Name: 의 종 특이 검출을위한 루프 - 매개 등온 증폭 (LAMP) 분석 실험 에이 메리아 닭을 감염이 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: 배우세요 닭의 에이메리아 감염을 LAMP 분석으로 진단하는 방법을. 장 샘플에서 DNA를 추출하여 45분 내에 종 특이 검출을 완료하고 양계 관리를 개선할 수 있습니다.

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이 연구에서 수행된 작업은 학생 연구 프로젝트 기금을 통해 왕립 수의과 대학, 생명공학 및 생물 과학 연구 위원회 및 국제 개발부(보조금 번호 BB/H009337/2)의 일부 지원을 받았습니다. 이 원고는 RVC에 의해 참조 PPB_00795 지정되었습니다.

1. 템플릿 준비 주 : 닭 감염 일곱 에이 메리아 종 중 하나로부터 유도 된 DNA를 포함하는 것으로 의심 상관 게놈 DNA 템플릿 LAMP 기반 에이 메리아 종 식별을위한 주형으로 사용될 수있다. 여기에 설명 된대로 필드 진단 분석을위한 장 조직 샘플 일상 사후 동안 수집해야합니다. <ol><li> 소장의 부분 (또는 섹션)을 선택 테스트 할 수 있습니다. 샘플 사이트 선택에 대한 안내 및 샘플링 사이트의 분포와 위치의 종 - 특정 범위의 18 현재와 그림 1이 될 가능성이 가장 높은 에이 메리아 종은 표 1을 참조하십시오. 참고 : 에이 메리아는 특히 호스트 사이트 특정 때문에이 키 중요하다. 닭을 감염 각각의 종은 (19)을 대상으로 장 지역에 따라 정의된다. 결정은 하나 미주리 이전 농장의 경험, 관심에 의해 영향을받을 수있다특정 에이 메리아 종 또는 다른 진단 지표 (6) 재. </li><li> 소비세 5cm 또는 메리아 멸균 가위 또는 메스를 사용하여 테스트하기 위해 선택한 장 섹션 (들)의 긴 길이. 선택적으로, 이러한 RNAlater 18 또는 95 % 에탄올 예를 들어 같은 고정액 후속 분석을 위해 샘플을 저장합니다. 참고 : 에탄올에 샘플을 저장하는 것은 멸균 트리스 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 철저하게 세척 할 필요가있는 경우 (TE)를 사용하기 전에 버퍼. </li><li> , 길이 방향으로 열려있는 샘플을 잘라 무료 멸균 유리 현미경 슬라이드의 가장자리 또는 에탄올 / 화염 멸균 가위 블레이드를 사용하여 점막층에서 세포를 가장 장 내용을 제거 (있는 경우) 및 긁어. 선택적으로 풀링 된 샘플에 대한 단일 관에서 종 특이 장 사이트의 네에서 세포를 포함한다. </li><li> (1) 100 ㎕를 포함한 무균 TE 완충액을 함유하는 멸균 1.5 ㎖의 스크류 - 탑 마이크로 원심 분리 튜브로 긁어 담을0 % (W / V) 100 Chelex 수지. </li><li> 1 분 동안 격렬하게 각각의 샘플을 흔들어. 상부 덮개가 단단히 닫혀 있는지 확인하고 10 분간 끓는 물에 목욕에 품어. </li><li> 끓는 후 각각의 샘플 1 ~ 2 분 동안 상온에서 냉각 할 수 있습니다. </li><li> 원심 분리기 1 분 최고 속도 (예를 들어, ~ 10,000 XG)에서 마이크로 원심을 사용하여 각 샘플. </li><li> 각 LAMP 분석에서 템플릿을 수행 할 수 상층 액 2 μl를 수집합니다. 선택적으로, 다중 사이트 분석을 제공하기 위해 하나의 튜브에 두 개 이상의 사이트를 장내 수영장. </li></ol> 2. 에이 메리아 LAMP 프라이머 준비 (사전 분석) <ol><li> (100) 분석에 적합한 에이 메리아 LAMP 프라이머 주식을 준비합니다 <ol><li> (제조자에 의해 지정) 100 μM의 농도로 분자 수준의 물을 첨가하여 각 동결 건조 에이 메리아 LAMP 프라이머를 복원합니다. 지정되지 않은 경우, 분자 수준의 물 날기 필요한 부피를 계산g 각 프라이머의 물리적 및 분자량. </li><li> 각 에이 메리아 종에 대해 별도의 0.5 ml의 플립 - 탑 마이크로 원심 튜브에 피펫 60 μL 분자 수준의 물을 분석한다. </li><li> 추가 FIP 프라이머, BIP, F3, B3, 일곱 종 특이 프라이머 믹스를 만드는 일련의 표 2에 나타내는 양을 사용하여 물에 대한 목표 에이 메리아 종 특정 LF 및 LB. </li><li> 간단히 와동 후, 프라이머 용액을 혼합하고 미세 원심 펄스 필요까지 동결. </li></ol></li><li> 각 에이 메리아 종을 분석 할 수 있도록 LAMP 반응 mastermix를 준비합니다. 샘플의 개수에 의해 표 3에 나타낸 양을 곱하고 양성 대조군과 음성 대조군 피펫 스페어 세 추가. 0.5 또는 1.5 ml의 피펫 플립 탑 microcentrifuge 관을. </li></ol> 3. 에이 메리아 LAMP 분석 <ol><li> 피펫 23 μL 에이 메리아 종 별 BST DNA 중합 효소 / LAMP는 0으로 mastermix.5 ml의 microcentrifuge 관. </li><li> 25 μL의 최종 반응 볼륨을 만들고, (섹션 1에서 제조) 2 μL의 DNA 템플릿을 추가합니다. </li><li> 하나의 반응 (양성 대조군)에 2 μL 에이 메리아 종 고유의 게놈 DNA를 추가합니다. 반응 (대조군)에 2 μL를 분자 수준의 물을 추가합니다. 주 : 종 특이 게놈 DNA를 사용할 수없는 경우 또는 이전의 긍정적 LAMP 표준 PCR 산물 대신 사용될 수있다. </li><li> 30 분 동안 62 O C 수조 또는 열차 단 부화. 반응이 즉시 판독하지 않을 경우에 선택적으로 10 분 동안 80 O C로 가온하여 BST DNA 중합 효소를 탈 활성화. </li></ol> 4. LAMP 분석 판독 <ol><li> 배양의 결론에 실내 조명 아래 눈에 의해 각 반응의 색상을 평가합니다. 부정적인 결과, 긍정적 인 결과는 하늘 (20) 청색으로 색에 보라색 분홍색으로 나타납니다. </li><li> 선택적으로, LABORAT의 LAMP 분석 결과를 확인1 X 트리스 / 붕산염 / EDTA (TBE) 버퍼에 2 % 아가 로스 겔을 이용하여 아가 로스 겔 전기 영동 한 μL DNA 겔 로딩 완충액으로 5 μL LAMP 반응 생성물을 혼합하여 모리 (5 μL 당 핵산 염색을 이용 중고 묻은 50 ㎖ 아가로 오스). 단편 크기 계산을 할 수 있도록 겔의 1 차선 1KB 분자 크기의 DNA 사다리의 5 μl를 추가합니다. </li></ol>

