Name: 동일한 호스트 종에서 항체와 면역 조직 화학 및 다중 라벨은 성인 해마 신경 발생을 연구하기 위해 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: 배우세요 성인 해마 신경 발생의 모든 단계를 동일한 조직 섹션에서 정량화하는 방법을. 이 기법은 동일한 숙주 종에서 항체를 사용하여 간접 면역 형광의 한계를 극복하고 신경 전구 세포 연구의 정확성을 향상시킵니다.

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저자는 훌륭한 기술 지원에 대해 S. Tausch에게 감사를 표합니다. 이 작업은 BMBF(Bernstein Focus 01GQ0923) 및 DFG(FOR1738)의 지원을 받았습니다.

참고 : 살아있는 동물을 포함한 모든 절차는 EC 지침 6백9분의 86가 / EEC 관리 및 실험 동물의 사용에 대한 지침과 지역 윤리위원회 (링거 Landesamt에 대 한 Lebensmittelsicherheit 싶게 Verbraucherschutz)의 승인에 따라 수행되었다. 티미 딘 유사체 1. 복강 내 주사 <ol><li> 주입하기 전에 동물에게 하루의 무게를. 다음 날뿐만 아니라, 10 ㎎ / ㎖의 스톡 용액의 중량 개별 조정 주입량에 계획된 모든 주사에 필요한 아날로그 티미 딘의 양을 계산한다. </li><li> 10 ㎎ / ㎖ 티미 딘 주식 솔루션을 준비합니다. (주의! 티미 딘 유사체 독성이. 화학 흄 후드를 사용, 즉, 공급 업체가 제공하는 특정 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 따라 실험실 코트와 장갑을 착용). <ol><li> 냉장고에서 티미 딘 아날로그를 타고 약, RT에 가져다. 21 ° C. 10 mg의 무게 추가0.04 N의 NaOH (BrdU의 및 CldU 용) 멸균 식염수 (멸균 식염수에, IDU)에, 소용돌이. 50 ° C의 물을 욕조와 소용돌이에 15 분마다 2 - - 분말을 용해 3 분을 적어도 10를 배치합니다. 참고 : 최대 24 시간 동안 사용 솔루션은 실온에서 -20 ° C에서 몇 주 동안 저장 될 때. 빛 (알루미늄 호일 커버)에서 솔루션을 보호합니다. 항상 침전물을 확인하고 필요한 경우 재용. </li></ol></li><li> 마우스 목덜미로 억제하고 복강 30 G 바늘 미세 투여 주사기를 사용하여 (RT시) 스톡 용액의 적절한 용적 중량 조정을 주입. 주 : CldU 경우와 IDU는 동일 동물에서 연속적으로 투여 될 필요가 등몰 농도를 주입 고려 (즉, 50 ㎎ / kg에 해당 BrdU의 42.5 ㎎ / kg CldU 57.5 ㎎ / kg IDU). 따라서, 그에 따라 10 ㎎ / ㎖의 원액을 주입 볼륨을 조정합니다. </li></ol> 2. 조직 준비 <ol><li> 처리장관류 하루전 0.1 M 인산염 완충액 pH 7.4에서 4 % 포름 알데히드 재. 4 ℃에서 보관하십시오. </li><li> 로 transcardially 40㎖를 빙냉 포름 알데히드 (유량 5 ㎖ / 분)에이어서, 10 ml의 빙냉 PBS로 좌심실을 통해 깊게 마취 된 쥐 (3.5 %의 이소 플루 란)을 관류. 4 ℃에서 24 시간 동안 동일한 정착액에 두뇌 및 사후 수정을 해부하다. </li><li> 연속적으로 10 % (4 ° C에서 24 시간)과 30 %의 자당 (뇌 싱크 때까지, 약. 48 시간)으로 뇌를 전송합니다. 기포가 조직에서 등장하지 않을 때까지 냉동, 천천히 -25 ° C의 이소 펜탄에 cryoprotected 두뇌 잠수함. -80 ° C에서 보관하십시오. </li><li> 냉동 마이크로톰에 40 μm의 두께의 관상 섹션 컷 (-25 블록의 온도를 -16 ° C). 24 웰 세포 배양 플레이트의 웰을 함유하는 부동액 순차적으로 수수 부 (도 1 참조). -20 ° C에서 보관하십시오. </li></ol><img aLT = &quot;그림 1&quot;SRC = &quot;/ 파일 / ftp_upload / 52551 / 52551fig1.jpg&quot;/&gt; 24 웰 플레이트에 마이크로톰 조각을 전송 그림 1. 도식 그림. A1에서 시작 A6는 등 다음 행의 B로 이동 한 후, 행에 다음 조각을 배치합니다. D6에 도달 할 때, A1로 돌아가서 계속합니다. 조각의 이러한 배열은 전체 뇌의 부분 일 매 n의 정량화 수 있습니다. 신생아 세포의 정량 면역 표현형에 대한 (하나의 컬럼의 2 교대로 행의 내용에 해당) 매 12 번째 절을, (하나의 컬럼의 내용에 해당) 뇌 섹션 번째 매 6을. 3. 면역 염색 참고 : 섹션 6 웰 플레이트 캐리어 플레이트를 장착하고 삽입 메쉬 일반적으로, 무료로 부동 처리됩니다. 예외적으로, 항체 배양 및 ABC 반응은 메쉬 삽입 (w 당 0.5-1 ml의없이 12 또는 24 웰 플레이트에서 수행되는 블로킹엘)은 염색 할 필요가 슬라이스의 수에 따라, 충분하다. 이 단계 동안, 미세 브러시의 도움 (각각의 새로운 솔루션을 씻어)로 섹션을 전송합니다. 모든 배양 연속 교반 (최대 150 RPM)로 수행됩니다. <ol><li> 면역 조직 화학 (ABC 방법) <ol><li> 완전히 부동액을 제거하기 (10 분 각각 RT에서 5 회 4 ° C에서 한 번 O / N)를 TBS에 부동액에서 섹션을 이동 충분히 헹군다. </li><li> 내인성 퍼 옥시 다제 활성을 종결 TBS-T에서 1.5 %의 H 2 O 2에서 30 분 동안 인큐베이션. 