전체 양자 간 길 탈 신경과 결합 시간 차등 염색 기술은 물고기에 Ionocytes을 연구하기 위해

이 절차의 전반적인 목표는 외인성 신경 분포가 결여된 금붕어의 아가미에서 상완 세포의 증식을 조사하는 것입니다. 이것은 먼저 물고기를 미토콘드리아 특이적 염료 수조에 넣어 기존의 미토콘드리아, 풍부한 상완 세포를 염색함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 아가미의 완전한 양측 탈신경을 수행하는 것입니다.

다음으로, 물고기는 안락사됩니다. 아가미를 수확합니다. Cyte는 TPA에서 나트륨 칼륨에 대한 항체를 사용하여 표지됩니다.

그런 다음 마지막 단계는 기존 및 새로 분화된 cyte를 이미지화하고 계수하는 것입니다. 궁극적으로, 양측 길드 탈신경을 이용한 이 시간 차등 염색 기법은 중추 신경계의 신경 입력 없이 금붕어에서 아가미 세포의 증식 및 분포를 보여주는 데 사용됩니다. 따라서 이 기술의 주요 장점은 이온의 동적 흡수를 이해하고 물고기의 GI 상피에서 세포의 재분포를 조사하는 데 사용할 수 있다는 것입니다.

먼저 94마이크로리터의 디메틸설폭사이드에 50마이크로그램을 용해시켜 1밀리몰 승모판 추적기 적색 원료 용액 1개를 준비하고 빛으로부터 보호합니다. 다음으로, 최대 용량이 600밀리리터인 3-6개의 다크 박스를 준비합니다. 각 상자에 400ml의 시스템 물을 채우고 각 상자에 에어스톤을 놓아 산소 공급원을 제공합니다.

30-40g 무게의 금붕어를 상자에 넣습니다. 30분 후 Mitre 추적기 용액을 첨가하면 0.1 마이크로몰 염료와 0.01%DMSO의 전체 농도가 생성됩니다. 4시간 동안 물고기를 목욕시킵니다.

4시간 후 상자로 가는 물의 흐름을 켜고 염료가 흘러나오도록 합니다. 이들이 대조 동물인 경우, 3-5일 동안 물고기를 회수한 다음 면역조직화학으로 진행하고, 그렇지 않으면 전체 양측 탈신경 절차를 진행합니다. 첫째, 물고기를 폭기된 벤조카인 수조에 넣어 물고기를 마취합니다.

호흡이 멈추면 물고기를 수술대에 놓고 협측강에 튜브를 삽입합니다.폭기된 마취액으로 아가미를 세척하려면 머리가 약간 아래쪽으로 기울어지도록 물고기를 배치하여 네 번째 아가미 아치 뒤 영역에 더 잘 접근할 수 있도록 합니다.곧은 표준 패턴 집게로 수술을 부드럽게 들어 올리고, 그런 다음 수술과 머리 안쪽 사이에 조직 견인기를 놓습니다. 조직 견인기를 조심스럽게 열어 수술이 머리에서 멀어지도록 하고 아가미가 노출되지 않도록 합니다.

견인기 손잡이를 머리 옆에 놓고 4개의 아가미 아치에 모두 접근할 수 있도록 합니다. 마취액이 아가미를 세척하고 있는지 확인하고 네 번째 아가미 아치와 머리 뒤쪽 사이에 곡선 또는 직선 표준 패턴 집게를 놓습니다. 집게를 부드럽게 열어 인대에 긴장을 만듭니다.

네 번째 아가미 아치를 한 쌍의 숫자 5 집게로 머리에 부착합니다. 상피를 뚫어 2-3mm의 구멍을 만들고 아가미 아치의 등쪽 끝을 귓바퀴강에 연결합니다. 주요 혈관을 손상시킬 위험이 있으므로 너무 깊이 들어가지 않도록 주의하십시오.

다음으로 5번 집게가 달린 작은 면봉을 잡고 절개 부위를 조심스럽게 펴서 9번째와 10번째 신경을 노출시킵니다. 숫자 5 겸자를 사용하여 결합 조직에서 신경을 자유롭게 하십시오. 다시 말하지만, 혈관이 손상되지 않도록 주의하십시오.

신경이 노출되고 확인되면 절개 부위를 유지하면서 곡선형 스프링 가위를 사용하여 신경을 조심스럽게 절단합니다. 직선 표준 형상의 겸자로 엽니다. 신경을 절단한 후 구부러진 집게를 부드럽게 집어넣고 조직을 제거합니다.

절개 부위가 24-48시간 이내에 저절로 닫혀야 하기 때문에 견인기 봉합사가 필요하지 않습니다. 머리 반대쪽에서도 절차를 반복한 후 아가미 관개를 마취제에서 담수로 전환하고 물고기가 마취에서 회복할 수 있도록 합니다. 이의 움직임이 재개되면 물고기를 실험용 수조로 옮겨 최소 24시간 동안 회복합니다.

마지막으로, 물고기를 안락사시키기 전에 신경을 절단하지 않고 네 번째 아가미 아치 뒤의 상피를 뚫어 별도의 물고기 세트에 대해 가짜 절차를 수행합니다. 3-4mL의 4%PFA를 섬광 바이알에 넣습니다. 아가미 아치당 하나의 바이알을 사용하십시오.