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저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

이 논문에 설명된 Eimeria 종 특이적 LAMP 분석은 콕시디아 및 질병 콕시듐증의 효과적인 통제를 지원하는 새로운 진단 도구 키트를 제공합니다. 아이메리안 감염의 결과에는 심각한 경제적 손실뿐만 아니라 조류 복지가 심각하게 손상되고 인수공통 병원균에 의한 식민지화에 대한 감수성 증가가 포함될 수 있습니다21. 일부 또는 모든 Eimeria 종의 발생에 대해 무리를 모니터링할 수 있는 기회는 항콕시디스 제어 효능의 붕괴에 대한 조기 경고를 제공할 수 있습니다. LAMP의 주요 장점은 6개의 서로 다른 DNA 서열 표적에 대한 요구 사항으로 인한 강력한 표적 특이성과 루프 프라이머13의 포함에 의해 강화된 높은 감도를 포함하지만, LAMP의 정량적 특성이 아닌 질적 특성이 한계로 간주될 수 있습니다. 현재 일상적인 화학 예방에서 낮은 수준의 기생충 탈출 또는 확인되지 않은 아이메르 복제에서 생백신 복제를 구별하는 것은 불가능합니다. 그럼에도 불구하고, 프로토콜의 기술적 용이성과 최종 판독은 기존의 전문적이고 종종 주관적인 병리학 및 형태학 주도 접근 방식에 비해 상당한 개선을 제공합니다6,7. 각 분석은 인건비 및 장비 설정 비용과 관계없이 샘플당 ~£0.75의 비용으로 완료될 수 있습니다. 따라서 LAMP 분석은 전문 장비가 필요 없는 등온 배양이 필요하기 때문에 PCR과 같은 다른 분자 진단보다 비용 효율적입니다. 
수년 동안 Eimeria 게놈 DNA를 주형으로 사용하는 것은 분자 현장 진단의 개발 및 적용을 제한했습니다. 난포는 아이메리안 수명주기에서 가장 쉽게 접근할 수 있는 단계이지만 일상적인 DNA 추출에는 실험실 시설이 필요합니다22. 다른 보다 불안정한 장 수명주기 단계에서는 PCR 억제 및 그에 따른 민감도 손실을 방지하기 위해 DNA 준비 전에 정제가 필요합니다23,24. 미세 원심분리기 및 수조보다 더 전문적이지 않은 장비를 사용하여 LAMP에 적합한 품질의 아이메르 DNA를 추출할 수 있는 능력과 chelex 수지를 사용한 억제제 흡착으로 보완되어 이제 아이메르 진단에서 분자 생물학의 광범위한 사용을 촉진합니다. 흥미롭게도, 기생충 감염 시작 20일 후, 마지막으로 검출 가능한 난포 배출 후 11일 후에 장 조직에서 정량적 PCR로 측정 가능한 Eimeria DNA가 검출된 것으로 보고된 것은 LAMP가 해결된 기생충 노출 및 진행 중인 감염을 감지하는 데 사용될 수 있다는 제안을 제기합니다25. 
LAMP Eimeria 진단의 상대적으로 저렴한 비용과 낮은 기술 요구 사항은 다른 보다 확립된 접근 방식을 사용할 수 없거나 적절할 수 있는 개발도상국에서의 적용을 촉진할 수 있습니다. 이를 적용하려면 각 분석이 각 지역 내에서 순환할 수 있는 모든 균주를 검출할 수 있어야 합니다. Eimeria 종 사이에 널리 퍼져 있는 유전적 다양성에 대한 이해는 제한적이지만26, 아프리카, 아시아, 유럽 및 남미의 균주를 대상으로 정량적 PCR에 사용하도록 이전에 검증된 표적 서열의 사용은 보존의 일부 증거를 제공하여 전 세계적으로 이러한 LAMP 분석의 유용성을 뒷받침합니다10.

