콜을 제시합니다. 선택된 압타머는 표적 결합 시 형태 변화를 나타내며, 이는 검출 분석에 유리합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 생화학
- 분자 생물학
- 분석 화학
배경
- 압타머는 특정 표적에 결합할 수 있는 짧은 단일 가닥 DNA 또는 RNA 분자입니다.
- 구조 전환 압타머는 표적 결합 시 형태를 변화시켜 검출 능력을 향상시킵니다.
- 금 나노입자 분석은 이러한 형태 변화를 신호로 이용합니다.
- 이 방법은 표적을 고정하지 않고도 소분자를 검출할 수 있게 합니다.
연구 목적
- 구조 전환 압타머를 선택하는 프로토콜을 개발합니다.
- 코티솔과 같은 소분자에 대한 검출 방법을 개선합니다.
- 스트레스 지표를 기반으로 생리적 상태를 평가합니다.
사용된 방법
- 생틴화된 포집 프로브와 보조 DNA 라이브러리를 마그네틱 비드와 함께 사용합니다.
- 마그네틱 분리를 사용하여 결합 서열과 비결합 서열을 분리합니다.
- 원하는 압타머를 농축시키기 위해 여러 라운드의 선택 및 증폭을 수행합니다.
- 금 나노입자 분석을 사용하여 압타머의 기능성을 시연합니다.
주요 결과
- 표적 결합 시 구조 변화를 나타내는 압타머의 성공적인 선택.
- 스트레스 지표로서 코티솔 검출의 효과성 입증.
- 프로토콜은 최적의 결과를 위해 신선히 준비된 DNA 용액의 사용을 허용합니다.
- 프로브의 길이가 길어지고 엄격도가 증가할수록 압타머 농축이 향상됩니다.
결론
- 이 프로토콜은 구조 전환 압타머를 선택하는 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다.
- 이러한 압타머는 소분자 검출 분석의 민감도를 향상시킬 수 있습니다.
- 이 접근법은 스트레스와 관련된 건강 평가에 잠재적인 응용 가능성이 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
This method enables the selection of structure-switching aptamers for small molecule targets without target immobilization, supporting biosensor development for physiological biomarkers. The approach enhances predictive confidence in target validation by enriching aptamers that undergo conformational change upon binding, reducing false positives from non-specific bead interactions. It provides a reusable discovery workflow for assay development in early-stage drug discovery, particularly for targets like cortisol where rapid, colorimetric readout is valuable for decentralized testing. The protocol’s emphasis on negative selection and probe length extension improves stringency, aiding in lead identification by minimizing background sequences and enriching high-affinity binders.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by selecting aptamers that undergo target-induced conformational change, providing functional validation of binding specificity.
- Operational Value: Eliminates need for target immobilization, simplifying workflow and reducing artifacts from surface-based interactions.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by enriching sequences with demonstrable structural switching, increasing confidence in target engagement.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates aptamers compatible with gold nanoparticle assays, enabling quantitative, colorimetric readout for high-throughput screening.
- Operational Value: Produces standardized binding pools through repeated selection and amplification, improving assay reproducibility across runs.
- Scalability: Extended capture probe length after enrichment increases stringency, supporting reuse of the selection platform for multiple targets.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Selected aptamers demonstrate detection capability in buffer, providing a foundation for extension to physiological fluids like saliva or sweat.
- Biomarker Alignment: Cortisol detection aligns with stress-related biomarker monitoring, relevant for assessing physiological state in preclinical safety studies.
- Risk-Adjusted Advancement: Enrichment monitoring via elution and sequencing allows go/no-go decisions based on aptamer specificity and copy number frequency.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, enabling progression from aptamer selection to functional assay development for small molecule detection.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating aptamers that reflect target-induced structural changes, clarifying binding mechanism and specificity.
- Screening: Delivers assay-ready aptamers with demonstrated performance in colorimetric formats, enabling reliable compound or ligand evaluation.
- Analytics: Provides quantitative outputs via gold nanoparticle signal shift, allowing comparison of binding conditions and enrichment progress.
- Translational Research: Connects to preclinical workflows through buffer-based proof-of-principle data, informing future adaptation to complex matrices.
- Enterprise Reuse: Magnetic bead selection with modifiable probe length creates a reusable platform for multiple small molecule targets, reducing redevelopment effort.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by selecting aptamers with verifiable conformational switching, reducing mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through negative selection steps and defined washing protocols, minimizing batch variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision efficiency by enabling early assessment of aptamer functionality, reducing investment in non-viable candidates.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through enrichment tracking and sequencing data, informing advancement based on copy number dominance and specificity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid handling, magnetic bead separation, and PCR optimization to avoid amplification bias.
- Dependent on magnetic separation equipment, thermocyclers, and spectrophotometry for DNA quantification and quality control.
- Necessitates cross-team standardization of binding buffer conditions and negative selection compounds (e.g., progesterone) to ensure reproducibility.
- Adaptation to physiological fluids may require optimization of salt concentration and temperature to maintain aptamer stability and target binding.
- Practical limitation: Partitioning efficiency is constrained by keeping melting temperature near room temperature, necessitating multiple selection rounds to reduce background.