버블 링에주의하고 필요한 경우 섹션을-잠수함 다시. 15 분마다 TBS에서 3 번 씻어. </li><li> 옵션 : 한편 가열 캐비닛과 37 ° C 2 N 염산을 예열. DNA를 변성 2 N 염산 37 ° C에서 30 분 동안 섹션을 품어. 브러시의 도움으로 조심스럽게 별도의 섹션. </li><li> 선택적 : 0.1 M 보레이트 완충액 pH에서 10 분간 부분 중화8.5, RT. 전송하는 동안, 잠시 염산 남은 것을 제거하기 위해 종이 타월에 섹션을 포함하는 메쉬 삽입을 채취. 15 분마다 TBS에서 2 번 씻어. </li><li> 조직을 Permeabilize 하시려면하고 불특정 항체 결합 부위, 실온에서 1 시간을 차단하는 TBSplus에 품어. </li><li> 4 ° C에서 TBSplus, O / N에 희석 차 항체에 품어. 15 분마다 TBS에서 3 번 씻어. </li><li> TBSplus, 실온에서 3 시간 희석 바이오틴 이차 항체에 품어. 15 분마다 TBS에서 3 번 씻어. 한편 ... </li><li> 제조 업체의 프로토콜 (TBS-T에서 1 % + 1 % B)에 따라 ABC 단지를 준비합니다. 사용하기 전에 30 분 동안 실온에서 방치한다. 실온에서 1 시간 동안 AB 시약의 섹션을 품어. 15 분마다 TBS에서 3 번 씻어. </li><li> 각각 두 개의 반쪽 피펫 4 ml의 2 ml의 당 우물에 분할, 6 또는 12 웰 플레이트 당 TBS-T에서 50 ml의 0.5 ㎎ / ㎖ DAB를 준비합니다. DAB 용액 (주의로 전송 섹션! DAB 독성이다. 구체적으로 지정을 따라C 즉, 실험실 코트와 장갑을 착용 공급 업체에서 제공하는 MSDS는) 화학 흄 후드를 사용합니다. </li><li> 잘 과산화 반응을 시작하는 각 상기와 같이, 나머지 25 ml의 DAB 용액에 0.5 ml의 1 % H 2 O 2를 추가 혼합하여 피펫 동등한 볼륨. 12 분 동안 품어. 15 분마다 TBS에서 3 번 씻어. </li><li> 젤라틴 슬라이드 마운트 섹션, 건조 공기의 O / N. 영구 장착 매체 커버 슬립. </li><li> 옵션 : 커버 슬립을 배치하기 전에 Counterstain과 (3.5 절 참조). 주 : 신호 - 대 - 잡음 비율이 높기 때문에 배경이 낮은 경우, AB 시약 (단계 3.1.8)와 인큐베이션 한 후 H 2 O 2 처리를 반복한다. </li></ol></li><li> 다중 면역 <ol><li> 단일 또는 동시에 여러 면역 형광 <ol><li> TBS에 부동액에서 섹션을 전송하고 철저하게 린스 (4 ° C에서 한 번 O / N을, 실온에서 10 분 동안 5 회)을 완전히 제거하기tifreeze. </li><li> 옵션 : 3.1.3 단계로 - 3.1.4. </li><li> 불특정 항체 결합 부위, 실온에서 1 시간을 조직을 Permeabilize 하시려면 및 차단 TBSplus에 품어. </li><li> 차 항체 칵테일에 품어 (예를 들어, 쥐의 α-BrdU의, 기니 돼지-DCX α, 염소 α-GFP) 4 ° C에서 TBSplus, O / N에 희석. 15 분마다 TBS에서 3 번 씻어. </li><li> Fluorochrome과 접합 된 이차 항체의 칵테일에 품어 (예를 들면, 로다 민 레드 α-쥐, 알렉사-647 α-기니피그는 알렉사-488은 α-염소, 모든 당나귀에서 유래), TBSplus에 희석 3 시간 RT 또는 O / N에서 4 ° C에서. 지금부터 빛 섹션을 보호합니다. 15 분마다 TBS에서 3 번 씻어. </li><li> 젤라틴 슬라이드 마운트 섹션, 건조 공기의 O / N. 수성 매질과 마운팅 커버 슬립. </li></ol></li><li> 동일한 호스트 종에서 차 항체 순차 여러 면역 형광 <ol><li> 3.2.1.3 - 3.2.1.1 단계로. </li><li> 인터넷에 품어첫 차 항체 (예를 들면, 토끼 α-항원 A), O / N 4 ° C에서. 10 분마다 TBS-T에서 3 회 TBS에 한 번 씻어. </li><li> 첫째 Fluorochrome과 접합 된 이차 항체 (예를 들면, 로다 민 레드 비공. 당나귀 α-토끼), 3 시간의 RT에 품어. 지금부터 빛 섹션을 보호합니다. 10 분마다 TBS-T에서 3 회 TBS에 한 번 씻어. </li><li> 첫 번째 차 항체에 열린 paratopes을 포화 3 시간의 RT에 대한 기본 항체와 같은 호스트 (예를 들면, 토끼 혈청)에서 10 % 정상 혈청에 품어. 10 분마다 TBS-T에서 3 회 TBS에 한 번 씻어. </li><li> 50 μg의 (예, α - 토끼의 IgG (H + 1)가) 제 2의 2 차 항체, O / N에 의해 인식 될 수있는 에피토프를 덮도록 차 항체의 호스트에 대해 지시 / ㎖ 접합 일가 Fab 단편과 TBSplus 부화 4 ° C. </li><li> 10 분마다 TBS-T에 적어도 3 회 TBS에 한 번 씻어. 전송하는 동안, 짧게 SWAB 종이 타월에 섹션을 포함하는 메쉬 삽입은 팹 남은 것를 제거합니다. </li><li> 4 ° C에서 두 번째 차 항체 (예를 들면, 토끼 α-항원 B), O / N에 품어. 10 분마다 TBS-T에서 3 회 TBS에 한 번 씻어. </li><li> 두 번째 Fluorochrome과 접합 된 이차 항체 (예를 들어, 알렉사-488 비공. 