글로벌 닭고기 생산은 개발 도상국이 선진국에서 목격 거의 4 배 확장 호스팅으로 10 배 이상 지난 50 년간 증가했다 <a href="http://www.faostat.org">(www.faostat.org을)</a> . 세계 식량 안보에 닭 생산의 관련성이 성장함에 따라 너무 너무 닭에 심각한 질병을 일으킬 수있는 병원체의 프로필을 가지고있다. 하나의 좋은 예는 장 질환 콕시듐증 일이 발생할 수 있습니다 에이 메리아 종, 유비쿼터스 원생 동물 기생충이다. 닭이 사육되는 곳마다 하나 이상의 에이 메리아 종은 2-4 일반적인 될 가능성이 있습니다. 선진국 에이 메리아 주로 저항 (5)의 영향을 최소화하기 위해 셔틀을 회전하거나 프로그램을 이용, 화학 요법에 의해 제어된다. 라이브 백신은 또한 새 값 비용을 정당화하기에 충분한 시스템에 사용된다 (예를 들면, 사진, 층 및 일부 육계 사육 5). resu으로임상 콕시듐증은 종종 잘 제어 이러한 조치의 LT, 준 임상 적 감염이 5 일반적인 않는다. 개발 도상국의 예방 접종에 드문 약물 응용 프로그램은 자주 덜 알렸다. 결과적으로 서브 임상 및 임상 콕시듐증은 더 일반적이고 중요한 경제적 영향 (3)을 발휘한다. 가장 널리 사용되는 채점 시스템의 경우에도 저자가 어떤 종은 &quot;이 같은 절차는 어떤하지만 중등도 감염을 시도할지 여부를 의심 보인다&quot;고 댓글을 달았하지만 eimerian 감염의 진단은 전통적으로 사후 득점 병변에 의존하고있다 (6). 형태 겹치는 전문가 6,7 제외한 모든 혼동 할 수 있지만 보충 증거, 배설물이나 쓰레기 샘플 환경에 강한 oocyst 수명주기 단계의 미세한 감지를 통해 수집 할 수 있습니다. 중합 효소 연쇄 반응을 이용하여 분자 대안 (PCR), 랜덤 amplificatio다형성 DNA PCR (RAPD-PCR) 및 정량 PCR 기술의 n은 최대 20 년 8 ~ 10 사용할 수 있었지만, 지금까지 그들은 인기를 끌고 못했다. 상대 비용과 전문 실험실 장비 또는 처리에 대한 요구 사항은 종종 주관적이고 기술적으로 까다로운 이전 pathology-의 자연과 현미경 기반이 10,11 접근에도 불구하고, 자신의 흡수를 제한했다. 이러한 제한은 빈곤에 콕시듐증의 영향 (12) 비례 적으로 더 클 수있다 등 동남 아시아 등 세계의 가난한 지역의 많은 과장 될 수있다. 응답하여, 에이 메리아 종 특이 진단법 및 신규 간단 민감하지만, 비용 효과에 대한 명백한 요구되고있다. 루프 - 매개 등온 증폭 (LAMP)는 다량의 DNA를 증폭 할 수있는 DNA 폴리머 라 구동 기술을 조제 쉽다. 가장 중요한 것은, LAMP는 BST의 DNA 폴리머 a를 사용SE 대신 13,14 열 사이클에 대한 요구없이 단일의 일정한 온도에서 DNA 증폭을 용이하게 통상적으로 사용 된 PCR의 Taq DNA 중합 효소. LAMP는 가장 기본적인 실험실에서 또는 현장에서 적용 할 의무가있다. 많은 PCR 억제제, 높은 감도 및 특이성에 대하여 저항 특징 인, LAMP 세이 감염성 점액낭 질환 바이러스, 및 클로스 트리 디움 퍼프 린 젠스 15-17 포자충 등 병원균의 광범위한 개발되었다. 응답에서 닭을 감염 일곱 에이 메리아 종의 각 특정 LAMP 분석의 패널 (18)을 개발 한 새로운 비용 효율적인 에이 메리아 종 별 진단 요구하는. 새로운 분석을위한 응용 프로그램은 가난한 경제 PE와 에이 메리아의 최대 또는 메리아의 necatrix으로 종의 관계를 주어진 특정 값의 모니터링 기생충 발생을 포함3,4 rformance. 다른 응용 프로그램은 농장의 항 콕시듐 전략, 준 임상 적 감염이나 임상 적 질환과 농장에 메리아로 인한 위험의 평가 진단의 효능을 평가하는 것을 포함한다.