또한 작은 유청 보트를 가져 와서 하나의 XPBS로 채우십시오. 이것은 절제 된 후 조직을 씻는 데 사용됩니다. 모든 용액을 얼음 위에 보관하십시오.

벤조카인을 과다 복용하여 물고기를 안락사시킨 후, 뭉툭한 집게를 사용하여 머리 한쪽의 파마를 들어 올리고 구부러진 가위를 사용하여 상완 아가미 바구니의 양쪽 끝을 절단합니다. 다음으로, 뭉툭한 집게를 사용하여 Rackers로 아가미를 조심스럽게 집어 이강에서 들어 올립니다. 즉시 아가미를 얼음처럼 차가운 XPBS로 씻어 과도한 벤젠과 혈액을 제거하고 절제된 아가미를 4% PFA로 채워진 바이알에 넣고 고정 후 섭씨 4도에서 밤새 절제된 아가미를 고정합니다.

하나의 XPBS에서 X-S-P-F-A를 씻어내고 1.5ml의 1% Tritton x로 채워진 2밀리리터 총알 튜브에 조직을 넣습니다. 총알 튜브를 실온에서 6시간 동안 또는 섭씨 4도에서 밤새 셰이커에 놓습니다. 조직을 투과하기 위해 NKA 및 ZN 12 1차 항체 4마이크로리터를 1XPBS 992마이크로리터에 추가하여 각 1차 항체를 1-250 희석할 수 있습니다.

두 1차 항체가 동일한 숙주에서 증가되었는지 확인합니다. 트리톤 X 용액을 세척하지 않고 조직을 먼저 흡입하고 기본 항체 용액을 흡입한 후 셰이커에서 실온에서 6시간 동안 또는 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 배양 후 1차 항체 용액을 흡인하고 1차 항체를 각각 3분씩 3회 세척합니다.

하나의 XPBS를 사용합니다. 5마이크로리터의 재고 2차 항체를 995마이크로리터의 1XPBS에 혼합하여 1-200 희석으로 2차 항체를 준비합니다. 마지막 세척에서 PBS를 흡인한 후 2차 항체를 적용하고 실온에서 6시간 동안 또는 쉐이커에서 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다.

마지막으로, 이전과 같이 조직을 각각 5분씩 3회 세척하여 과도한 2차 항체를 제거하고, 세척 후 조직을 장착한 후 먼저 평면 현미경 슬라이드에 1개의 XPBS를 200마이크로리터 방울로 떨어뜨려 아가미를 놓습니다. 조직이 건조되지 않도록 합니다. 아가미 hemi Brinks를 곡선형 마이크로 가위로 분리합니다.

그런 다음 XPBS 한 방울과 장착 미디어 한 방울을 오목한 슬라이드의 움푹 들어간 곳에 놓습니다. 분리된 헤미 브랭크를 필라멘트의 앞쪽 가장자리가 위를 향하도록 하여 오목한 슬라이드에 넣고 커버 슬립으로 커버 슬립의 가장자리를 매니큐어로 두드립니다. 커버 슬립이 이리저리 움직이거나 조직을 변위시키는 것을 방지하기 위해 이미징하기 전에 10-15분 동안 조직이 오목한 슬라이드의 바닥에 가라앉도록 합니다.

각 아가미 아치에 대해 6개의 아가미 필라멘트를 무작위로 선택하여 아가미 아치당 6개의 이미지를 생성합니다.기존 컨포칼 현미경을 사용하여 1-3개의 마이크로미터 광학 슬라이스를 촬영하여 조직을 이미지화한 다음 이미지에서 화살촉으로 표시된 세포는 알파 5 항체로 염색하고 화살표로 표시된 신경은 ZN 12 항체로 염색했습니다. 대조군 물고기의 아가미 필라멘트에 대한 이 컨포칼 이미지는 삽입 이미지에서 볼 수 있듯이 9번째와 10번째 신경에서 비롯된 것으로 추정되는 중추 신경 다발의 광범위한 라멜라 분지와 함께 외적 신경 분포를 보여줍니다.

표시된 세포 중 일부는 또한 신경이 분포되어 있습니다. 이 이미지는 완전한 양측 탈신경화 후 이틀 후의 아가미 필라멘트를 보여줍니다. 중추 신경 다발의 감소가 있었지만 층류 신경 분포는 대체로 손상되지 않은 것처럼 보였습니다.

여기서, 완전한 양측 탈신경 제거 후 5일 후에 나타난 아가미 필라멘트는 이제 외인성 신경 분포가 거의 없음을 보여줍니다. 정성적 분석에 따르면 완전한 양측 탈신경은 아가미 필라멘트 내의 세포체와 함께 신경을 유지하면서 필라멘트를 통해 절름발이로 들어가는 신경 네트워크를 생성하는 동시에 외인성 아가미 신경 분포의 저하를 유발합니다. 이 절차는 추가 연구 질문에 답하기 위해 나트륨 22와 같은 방사성 이온을 사용하여 이온 플럭스를 측정하는 것과 같은 다른 방법과 결합할 수 있습니다.