당나귀 α-토끼), 3 시간의 RT에 품어. 15 분마다 3 회 TBS 린스 마운트 상기와 같이 커버 슬립. 참고 : 다른 호스트 종을 추가로 항체와 항원의 레이블을하려면 3.2.2.2 단계와 각 이차 항체는 3.2.2.3 단계. </li></ol></li><li> 차 항체의 하나로서 같은 종의 차 항체의 하나 참고 :이 프로토콜은 GFAP, 네 스틴-GFP 및 DCX와 함께 BrdU의 또는 Ki67에 네 번 염색에 적합하다. <ol><li> 3.2.1.5 -에 따라 엄격하게 프로토콜은 3.2.1.1 단계를 반복합니다. 이 시점까지 TBSplus 만 당나귀 혈청을 사용합니다. </li><li> T에 품어RT에서 1 시간 동안 3 % 염소 혈청을 함유 BSplus. 이것은 α-염소 이차 항체에 열려 paratopes을 다룹니다. 10 분마다 TBS-T에서 3 회 TBS에 한 번 씻어. </li><li> AMCA 비공에 품어. TBSplus, 3 시간의 RT 또는 O / N 4 ° C에 희석 염소 α-토끼. 15 분마다 TBS 세 번 헹구고 마운트 상기와 같이 커버 슬립. </li></ol></li><li> CldU, IDU 공동 염색 <ol><li> 린스 변성 및 3.2.1 절에 설명 된대로 섹션을 중화 (- 3.2.1.2 3.2.1.1 단계). </li><li> α-마우스 TBSplus에서의 IgG (H + L), RT에서 1 시간 20 ㎍ / ml의 접합 팹 조각으로 품어. 10 분마다 TBS-T에서 4 회 TBS에 한 번 씻어. </li><li> 4 ° C에서 TBSplus, O / N에 희석 : 마우스 α-BrdU의 (350 1) : (IgG2을 정제 (400) 1) 쥐의 α-BrdU의를 포함하는 일차 항체 칵테일에 품어. 10 분마다 TBS-T에서 3 회 TBS에 한 번 씻어. </li><li> 바이오틴 당나귀 포함하는 이차 항체 칵테일에 품어 α를 쥐 (1: 500)과 FITC 비공. 당나귀 α-마우스 Fab 단편 (1 : 100). 10 분마다 TBS-T에서 3 회 TBS에 한 번 씻어. </li><li> 로다 민 레드 비공에 품어. 스트렙 타비 딘, 실온에서 2 시간. 15 분마다 3 회 TBS 린스 마운트 상기와 같이 커버 슬립. </li></ol></li><li> 네 스틴 - 생쥐에서 GFP 형광 신호의 증폭 <ol><li> 차 항체 칵테일에 염소 α-GFP를 추가합니다. </li><li> (. 이러한 알렉사 488 접속사로서 α-염소 당나귀) GFP와 유사한 분광 특성과 형광 색소 결합 된 이차 항체를 추가 이차 항체 칵테일에. </li></ol></li></ol></li><li> 에피토프 검색 <ol><li> 부동액을 세척 한 후 에피토프 검색을 수행하십시오. 99 ° C (약 25 분) - 0.1 M 시트 레이트 완충액 pH 6.0 ~ 95를 포함하는 6 또는 12 웰 플레이트 예열 증기선. </li><li> (30 분 동안 뜨거운 구연산 버퍼와 증기로 섹션을 전송 플라스틱 리터 알루미늄 호일 접시를 커버ID는 내열되지 않음). </li><li> 즉시 식혀 빙욕 플레이트를 배치했다. 이 출생 후의 동물의 뇌 부분 작업을 할 때 특히 중요하다 조직 형태를 보호하는 데 도움이됩니다. </li><li> 씻어과 구연산을 중화 및 염색을 계속 10 분 각각 TBS에서 3 번 씻어. </li></ol></li><li> 마우스는 마우스 조직에 항체가 <ol><li> -α 마우스 IgG 20 ㎍ / ml의 일가 Fab 단편 추가 (H + L을, 이차 항체에 비해 동일한 호스트 종)를 첫 번째 차단 단계 (예를 들어, 단계 3.1.5 또는 3.2.1.3). </li><li> 10 분마다 TBS-T에서 4 회 TBS에 한 번 씻어, 각각의 프로토콜로 진행합니다. </li></ol></li><li> 크레 실 바이올렛 대조 염색 <ol><li> (유리 항아리에) 60 ° C로 예열 크레 실 바이올렛 솔루션입니다. 3 분 동안 뜨거운 용액에 슬라이드를 품어. </li><li> 수성에 씻어. 이명. 및 70 %에 각각 1 분, 96 % 및 100 % 이소프로판올 2 회 탈수. </lI&gt; <li> 6 크실렌 분 또는 호환 영구 설치 매체와 크실렌 대체 및 커버 슬립 - 5 지우기. </li></ol></li></ol> 4. 데이터 분석 <ol><li> 치아 이랑의 전체 rostrocaudal 정도에 따라 매 6 번째 섹션에서 퍼 옥시 다제 스테인드 신생아 세포를 계산합니다. 400 배 배율의 광학 현미경을 사용합니다. </li><li> 신생아 세포의 총 수의 추정치를 얻기 위해 교차 간격으로 얻어진 세포 수를 곱한다. </li><li> 형광 이미지는 적절한 레이저 시스템 및 필터를 구비 한 공 초점 레이저 현미경으로 라벨링 섹션. 400 배 배율의 치아 이랑의 전체 범위를 따라 임의의 위치에 이미지 스택을 가지고 다른 마커와 공동 라벨링 반구의 지분의 50 무작위로 선택된 세포를 분석 할 수 있습니다. </li><li> 절대 계산하는 신생아 세포의 총 수와 공동 표지 된 세포 (/ 100 %)의 비율을 곱하여 얻어진특정 신생아 세포 집단의 숫자. </li></ol>