<table><tbody><tr><td>RNAlater</td><td></td><td>Ambion AM7024</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>VWR 화학 물질</td><td>20821.321</td><td>주의, 고인화성</td></tr><tr><td>100 x Tris-EDTA (TE) 버퍼 농축액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9285</td><td></td></tr><tr><td>Chelex 100 수지</td><td>Bio-Rad</td><td>142-1253</td><td></td></tr><tr><td>분자 등급 물</td><td>Invitrogen</td><td>10977035</td><td></td></tr><tr><td>E. acervulina F3</td><td>시그마-알드리치</td><td>VC00021</td><td>*CCTAACATTTCGCTTCACGGAC</td></tr><tr><td>E. acervulina B3</td><td>시그마-알드리치</td><td>VC00021</td><td>*ATGAGCAAGTGGAACACCTTG</td></tr><tr><td>E. acervulina FIP</td><td>시그마-알드리치</td><td>VC00021</td><td>*AGAGCACAGTGGCAGTGC-AGCAGACAGCATGGCTTACCT</td></tr><tr><td>E. acervulina BIP</td><td>시그마-알드리치</td><td>VC00021</td><td>*GAAGACCCTCTGAAGAACGGA-CCTTCTCACCGCTTACCGG</td></tr><tr><td>E. acervulina LB</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*TAAGGTTACACCCGTGGAGG</td></tr><tr><td>E. acervulina LF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GCCATGCACAAAGCGACTT</td></tr><tr><td>E. brunetti F3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GGCCATCAAGTTCCATGAGC</td></tr><tr><td>E. brunetti B3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*TCAACCTCCTGAGTGTGGTT</td></tr><tr><td>E. brunetti FIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>* GAAAATGCCTTCGTAGCTGCT-GCTGGGTACGGAGCGTCTT</td></tr><tr><td>E. 브루네티 BIP</td><td>시그마-알드리치</td><td>VC00021</td><td>*TACTTCCTAGGATCCATCCTCGC-AGTTTCGCTGCCGCCTC</td></tr><tr><td>E. 브루네티 LB</td><td>시그마-알드리치</td><td>VC00021</td><td>*GAAACGCTCGAACATGGC</td></tr><tr><td>E. 브루네티 LF</td><td>시그마-알드리치</td><td>VC00021</td><td>*CTTCTCCACAGACCCAGAGGT</td></tr><tr><td>E. 맥시마 F3</td><td>시그마-알드리치</td><td>VC00021</td><td>* ACTACGGAAAAAAAGTGCGTAGCT</td></tr><tr><td>E. 맥시마 B3</td><td>시그마-알드리치</td><td>VC00021</td><td>*CCTTCCTCCCTTCTGAAAACTG</td></tr><tr><td>E. 맥시마 FIP</td><td>시그마-알드리치</td><td>VC00021</td><td>*GAGTCACTGCTGATGTACCAAA AG-GAACTATGCCGCTTTCCCCTG</td></tr><tr><td>E. 맥시마 BIP</td><td>시그마-알드리치</td><td>VC00021</td><td>*AGAATGCGGATTTGTTAGCAGC-AGCAAGTCCAAGGTGTGTA</td></tr><tr><td>E. 맥시마 LB</td><td>시그마-알드리치</td><td>VC00021</td><td>* CAAGCCTACGCGGACATC</td></tr><tr><td>E. maxima LF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*TTATGCAGCTGGGTCAACG</td></tr><tr><td>E. mitis F3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*ACGATAGCCAAGACACGTAAGG</td></tr><tr><td>E. mitis B3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*CCCCGTGATAAGAGTAGGAACA</td></tr><tr><td>E. mitis FIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*CGCGGGTCGTGAGATTTAAATT AT-GGAAGATCAGGACGGGCACT</td></tr><tr><td>E. mitis BIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GTTTCAGTTGATGAACAAGCGA GA-TGCGCCTCTAGAATCAAGACG</td></tr><tr><td>E. mitis LB</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*TCCATGCATCCCCTTGTT</td></tr><tr><td>E. mitis LF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*CGTGGGCACAGATTGATTC</td></tr><tr><td>E. necatrix F3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*TGGCTTTCCCGCGTACC</td></tr><tr><td>E. necatrix B3</td><td>시그마-알드리치</td><td>VC00021</td><td>*CGGCCCAACACAAAGACTG</td></tr><tr><td>E. necatrix FIP</td><td>시그마-알드리치</td><td>VC00021</td><td>*CGCTTGAGTTTTTTAAGCTATGCA CA-GACCCAAGCAGCTCACCAA</td></tr><tr><td>E. necatrix BIP</td><td>시그마-알드리치</td><td>VC00021</td><td>*CGCCATGCCATTCAATGAACG-*GAGGCATACCGGCGTTGTC</td></tr><tr><td>E. necatrix LB</td><td>시그마-알드리치</td><td>VC00021</td><td>*GTCTGTAACTTGGGACGTTGT</td></tr><tr><td>E. 네카트릭스 LF</td><td>시그마-알드리치</td><td>VC00021</td><td>*GAACAGCCGGAGCCTCTC,</td></tr><tr><td>E. praecox F3</td>, <td>시그마-알드리치</td><td>VC00021</td><td>*GCCCTTGTATGTTGCTGTTTCT</td></tr>, <tr><td>E. praecox, B3</td>, <td>시그마-알드리치</td><td>VC00021</td><td>*GCGCACGAATCTGAATCACAC,</td></tr><tr><td>E. praecox, FIP</td><td>, 시그마-알드리치</td><td>VC00021</td><td>*ATCTCCTCAAAGACTTTCGCGT , A-GCGCTTGGCTATATCCATAGG</td></tr>, <tr><td>E. praecox, BIP</td><td>, 시그마-알드리치</td><td>VC00021</td><td>*GCTCTCGTGGCATACTTGC-GCCAGGAGCCACTGATTGT</td></tr><tr><td>E. praecox LB</td><td>시그마-알드리치</td><td>VC00021</td><td>*GAATAGCATTGCCAGGTGG</td></tr><tr><td>E. praecox LF</td><td>시그마-알드리치</td><td>VC00021</td><td>*GTCCACTGTCATTAATATTGC TGC</td></tr><tr><td>E. tenella F3</td><td>시그마-알드리치</td><td>VC00021</td><td>*GCTTGTGAAGGTCAGCGTG</td></tr><tr><td>E. 테넬라 B3</td><td>시그마-알드리치</td><td>VC00021</td><td>* GCTGAGTCCATACGTACTTCCT</td></tr><tr><td>E. tenella FIP</td><td>시그마-알드리치</td><td>VC00021</td><td>*GCCACTGCTATGGAAAGTCAC AC-CATAACTGGCATGCAGGGGT</td></tr><tr><td>E. tenella BIP</td><td>시그마-알드리치</td><td>VC00021</td><td>*GTTTGGCCCGAAAGTTGTGAA GA-CGTCAGAAATTGCTGCCCAAT</td></tr><tr><td>E. 테넬라 LB</td><td>시그마-알드리치</td><td>VC00021</td><td>*CGCATGTGCAGTTGAAGACA</td></tr><tr><td>E. 테넬라 LF</td><td>시그마-알드리치</td><td>VC00021</td><td>*CCAAATGTATATCTGCTAGTTATA TTAACAAG</td></tr><tr><td>10 x ThermoPol 반응 버퍼</td><td>New England Biolabs</td><td>B9004S</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Promega</td><td></td><td>U1330</td><td></td></tr><tr><td>베타인 용액 (5 M)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0300</td><td></td></tr><tr><td>Bst 중합효소</td><td>New England Biolabs</td><td>M0275S</td><td></td></tr><tr><td>하이드록시나프톨 블루</td><td>시그마-알드리치</td><td>33936</td><td>분자 등급의 물에 용해됩니다.</td></tr><tr><td>UltraPure 아가로스</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>10 x Tris/Borate/EDTA (TBE) buffer</td><td>Invitrogen</td><td>AM9863</td><td></td></tr><tr><td>Blue/Orange DNA loading dye (x6)</td><td>Promega</td><td>G1881</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1Kb DNA ladder</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0313</td><td></td></tr><tr><td>SafeView 핵산 염색</td><td>NBS Biologicals</td><td>NBS-SV</td><td></td></tr></tbody></table>

