동일한 호스트 종에서 항체와 면역 조직 화학 및 다중 라벨은 성인 해마 신경 발생을 연구하기 위해

이 절차의 전반적인 목표는 간접 면역형광의 한계를 우회하여 신경전구세포를 연구하는 것입니다. 다른 숙주 종의 적절한 1차 항체를 사용할 수 없는 경우. 처음에는 티미딘 유사체를 주입하여 분열하는 세포를 라벨링한 후 조직을 수확, 가공 및 극저온 절편으로 절단합니다.

그런 다음 순차적인 다중 면역형광을 수행하여 시작합니다. 표지되지 않은 1차 항체가 적용되고, 이 항체는 형광 표지된 2차 항체에 의해 결합됩니다. 다음으로, 1차 2차 항체의 개방 페리콥스를 1차 항체 종의 혈청으로 차단하고, 2차 항체에 의해 인식될 수 있는 모든 면역글로불린을 접합되지 않은 fab 단편으로 덮습니다.

이를 통해 조직은 다른 2차 항체에 의해 표지될 수 있는 두 번째 1차 항체로 처리될 수 있습니다. 궁극적으로, 섹션의 이미지는 특정 자극에 대한 반응으로 신경 전구 세포의 발달 및 조절과 특정 뇌 기능에 대한 관여를 연구하는 데 사용됩니다. 동시 다중 면역형광과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 동일한 숙주 종에서 발생한 1차 항체를 사용해야 할 필요성에서 일반적으로 발생하는 문제를 우회한다는 것입니다.

이 방법은 생리학적 또는 약리학적 자극, 뇌 병리학 또는 노화에 대한 반응으로 해마 전구 하위 집합의 증식과 같은 성인 신경 발생 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 동일한 숙주 종의 1차 항체를 여러 개 표지하면 적절한 차단 없이 원치 않는 항체 교차 활성으로 이어질 수 있기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 먼저, 주사할 동물의 무게를 측정하고 주사를 위한 밀리리터당 10밀리그램의 새로운 티미딘 유사체 원액을 준비합니다.

용액이 준비되면 30게이지 바늘이 있는 미세한 투여 주사기에 중량 조정 용량을 준비합니다. 그런 다음 목덜미로 마우스를 제지하고 원하는 시점에 티미딘 아날로그 복강내를 주입하여 마우스 및 트랜스 심장을 깊이 마취합니다. 10ml의 얼음처럼 차가운 PBS를 주입한 다음 40ml의 신선한 얼음처럼 차가운 포름알데히드 용액을

그런 다음 뇌를 해부하고 고정한 후 동일한 정착물에 고정합니다. 수집된 뇌를 섭씨 4도에서 10% 자당에서 24시간 동안 배양합니다. 다음 날, 뇌를 30% 슈크로스로 옮기고 다시 48시간 동안 배양합니다.

극저온 보호를 위한 뇌가 준비되면 섭씨 영하 25도의 isop pentane에서 얼립니다. 나중에 저온 유지 장치를 사용하여 장기 보관을 위해 40미크론 코로나 절편을 절단합니다. 섹션을 부동액으로 옮기고 섭씨 영하 20도로 유지하십시오.

가는 브러시를 사용하여 부동액에서 TBS로 섹션을 옮기는 것으로 시작하십시오. 섭씨 4도에서 하룻밤 세탁으로 시작하여 실온에서 10분 동안 5회 세탁하여 섹션을 철저히 헹굽니다. 이러한 모든 배양은 지속적이고 부드러운 교반으로 수행되어야 합니다.

관심 항원 중 하나가 티미딘 유사체인 경우, 이 시점에서 염산 변성 단계를 구현한 다음 보어 버퍼에서 중화 단계를 수행해야 합니다. TBS plus에서 비특이적 항체 결합 부위의 투과성 및 차단을 진행한다. 이 배양은 실온에서 1시간 동안 방치한 다음 TBS에 희석된 첫 번째 1차 항체에서 다음 날 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다.