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</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

정량화와 신생아 세포의 개체군의 식별은 성인 신경 연구의 중심 문제입니다. 성인 신경의 특정 단계에서 발현 된 단백질에 대한 증식 마커 및 항체를 결합하는 것은 이러한 개체군의 면역 검출 할 수있다. 항체 또는 항체 조합 중 일부는 특정 염색 조건을 필요로한다. 합성 티미 딘 유사체로 세포를 분할의 레이블은 아직 성인 해마의 신경 발생 연구를위한 황금 표준입니다. 이 실험을 시작하기 전에 적절한 주입 프로토콜을 고려하는 것이 중요하다. 우리가 일반적으로 50 ㎎ / kg (체중, IP)의 BrdU를 관리하지만, 농도는 실험 조건에 따라 다를 수 8,16 하였다 (300 mg까지 / 볼 루스 주사 kg). 이두와 CldU는 세포 인구의 시간적 차별에 대해 순차적으로 주입하는 경우는 (몰 농도를 주입하는 필수입니다 <em&gt; 예를 들면, 42.5 ㎎ / kg CldU 및 / kg IDU 57.5 mg)을 얻었다. 그 티미 딘 유사체는 셀 분할에 독성이있을 ...

두 뇌 영역 구조적으로 생활 전반에 걸쳐 새로운 신경 세포를 생성, 측뇌실의 뇌실 영역과 해마 치아 이랑 (DG)의 subgranular 영역 (SGZ). 신생아 신경 세포는 신경 전구 세포에서 파생 만기 1, 2에 도달하기 전에 형태 학적 및 생리 학적 개발의 여러 단계를 통해 이동합니다. 천천히 나누어 방사형 아교 세포와 같은 줄기 세포 (유형 1)에서 대중 교통의 연속적인 단계는 중간 전구 세포가 발생 증폭. 더 미분화 하위 유형 (유형 2A와 2B 형)는 짧은 접선 프로세스와 불규칙한 형상을 갖는다. 그들은 (수상 돌기는 분자 층으로 확장 포함) 점차적으로 미성숙 신경 세포가되기 위해 세포주기를 종료하고 마지막으로 해마 네트워크 성숙 과립 세포로 통합 neuroblasts (유형 3)을 생성합니다. 특정으로 인해 생리적 특성이 향상된 세포 가소성 삼 sugges으로 회로를 제공한다팅 해마의 기능에 고유 한 역할. 사실, 지난 십 년간의 연구는 성인 신경이 공간 기억, 패턴 분리 및 정서적 행동 4,5에 기여한다는 상당한 증거를 생성합니다. 성인 신경은 서로 다른 접근 방법을 사용하여 공부하실 수 있습니다. 티미 딘 유사체는 세포주기의 S-단계에서 DNA에 통합하는 신생아 세포 6-8의 출생 연대, 정량 운명 분석을 할 수 있습니다. 다른 티미 딘 유사체 (예 CldU, EDU 또는 IDU)을 순차적으로 적용은 세포 또는 전도 (9)의 실험 과정 동안 상이한 시점에서 태어난 세포 집단을 연구하는데 사용될 수있다. 대안으로서, 세포 증식에​​ 대한 내인성 마커 Ki67이다. 이것은 세포주기 (G1, S, G2, M) 상을 제외한 휴지 (G0) 및 10,11 G1의 선두의 단계에서 모든 셀 분할 표현된다. 성인 dentat 신생아 세포 집단의 표현형을 분석하려면전자 이랑 여러 단계 특정 분자 마커는 GFAP, 네 스틴, DCX와 NeuN 1,6로 사용할 수 있습니다. GFAP 성숙한 아스트로 마커뿐만 아니라 성인 전뇌 래디얼 신경교 유사 세포에서 발현된다. 네 스틴은 반경 신경교 유사 세포와 초기 중간 전구 세포에 특이적인 중간 섬유이다. DCX 중간 전구 세포, 미성숙 neuroblasts 뉴런에서 발현 미세 소관 - 연관된 단백질이다. +, 네 스틴 - 입력 2A (GFAP - 1 형 (GFAP +, 네 스틴 +, DCX) :이 세 가지 마커와 네 가지 전구 세포 아형 식별 할 수있는 표지 세포의 형태 학적 특징 (공동) 식을 바탕으로 , DCX -), 2B 형 (GFAP - 네 스틴 +, DCX +) 및 3 형 (GFAP - 네 스틴 - DCX +) 1. 함께 postmitotic 신경 세포로 표현된다 NeuN, DCX와의 공동 라벨링 immatur의 분화를 할 수 있습니다전자 (DCX +, NeuN +)과 성숙 ​​(DCX - NeuN +) 과립 뉴런. 상술 한 마커가 자주 신생 세포의 수 및 정체를 분석 면역 공동 라벨 및 후속 공 초점 현미경에 사용된다. 이는 일반적으로 바람직하지 않은 항체 교차 반응을 방지하기 위해 다른 호스트 종으로부터의 항체를 필요로한다. 그러나, 신경 연구에 적합한 차 항체의 대부분은 중 토끼 나 쥐에서 (예를 들어, 마우스 α-BrdU의 마우스 α-NeuN, 토끼 α-Ki67, 토끼 α-GFAP)을 발생합니다. 이것은 단일 슬라이스로 평가 될 수있는 항원의 수와 조합하여 심각한 한계에 이르게. 이것은 차례로 다수의 염색이 수행 될뿐만 아니라 가지고, 염색 노력을 증가뿐만 아니라, 결과의 신뢰성을 손상시킬 수도있다. 또한, 일부 포르말린 고정 항원 유발 에피토프를 마스킹 (예 Ki67에 취약, 네 스틴). 우리는 여기에 클래식 단일 및 다중 immunolabeling 프로토콜에서 수정을 설명 (예를 들어, 에피토프 검색, 여러 순차적 면역 염색, 네 스틴-GFP 형질 전환 마우스 (12)의 사용)이 많은 문제를 극복. 특히, 다중 순차 면역 프로토콜은 항체의 일부가 동일한 호스트로부터 유도 되더라도 최대 네 개의 상이한 항원에 대해 염색한다. 이 동시 유형 1, 유형 2A, 2B 형 및 3 형 전구 세포의 검출뿐만 아니라 단일 섹션 내에서 증식 활동을 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">티미딘 아날로그 투여</td></tr><tr><td>5-Bromo-2&prime;-deoxyuridine, BrdU</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B9285</td><td>독성(돌연변이 유발, 기형 유발)</td></tr><tr><td>5-Chloro-2&prime;-deoxyuridine, CldU</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6891</td><td>독성(돌연변이 유발, 기형 유발)</td></tr><tr><td>5-Chloro-2&prime;-deoxyuridine, CldU</td><td>MP Biomedicals</td><td>2105478</td><td>독성 (돌연변이 유발, 기형 유발)</td></tr> <tr><td>5-Iodo-2&prime; -deoxyuridine, IdU</td><td>MP Biomedicals</td><td>2100357</td><td>독성 (돌연변이 유발, 기형 유발)</td></tr><tr> <td colspan = "4 ">조직 준비</td></tr><tr><td>Isoflurane-Actavis</td><td>Piramal Healthcare</td><td>700211</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde powder (PFA)</td> <td>Riedel-De H &auml; en</td><td>16005</td><td>독성, 인화성</td></tr><tr><td>관류 펌프 PD5206</td><td>Heidolph Instruments</td><td>523-52060-00</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex Tygon 실험실 튜빙, &Oslash; 0.8 mm</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>06409-13</td><td></td></tr><tr><td>공급 바늘, 직선, 21 G, 1.75 mm 올리브 팁, 40 mm</td><td>Agnthos</td><td>1036</td><td></td></tr><tr><td>냉동 마이크로톰 Microm HM 400</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24웰 세포 배양 멀티웰 플레이트</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Immunohistochemistry</td></tr><tr><td>Tefal vitacuisine 증기선</td><td>Tefal</td><td>VS 4001</td><td></td></tr><tr><td>Netwell 24mm 폴리에스터 메쉬 멤브레인 인서트</td><td>Corning</td><td>3479</td><td>, 6웰 배양 플레이트에 사전 로드</td></tr>됨 <tr><td>Netwell 15mm 폴리에스터 