의 종 특이 검출을위한 루프 - 매개 등온 증폭 (lamp) 분석 실험<em&gt; 에이 메리아</em&gt; 닭을 감염이

Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Eimeria 종의 기생충은 장 질환인 콕시듐증을 일으키는 원생동물로 닭의 생산과 복지에 심각한 위협이 됩니다. 효과적인 통제가 없으면 임상적 콕시듐증은 치명적일 수 있습니다. Eimeria를 제어하기 위해 자주 사용되는 화학 예방제에 대한 내성은 일반적이며 무증상 감염이 널리 퍼져 있어 사료 전환 비율 및 Clostridium perfringens와 같은 다른 병원체에 대한 감수성에 영향을 미칩니다. 중합효소연쇄반응(PCR) 기반 도구를 사용할 수 있음에도 불구하고 Eimeria 감염 진단은 여전히 병변 점수 매기기 및 난포낭 형태학과 같은 기존 접근 방식에 거의 전적으로 의존하지만 둘 다 간단하지는 않습니다. 기존 분자 도구의 한계에는 전문 장비가 필요하고 DNA를 템플릿으로 액세스하는 데 어려움이 있다는 것입니다. 이에 대응하여 닭을 감염시키는 것으로 확인된 7개의 Eimeria에 대해 간단한 현장 DNA 준비 프로토콜과 종 특이적 루프 매개 등온 증폭(LAMP) 분석 패널이 개발되었습니다. 이제 사후 수집된 장 조직에서 게놈 DNA를 준비한 후 LAMP 분석의 설정 및 판독을 설명하는 자세한 프로토콜을 제공합니다. Eimeria 종 특이적 LAMP는 기생충 발생을 모니터링하고, 농장의 항콕시듐 전략의 효능을 평가하고, 전문가 감시가 불가능할 때 특히 가치가 있는 무증상 감염 또는 임상 질병을 진단하는 데 사용할 수 있습니다.