TBS에서 섹션을 세 번, TBST에서 한 번 세척합니다. 각 목욕을 10분 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 실온에서 3시간 동안 첫 번째 형광 색소 접합 2차 항체를 배양합니다.

이제부터 빛에 노출되지 않도록 섹션을 보호하십시오. 또 다른 세척 시리즈 후, 두 개의 기본 항체가 만들어진 10% 숙주 종 혈청 용액으로 절편을 옮깁니다. 이 용액의 절편을 3시간 동안 배양하여 첫 번째 2차 항체의 열린 페리콥스를 포화시킵니다.

나중에 TBS에서 세 번, TBST에서 한 번 헹구어 혈청을 제거합니다. 그런 다음 1차 항체의 숙주 종에 대한 비접합 1가 fab fragments ml당 50μg이 포함된 TBS plus 용액을 준비합니다. 이는 2차 2차 항체에 의해 인식될 수 있는 에피토프를 포함합니다.

절편을 이 용액으로 옮기고 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 배양 후에는 TBS에서 최소 3회, TBST에서 한 번 섹션을 헹굽니다. 옮기는 동안 종이 타월에 섹션이 포함된 메쉬 인서트를 면봉으로 닦아 잔여 팹 찌꺼기를 제거합니다.

이제 두 번째 1차 항체의 절편을 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 한 번 더 세척한 후 두 번째 2차 항체를 실온에서 3시간 동안 적용합니다. 마지막으로 TBS에서 섹션을 세 번 세척하고 섹션 젤라틴 장착을 진행합니다.

슬라이드와 덮개를 자연 건조하고 ANTIFA 장착 매체 이미지를 사용하여 밀어 넣습니다. 형광은 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경으로 섹션을 라벨링했습니다. 치상회(dentate gyrus)의 전체 범위를 따라 400배 배율로 임의의 위치에 이미지 스택을 가져옵니다.

서로 다른 마커의 공동 표지를 위해 반구당 무작위로 선택된 최소 50개의 관심 세포를 분석합니다. 특정 신생아 세포 집단에 대한 절대 수를 계산하려면 공동 표지된 세포의 백분율에 DAB 염색 분석에서 추정된 총 신생아 세포 수를 곱합니다. 설명된 방법은 신경 발생 결핍 순환의 출생 후 및 성인 해마에서 신생아 세포를 정량화하고 특성화하는 데 사용되었습니다.

D two knockout mouse model, KI 67 또는 BRDU와 같은 다른 증식 마커에 대한 DAB 염색은 야생형 마우스와 knockout 마우스 간의 신생아 세포 수 차이를 일관되게 보여주었습니다. BRDU 표지된 신생아 세포는 GFP 및 이중 쿠틴의 B-R-D-U-G-F-A-P 둥지에 대해 1차 항체를 동시에 적용하는 기존의 다중 면역형광 프로토콜로 표현형을 분석할 수 있습니다. 이를 통해 단일 검체 내에서 신생아 1형, 2형 A형, 2형 B 및 3형 전구 세포를 성공적으로 식별할 수 있었습니다.

대안적으로, BRDU 주입과 동물의 희생 사이의 시간 간격이 더 길면 동시 BRDU new n 면역 염색으로 신생아 뉴런의 최종 수를 분석할 수 있습니다. 순차적 면역 라벨링 프로토콜은 먼저 토끼 항 KI 67, 염소 항 GFP 및 기니피그 항 이중 코르돈 항체와 동시에 절편을 배양하고 두 번째로 토끼 항 GFAP 항체와 동시에 배양하는 경우 완벽하게 작동했지만 그 반대의 경우도 마찬가지였습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 동일한 숙주에서 발생한 1차 항체를 사용하여 단일 조직 절편에서 최대 4개의 서로 다른 항원을 시각화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

이 절차를 시도하는 동안 항체, 교차 반응 또는 위양성의 가능성을 제거하기 위해 적절한 대조군을 포함하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 1차 항체 배양의 순서는 프로토콜의 결과에 큰 영향을 미칠 수 있습니다.