메쉬 멤브레인 인서트</td><td></td><td>12웰 배양 플레이트에 사전 로드된</td>Corning <td>3477</td></tr><tr><td>Netwell 플라스틱 6웰 캐리어 키트</td><td>24mm 폴리에스테르 메쉬 멤브레인 인서트용</td><td>Corning</td><td>3521</td></tr><tr><td>Netwell 플라스틱 12웰 캐리어 키트</td><td>Corning</td><td>3520</td>(<td>15mm 폴리에스터 메쉬 멤브레인 인서트용</td></tr><tr><td>Vectastain Elite ABC 키트</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>DAB (3,3&prime;-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-5637</td><td>발암성, 감광성</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Primary antibodies</td></tr><tr><td>Rabbit IgG1 &alpha;-Ki67</td><td>Novocastra/ Leica Biosystems</td><td>NCL-L-Ki67MM1</td><td>DAB 1:400/IF 1:100; 항원결정기 회수 필요</td></tr><tr><td>토끼 &alpha;-GFAP, AS-3-GF</td><td>Synaptic Systems</td><td>173 002</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Goat IgG (H+L) &alpha;-GFP</td><td>Acris 항체</td><td>R1091P</td><td>1:300</td></tr><tr><td>Mouse IgG1 &alpha;-nestin</td><td>Abcam</td><td>ab6142</td><td>1:200; 항원결정기 회수 필요</td></tr><tr><td>기니피그 IgG (H+L) &alpha;-Doublecortin</td><td>Merck Millipore</td><td>AB2253</td><td>1:500</td></tr><tr><td>쥐 IgG2a &alpha;- BrdU (복수)</td><td>AbD Serotec/ Bio-Rad</td><td>OBT0030CX</td><td>BrdU 검출; DAB 1:500/IF 1:400</td></tr><tr><td>쥐 IgG2a &알파;-BrdU(정제)</td><td>AbD Serotec/ Bio-Rad</td><td>OBT0030&nbsp; &nbsp;</td><td>CldU의 탐지를 위해; DAB 1:500/IF 1:250-400</td></tr><tr><td>마우스 IgG1 &alpha;-NeuN</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB377</td><td>1:500</td></tr><tr><td>마우스 IgG1&#954; &#945;-BrdU</td><td>BD Biosciences</td><td>347580</td><td>IdU 검출용; DAB 1:500/IF 1:350</td></tr><tr><td colspan="4">2차 항체</td></tr><tr><td>alpha;-기니피그 IgG (H+L)-비오틴</td><td>디아노바</td><td>711-065-152</td><td>1:500</td></tr><tr><td>당나귀 &알파;-쥐 IgG (H+L)-비오틴</td><td>디아노바</td><td>712-065-150</td><td>1:500</td></tr><tr><td>당나귀 &알파;-마우스 IgG (H+L)-비오틴</td><td>디아노바</td><td>715-065-151</td><td>1:500</td></tr><tr><td>염소 &알파;-쥐 IgG (H+L)-Alexa Fluor 488</td><td>Molecular Probes</td><td>A11006</td><td>1:250</td></tr><tr><td>당나귀 &alpha;-염소 IgG (H+L)-Alexa Fluor 488</td><td>Molecular Probes</td><td>A11055</td><td>1:250</td></tr><tr><td>당나귀 &alpha;-mouse IgG (H+L)-FITC, Fab-Fragment</td><td>Dianova</td><td>715-097-003</td><td>1:100</td></tr><tr><td>당나귀 &alpha;-mouse IgG (H+L)-Alexa Fluor 647</td><td>Dianova</td><td>715-605-151</td><td>1:250</td></tr><tr><td>당나귀 &alpha;-기니피그 IgG (H+L)-Alexa Fluor 647</td><td>Dianova</td><td>706-605-148</td><td>1:250</td></tr><tr><td>당나귀 &alpha;-rat IgG (H+L)-Rhodamine Red-X</td><td>Dianova</td><td>712-295-150</td><td>1:250</td></tr><tr><td>당나귀 &alpha;-rabbit IgG (H+L)-Rhodamine Red-X</td><td>Dianova</td><td>711-295-152</td><td>1:250</td></tr><tr><td>당나귀 &alpha;-기니피그 IgG (H+L)-로다민 Red-X</td><td>Dianova</td><td>706-296-148</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Streptavidin-rhodamine Red-X</td><td>Dianova</td><td>016-290-084</td><td>1:500</td></tr><tr><td>염소 &alpha;-rabbit IgG (H+L)-AMCA</td><td>Dianova</td><td>111-155-144</td><td>1:250, 토끼 &alpha;에서만 작동합니다.-GFAP</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Molecular Probes</td><td>H3570</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Molecular Probes</td><td>D1306</td><td>1:1000</td></tr><tr><td colspan="4">Blocking </td></tr><tr><td>Fab-fragment 당나귀 &alpha;-mouse IgG (H+L)</td><td>Dianova</td><td>715-007-003</td><td>1:20</td></tr><tr><td>Fab-fragment 당나귀 &알파;-rabbit IgG (H+L)</td><td>Dianova</td><td>711-007-003</td><td>1:20</td></tr><tr><td>노멀 당나귀 세럼</td><td>Merck Millipore</td><td>S30</td><td></td></tr><tr><td>노멀 래빗 세럼</td><td>Dianova</td><td>011-000-010</td><td></td></tr><tr><td>노멀 염소 세럼</td><td>Dianova</td><td>005-000-001</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Histology</td></tr><tr><td>Cresyl violet</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5042</td><td></td></tr><tr><td>Neo-Clear</td><td>Merck Millipore</td><td>109843</td><td>무독성 크실렌 대체물</td></tr><tr><td>Neo-Mount</td><td>Merck Millipore</td><td>109016</td><td>영구 장착 매체</td></tr><tr><td colspan="4">현미경</td></tr><tr><td>Axioskop 2</td><td>Carl Zeiss 현미경 LSM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>710</td><td>Carl Zeiss 현미경 검사</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