분석 검증 검증 동안 각 에이 메리아 종 특이 LAMP 분석은 호스트 제어로서 닭뿐만 아니라, 닭 게놈 DNA를 감염 일곱 에이 메리아 종을 나타내는 순수한 DNA 샘플의 패널을 사용하여 시험 하였다. 아가로 오스 겔 전기 영동은 각각의 분석을 해결하는 데 사용없이 호스트 교차 반응 (18)와 절대 종 특이성을 입증했다. 다음에, 10 배 일련 희석 시리즈 게놈 DNA는 하나 내지 열 게놈 사본 (18)의 분석 감도 한계를 공개 정제 에이 메리아 tenella를 사용하여 제조. 상한은 최고 농도 (100,000 게놈 부) (18)를 포함한 포지티브까지 달성 결과로 결정되지 않았다. 필드 샘플 응용 프로그램 에이 메리아 시험용 샘플을 수집 (p)의 결과로서 추려, 죽은 닭으로부터 유래 될 가능성OOR 건강 또는 하나 사이에 세 가지의 가능성이 표본의 크기를 나타내는, 감시 건강 감시 학살 할 때 루틴의 일부. 감시 프로그램의 일환으로 미국의 육계 농장에서 수집 한 세 마리의 새를 테스트하는 것은 장 샘플 3 세트 얻었다. 각 에이 메리아 종 (표 1)에 대한 선호 장 사이트를 우선 순위, 종 특이 LAMP 분석의 응용 프로그램을 대상으로 한 지표로 블루 hydroxynaphthol (그림 2A)를 사용하여 테스트 한 모든 조류에 eimerian 감염의 시각적 식별을 허용했다. hydroxynaphthol 블루를 사용하는 경우 음의 LAMP 반응을 달성 색상은 핑크 보라색에 이르기까지 다양하지만, 항상 긍정적 인 결과에 의해 달성 푸른 구별된다 할 수 있습니다. 아가로 오스 겔 전기 영동으로 확인이 비교 결과 (그림 2B)를 제공했다. 현장 적용시 사용자는 일곱 종에 대해 전체 화면을 적용하도록 선택하거나 같은 우선 순위 만 종을 대상으로 할 수있다중요하거나 알려진 농장에서 순환 또는 주변 지역합니다. 에이 메리아의 발생이 새로운 테스트의 편의를 위해 요구 사항을 강조위한 PCR 기반 접근 방식의 고장 진단으로 설립 될 수 있습니다. LAMP는 PCR보다 간단 준비와 처리를 제공하지만, 조류 당 여러 장 사이트를 테스트 할 수있는 요구 사항은 실망 남아있다. 하나 이상의 LAMP 분석법으로 테스트 할 수있는 조류 당 단일 풀링 된 DNA 시료의 생산은 더 매력적이 될 가능성이 높다. 각 장 사이트가 개별적으로 처리했을 때와 동일한 결과 (도 2 일곱 LAMP 분석법으로 시험을 위해, 표 1에 기재된 DNA 준비 전에 풀링 특정 장내 사이트들 각각으로부터 수집 된 물질을 나타내는 조류 하나씩 풀링 된 샘플을 제공 처리 ) 그림 3과 비교. <img alt="그림 1" src=&quot;/files/ftp_upload/52552/52552fig1.jpg&quot;/&gt; 닭을 감염 에이 메리아 종 기생충의 LAMP 감지 그림 1. 장내 샘플링 사이트는. 각 에이 메리아 종의 대상이 장 영역은 E. (점선 검은 선 사이의 숫자로 표시 샘플링 선호하는 사이트와, 색 선으로 강조 acervulina : 노랑 / 1, E.의 브루 네티 : 핑크 / 2, E. 최대 값 : 블루 / 3, E. mitis가 각각 1 주 씩으로 : 레드 / 5, E.의 praecox : 오렌지 / 4, E.의 necatrix 녹색 / 6 E. tenella를 : 회색 / 7). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52552/52552fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52552/52552fig2.jpg" /> eimerian 감염의 그림 2. 램프 진단 이리저리푸른 하늘 반응은 긍정적이었다 핑크 반응에 보라색이 부정적이고, (B) 아가로 오스 겔 전기 영동 경우 m 세 상업 육계. LAMP 반응은, (A)를 사용하여 블루 hydroxynaphthol 해결. 샘플링 사이트는 장내 기생충 각 종 표 1에 나타내었다. A = E. acervulina, B = E. 브루 네티, 엄마 = E. 최대, 미 = E. mitis가 각각 1 주 씩으로, N = E. necatrix, P = E. praecox 및 T = E. 돌 가사리. 레인 1 GeneRuler 1KB DNA 사다리가 포함되어 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52552/52552fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52552/52552fig3.jpg" /> eimerian 감염의 그림 3. 램프 진단은 세 개의 분리 된 상업 육계에서 샘플을 풀링 사용. 램프 REAC을TIONS는 하늘색 반응은 긍정적이었다 핑크 반응에 보라색이 부정적 hydroxynaphthol 파란색을 사용하여 해결. A = E. acervulina, B = E. 브루 네티, 엄마 = E. 최대, 미 = E. mitis가 각각 1 주 씩으로, N = E. necatrix, P = E. praecox 및 T = E. 돌 가사리. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52552/52552fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 샘플 사이트 </td><td> 에이 메리아 종 분석 (대부분) </td></tr><tr><td> 십이지장 (D) </td><td> E.의 acervulina, E.의 praecox </td></tr><tr><td> 공장 / 회장의 * (J / I) </td><td> E. 최대, E.의 necatrix </td></tr><tr><td> Caeca (C) </td><td> E.의 necatrix, E. tenella를 </td></tr><tr><td> 터미널 회장 (TI) </td><td> E.의 브루 네티, E. mitis가 각각 1 주 씩으로 </td></tR&gt; <tr><td> 풀링 된 샘플 (P) </td><td> E.의 acervulina, E.의 브루 네티, E. 최대, E. mitis가 각각 1 주 씩으로, E.의 necatrix, E.의 praecox, E. tenella를 </td></tr></tbody></table> 후보 에이 메리아 종 분석 표 1. 장내 영역 별 선택. 지역의 선택은 그림 1에 도시 된 바와 같이 각각의 에이 메리아 종에 따라 다릅니다 샘플링합니다. 풀링 된 샘플은 다음 DNA의 준비를 위해 결합 된 네 개의 특정 사이트에서 수집 된 자료를 포함한다. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 프라이머 * </td><td> 주식 농도 (μM) </td><td> 볼륨 (μL) </td></tr><tr><td> 물 </td><td> - </td><td> (60) </td></tr><tr><td> 앞으로 내부 프라이머 (FIP) </td><td> (100) </td><td> (40) </td></tr><tr><td> 이전 버전과의 내부 PRI의메르 (BIP) </td><td> (100) </td><td> (40) </td></tr><tr><td> 앞으로 외부 프라이머 (F3) </td><td> (100) </td><td> (10) </td></tr><tr><td> 이전 버전과의 외부 프라이머 (B3) </td><td> (100) </td><td> (10) </td></tr><tr><td> 루프 전달 (LF) </td><td> (100) </td><td> (20) </td></tr><tr><td> 이전 버전과의 루프 (LB) </td><td> (100) </td><td> (20) </td></tr><tr><td> 합계 </td><td></td><td> (200) </td></tr></tbody></table> LAMP 프라이머 프리믹스 표 2. 준비. LAMP의 프라이머 프리믹스를 준비하는 데 필요한 구성 요소와 비율. 표시된 볼륨은 100 LAMP 반응에 대한 것입니다. * 자료에 도시 된 바와 같이 프라이머의 정체성 Barkway 등 (2011) 18. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> 주식 진한 없음 </td><td> 최종 반응 진한 없음 </td><td> 반응 당 볼륨 (μL) </td></tr><tr><td> DDW </td><td> - </td><td> - </td><td> 10.1 </td></tr><tr><td> ThermoPol 버퍼 </td><td> 10 × </td><td> 1 개 </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> 황산 </td><td> 100 mM의 </td><td> 2 mM의 </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> 프라이머 믹스 * </td><td colspan="2"> 표 2 </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> 의 dNTPs </td><td> 25 mM의 </td><td> 400 μM의 </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td> 베타 </td><td> 5 M </td><td> 1 M </td><td> (5) </td></tr><tr><td> Hydroxynaphthol 블루 </td><td> 3 mM의 </td><td> 120 μM </td><td> (1) </td></tr><tr><td> BST DNA 중합 효소 </td><td> 8000 U / ㎖ </td><td> 8 U </td><td> (1) </td></tr><tr><td> 합계 </td><td></td><td></td><td> (23) </td></tr></tbody></table> LAM 표 3. 준비P 반응 mastermix. * 에이 메리아 종 특이.