동일한 호스트 종에서 항체와 면역 조직 화학 및 다중 라벨은 성인 해마 신경 발생을 연구하기 위해

Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis

성인 신경 새로운 뉴런 점점 커미트 중간 선조 아형을 통해 활성화 된 신경 줄기 세포에서 생성되는 고도로 조절되는 다단계 공정이다. 이들 아형 각각은, 함께, 특정 형태 학적 기준 그들의 식별을 위해 이용 될 수있는 특정 분자 표지의 집합을 표현한다. 일반적으로, 면역 형광 기법은 엑소 또는 내생 증식 마커와 함께 하위 특정 항체를 포함하는 적용됩니다. 우리는 여기에 성인 해마 신경 세포의 모든 단계의 검출과 정량 방법을 immunolabeling에 대해 설명합니다. 이들은 티미 딘 유사체, transcardial 관류, 조직 처리, 열 - 유도 에피토프 검색, 면역 조직 화학 ABC 여러 간접 면역 형광 공 초점 현미경 및 셀 정량의 적용을 포함한다. 또한 우리는 문제 U를 피하는 순차적 여러 면역 형광 프로토콜을 제시sually 같은 숙주 종에서 발생하는 일차 항체를 사용하는 필요성으로부터 발생. 그것은 하나의 섹션 내에서 증식 마커와 함께 모든 해마 전구 부속 유형의 정확한 식별을 할 수 있습니다. 이러한 기술은 병렬로 다른 전구 서브 타입의 조절, 뇌 병변에서의 참여와 특정 뇌 기능에서의 역할을 연구 할 수있는 강력한 도구입니다.

우리는 정량화 및 출생 후 성인 해마에서 신생아 세포의 특성을 위에서 설명한 방법을 적용했다. 따라서, 우리는 야생형 및 신경 결핍 사이클린 D2는 신경의 비율 (즉, 농축 환경, EE) 13, 14에 영향을 미치는 것으로 알려진 조건에서 보관 (Ccnd2 KO) 마우스를 내라 사용. Ki67, BrdU의, CldU 또는 이두 중 하나에 대한 면역 조직 화학 DAB 염색은 지속적으로 야생형과 Ccnd2 KO 마우스 (그림 3) (15) 사이의 신생아 세포 수의 차이를 한 것으로 밝혀졌습니다. 또한, CldU 및 이두의 연속 몰 주사와 함께 우리는 EE (그림 3C, D)의 특정 기간 동안 태어난 세포 집단을 구별 할 수 있었다. 섹션 3.2.4을 채택 우리는 성공적으로 동일한 신호 강도 및 동시 전송 (그림 4) 후 CldU 및 이두의 우수한 중복을 ...

이 비디오 기사는 동일한 조직 절편 내에서 성체 해마 신경 발생의 모든 단계를 감지하고 정량화하는 포괄적인 프로토콜을 보여줍니다. 우리는 다른 숙주 종의 적절한 항체를 사용할 수 없을 때 발생하는 간접 다중 면역 형광의 한계를 극복하기 위한 방법을 정교하게 만들었습니다.

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly ...

본 절차의 전반적인 목표는 서로 다른 숙주 종의 적절한 1차 항체를 사용할 수 없는 경우, 신경 전구 세포를 연구하기 위해 간접 면역형광법의 한계를 극복하는 것입니다. 우선, 분열하는 세포를 표지하기 위해 티미딘 유사체를 주입한 후, 조직을 채취하고 처리하여 동결 절편으로 제작합니다.그 다음, 순차적 다중 면역형광 염색을 시작합니다. 비표지 1차 항체를 처리한 후, 형광 표지된 2차 항체를 결합시킵니다. 이어서, 첫 번째 2차 항체의 노출된 부위를 1차 항체 종의 혈청으로 차단하고, 두 번째 2차 항체에 의해 인식될 수 있는 모든 면역글로불린을 비접합 fab 단편으로 덮어줍니다.이를 통해 조직을 두 번째 1차 항체로 처리할 수 있으며, 이는 다른 2차 항체로 표지될 수 있습니다. 최종적으로, 절편의 이미지는 특정 자극에 반응하는 신경 전구세포의 발달 및 조절과 특정 뇌 기능에서의 역할을 연구하는 데 사용됩니다. 동시 다중 면역형광법과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 동일한 숙주 종에서 생성된 1차 항체를 사용해야 할 때 일반적으로 발생하는 문제들을 피할 수 있다는 점입니다.이 방법은 생리학적 또는 약리학적 자극, 뇌 병변 또는 노화에 반응하는 해마 전구세포 하위 집단의 증식과 같은 성인 신경발생 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법이 처음인 연구자는 동일한 숙주 종 유래의 1차 항체를 이용한 다중 염색 시, 적절한 블로킹 없이는 원치 않는 항체 교차 반응이 발생할 수 있어 어려움을 겪을 수 있습니다. 먼저, 주사할 동물의 무게를 측정하고 주사용 10 mg/mL 티미딘 유사체 신선한 스톡 용액을 준비하십시오.용액이 준비되면, 30 gauge 바늘이 장착된 미세 투여용 주사기에 체중 조절 용량을 준비합니다. 그런 다음 마우스의 목덜미를 잡아 고정하고, 원하는 시점에 티미딘 유사체를 복강 내로 주입합니다. 마우스를 깊게 마취시킨 후, 10 mL의 얼음처럼 차가운 PBS로 심장 관류를 수행하고, 이어서 40 mL의 신선하고 얼음처럼 차가운 포름알데히드 용액으로 관류합니다.그 후 뇌와 뇌하수체를 적출하여 동일한 고정액으로 고정합니다. 수집한 뇌를 4°C의 10% sucrose에서 24시간 동안 배양합니다. 다음 날, 뇌를 30% sucrose로 옮겨 48시간 동안 추가로 배양합니다.동결 보호 처리가 완료된 뇌 조직을 -25 °C의 isopentane에서 급속

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오는 성인 해마의 신경 발생을 검사하는 데 사용되는 면역 형광 염색 방법을 보여줍니다. 초기에 쥐의 뇌 절편은 신경 전구 세포의 신경 발생과 관련된 마커 단백질을 겨냥한 1차 항체로 치료를 받습니다. 다음으로, 형광단으로 표지된 2차 항체로 표지됩니다. 그런 다음 뇌 단면을 컨포칼 현미경으로 관찰하여 마커 단백질의 뚜렷한 조합의 발현 패턴을 기반으로 전구 세포의 다양한 아형을 구별합니다.