닭의 Eimeria 감염 진단은 여전히 까다롭습니다. 기생충 형태학 및 숙주 병리학 주도 접근법은 일반적으로 결론을 내리지 못하는 반면, PCR을 기반으로 하는 분자 접근법은 비용과 전문성 면에서 까다로운 것으로 입증되었습니다. 이 프로토콜의 목적은 루프 매개 등온 증폭(LAMP)을 eimerian 감염에 대한 간단한 분자 진단으로 확립하는 것입니다.

의 종 특이 검출을위한 루프 - 매개 등온 증폭 (LAMP) 분석 실험<em&gt; 에이 메리아</em&gt; 닭을 감염이

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the ...

이 절차의 전반적인 목표는 닭 또는 닭 무리에서 I myea 종 기생충의 발생을 진단하는 것입니다. 이는 먼저 루프 매개 등온 증폭 또는 램프 반응을 위해 시약을 준비함으로써 수행됩니다. 다음으로, 전체 게놈 DNA는 사후 하나 이상의 장 부위에서 준비됩니다.그런 다음 게놈 DNA를 램프 마스터 믹스에 첨가하고 배양합니다. 마지막으로 램프 테스트의 결과를 평가합니다. 궁극적으로 LAMP는 특정 I miria 종의 발생을 결정하여 재고 관리를 개선하고 질병 진단을 위한 도구로 사용됩니다.따라서 형태학적 현미경 검사법 또는 PCR과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 주관적이지 않고 값비싼 실험실 시설이 필요하지 않기 때문입니다. 이 접근 방식을 사용하면 아리안 감염 진단을 개선하여 닭의 건강과 복지를 개선할 수 있습니다. Erea 램프 ase에 대한 템플릿을 준비하려면 테스트할 장 부분을 선택합니다.이 표를 샘플 사이트 선택과 가장 많이 존재할 가능성이 있는 에리아 종에 대한 지침으로 사용하십시오. 닭을 감염시키는 각 종은 멸균 가위나 메스를 사용하여 표적으로 하는 장 부위에 의해 정의되기 때문에 이것은 매우 중요합니다. eria를 검사하기 위해 선택한 장 단면의 5cm 이상의 길이를 절제합니다.샘플을 세로로 자릅니다. 대부분의 장 내용물을 제거하고 멸균 유리 현미경의 가장자리를 사용하십시오. 가위 날을 밀거나 살균하여 점막층에서 세포를 긁어냅니다.긁어낸 재료를 100%의 무게로 멸균 TE 100마이크로리터가 들어 있는 멸균 1.5ml 나사 상단 마이크로 원심분리기 튜브에 넣고 볼륨 셀 X 100 수지를 넣고 상단을 단단히 조입니다. 샘플을 1분 동안 세게 흔든 다음 끓는 물 중탕에서 10분 동안 배양합니다. 끓인 후 각 샘플을 주변 온도에서 1-2분 동안 식히십시오.10의 분석실험을 위해 충분한 I miria 램프 뇌관 주식을 준비하기 위하여 템플렛으로 이용될 램프 분석실험 당 상등액의 2개의 마이크로리터를 모으기 전에 1 분 동안 10, 000 시간 G에 표본을 원심분리기하십시오. 100마이크로몰 피펫 농도에 분자 등급 물을 60마이크로리터의 분자 등급 물을 추가하여 분석할 각 홍채 종에 대해 별도의 0.5ml 플립 탑 마이크로 원심분리기 튜브에 추가하여 각 동결건조된 I miria 램프 프라이머를 재구성합니다. 이 표에 표시된 볼륨을 사용합니다.프라이머, F-I-P-B-I-P-F 3 B, 3 LF 및 LB 특정 대상 에리아 종을 물에 첨가합니다. 7종의 특이적 프라이머 믹스 시리즈를 만듭니다. 프라이머 용액을 간단히 반전시켜 혼합하고 펄스를 가하여 마이크로 퍼지를 실행하고 필요할 때까지 얼립니다.이 표에 나열된 부피와 텍스트 프로토콜의 지침을 사용하여 각 홍채 종에 대한 램프 반응 마스터 믹스를 준비하여 램프 분석 피펫 23마이크로리터의 IEA 종 특이적 B-S-G-D-N-A 중합효소 램프 마스터 믹스를 0.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다. 이전에 준비된 DNA 템플릿 2마이크로리터를 추가하여 최종 반응 부피 25마이크로리터를 양성 대조군으로 만듭니다. 하나의 반응에 2마이크로리터의 eria 종 특이적 게놈 DNA를 추가합니다.분자 등급의 물 2마이크로리터를 음성 대조군으로 반응에 첨가하여 섭씨 62도에서 30분 동안 수조 또는 열 블록을 배양합니다. 선택적으로 B-S-T-D-N-A 중합효소를 섭씨 80도까지 10분 동안 가열하여 비활성화합니다. 실내 조명 아래에서 배양이 끝날 때 반응을 즉시 읽지 못할 경우 눈으로 각 반응의 색상을 평가하십시오.부정적인 결과는 분홍색에서 보라색으로 나타나고 긍정적인 결과가 나타납니다. 선택적으로 하늘색. 램프 분석 결과를 확인하려면 5마이크로리터의 램프 반응 생성물과 1마이크로리터의 DNA 겔 로딩 버퍼를 혼합하고 사전 염색된 2%ARO 겔에서 실행합니다.1개의 킬러 염기 분자 크기의 DNA 사다리를 사용하여 3개의 단편 크기를 결정합니다. 감시 프로그램의 일환으로 미국 육계 농장에서 수집한 조류는 다음과 같이 3세트의 장 샘플을 산출했습니다. 종 특이적 램프 분석의 표적 적용 및 각 I miria에 대해 선호되는 장 부위의 우선 순위를 지정합니다.이 종은 하이드록시 나탈 블루(hydroxy natal blue)를 지표로 사용하여 테스트한 모든 조류에서 홍채 감염을 시각적으로 식별할 수 있었습니다. 하이드록시를 사용할 때 음의 램프 반응으로 얻어진 색상은 보라색에서 분홍색까지 다양할 수 있지만 항상 긍정적인 결과로 얻은 파란색과 구별됩니다. aose gel 전기영동에 의한 확인은 여기에 나타난 것과 유사한 결과를 제공했습니다.각 특정 장 부위에서 수집된 물질을 나타내는 조류 한 마리당 하나의 채취한 샘플에서 DNA를 준비하고 7개의 램프 분석으로 테스트한 결과 각 장 부위를 별도로 처리했을 때와 동일한 결과를 얻을 수 있었습니다. 이 기술을 마스터하면 이 절차에 따라 적절하게 수행하면 45분 이내에 수행할 수 있습니다. 전반적인 장 건강을 평가하기 위해 병변 점수와 같은 다른 기술도 수행할 수 있습니다.