성체 해마 신경 발생을 감지하기 위한 면역형광 염색 기법

이 동영상은 EdU incorpion을 사용하여 뇌 조직 절편에서 새로 증식한 신경 줄기 세포를 염색한 다음 면역 형광을 통해 특정 단백질을 시각화하여 세포 역학 및 증식에 대한 이해를 높이는 절차를 보여줍니다.

마우스 뇌 절편에서 증식된 신경 줄기세포를 시각화하기 위한 면역형광 염색

단백질의 지역화 및 배포는 세포 기능을 이해하기위한 중요한 정보를 제공합니다. 전자 현미경의 우수한 공간 해상도 (EM)는 주어진 항원에 따라 immunohistochemistry의 subcellular 지방화를 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 유지 항원은 EM 연구에 특히 곤란했던 반면 구조적 무결성을 유지 중추 신경계 (CNS)의 조직하십시오. 여기, 우리는 공부를 할 수있는 CNS에 구조와 항원을 보존하고 쥐 hippocampal CA1 피라미드 뉴런에서 시냅스 단백질을 특성화하는 데 사용 된 절차를 채택한다.

Hippocampal 슬라이스 문화의 시냅틱 단백질의 포스트 퍼가기 Immunogold 라벨링

성체 해마 신경 발생 동안, 정지된 신경 줄기 세포가 순차적으로 진행하고 회로에서 기능적으로 통합된 뉴런으로 발달할 때 뚜렷한 유전적 마커 세트가 발현됩니다. 열 유도 항원 회수를 사용하면 다른 방법으로는 검출하기 어려운 전구 세포 유형을 향상된 효과로 식별할 수 있습니다.

열 유도 항원 검색: 성체 해마 신경 발생 중 전구 세포 유형을 감지하고 식별하는 효과적인 방법

이 입문 수준 프로토콜은 미세아교세포와 신경 요소에 대한 마커를 예로 들어 설치류 뇌의 면역조직화학적 염색을 완료하는 데 필요한 시약, 장비 및 기술을 설명합니다.

미세 아교 세포와 신경 세포에 대한 예 염색 : 저온 절단 된 쥐의 뇌 조직에서 면역 조직 화학에 대한 입문서

우리는 신경 발달 기원인지 적자 특징으로 마우스 모델의 공간 학습 작업에 노출 된 다음 해마 신경 세포 활성화의 프로필을 연구하기 위해 면역 조직 화학 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은인지​​ 결핍을 특징으로 두 유전자 또는 약리학 마우스 모델에 적용될 수있다.

신경 발달 장애의 마우스 모델에서 공간 학습 후 해마 신경 세포 활동의 면역 시각화

특정 세포 유형에 대한 유전자 발현을 국소화하는 것은 특정 항체가 없기 때문에 어려울 수 있습니다. 여기에서는 이중 형광 RNA in situ hybridization과 immunostaining을 결합하여 유전자 발현을 동시에 삼중 검출하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

더블 형광 결합<em&gt; 현장에서</em&gt; 마우스 뇌 섹션에서 세 가지 유전자의 발현의 검출을위한 Immunolabelling와 하이브리드

이 프로토콜의 목표는 특정 국소 신경 회로의 화학 유전적 조작에 응하여 성인 신경 줄기/전구 세포의 행동을 분석하기 위한 접근법을 설명하는 것입니다.

성인 해마 신경 전구세포의 회로 특정 조절 을 시술

이 논문은 쥐의 성인 신경 발생을 측정하기 위해 BrdU 양성 세포를 시각화하는 가장 일반적인 4 가지 기술을 제시합니다. 이 작업에는 시약 준비, 티미 딘 유사체 투여, 심경 관류, 조직 준비, 퍼 옥시 다제 면역 조직 화학 반응, 면역 형광, 신호 증폭, 카운터 염색, 현미경 이미징 및 세포 분석에 대한 지침이 포함됩니다.

Thymidine Analog BrdU를 사용하여 쥐의 세포 증식 및 신경 발생을 분석하는 면역 조직 화학 기술

여기서, 프로토콜은 숙주 병원체 상호 작용을 연구하기 위하여 동일 종에서 제기된 1 차적인 항체를 사용하여 이중 표지면역형광을 수행하는 방법을 설명합니다. 또한, 본 프로토콜에서 상이한 숙주에서 제3 항체를 포함할 수 있다. 이 접근은 어떤 세포 모형 및 병원체든에서 할 수 있습니다.

호스트-병원균 상호 작용을 연구하기 위하여 동일 종에서 항체를 사용하여 면역 형광을 이중 표지합니다

여기에 제시된 것은 형광 활성화 핵 (FAN) 분류를 통해 대부분의 뉴런을 배제하는 마우스 치아 이랑에서 분리 된 단일 핵을 서열화하는 방법입니다. 이 접근법은 고품질 발현 프로필을 생성하고 신경 줄기 세포와 같은 희소 한 집단을 포함하여 틈새 시장에서 대표되는 대부분의 다른 세포 유형에 대한 연구를 용이하게합니다.

해마 신경인성 틈새를 연구하기 위해 단일 핵 RNA 시퀀싱과 결합된 뉴런의 형광 활성화 핵 음성 분류

배우세요 성인 해마 신경 발생의 모든 단계를 동일한 조직 섹션에서 정량화하는 방법을. 이 기법은 동일한 숙주 종에서 항체를 사용하여 간접 면역 형광의 한계를 극복하고 신경 전구 세포 연구의 정확성을 향상시킵니다.

동일한 호스트 종에서 항체와 면역 조직 화학 및 다중 라벨은 성인 해마 신경 발생을 연구하기 위해

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