loop-mediated-isothermal-amplification-lamp-assays-for-species

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

출처: 돔슬, K. J. 외. 동물성 식품 내 살모넬라 선별과 배양 분리 확인을 위한 루프 매개 등온 증폭.  J. Vis. 경험 (2020).이 영상은 일정한 온도에서 DNA를 증폭하여 목표 박테리아 유전자를 검출하는 루프 매개 등온 증폭(LAMP) 기법을 시연합니다. 반응 혼합물은 등온 마스터 믹스, 표적 유전자에 대한 특정 프라이머, DNA 주형이 포함된 샘플을 첨가하여 준비됩니다. 증폭은 LAMP 기기에서 시작되며, 실시간 형광 모니터링을 통해 표적 유전자의 존재를 확인합니다.

박테리아 유전자 검출을 위한 루프 매개 등온 증폭

여기에서는 환자 샘플에서 C. burnetii를 검출하기 위해 동결건조 시약을 사용하는 간단한 루프 매개 등온 증폭(LAMP) 방법을 설명했습니다.

의 탐지를위한 동결 건조 루프 - 매개 등온 증폭 시약의 개발<em&gt; Coxiella burnetii의</em

현재 다중화 Zika, chikungunya, 뎅 그 열 바이러스 복잡 한 샘플 준비 및 비싼 장비를 요구 하 고 저 리소스 환경에서 사용 하기 어려운 검출 하는 진단. 우리는 감지 하 여 높은 감도와 특이성이이 바이러스를 차별화 대상 특정 가닥 displaceable 프로브 등온 증폭을 사용 하는 진단을 보여줍니다.

멀티플렉스 등온 증폭 Zika, Chikungunya, 뎅 그 열의 1 감지 진단 플랫폼을 기반으로

이 문서는 Bemisia tabaci 루프 중재 등온 증폭 (램프) 기술 기반에 대 한 빠른 식별 분석 결과 대 한 프로토콜을 보고 합니다. 프로토콜은 최소한의 실험실 훈련이 필요 하 고 따라서, 항구, 공항 등 식물 수입에 대 한 항목의 지점에서 현장 구현 될 수 있습니다.

루프-중재 등온 증폭 (램프) 분석 결과 Bemisia tabaci 의 빠른 식별

여기서, 우리는 포자조이트 또는 2세대 메로조이트에 의한 닭에이메리아 기생충의 안정적인 형질변환을 달성할 수 있는 방법을 제공했다. 이종 항원 유전자를 발현하는 유전자 변형 에이메리안 기생충은 백신 전달 차량으로 사용될 수 있었다.

닭 에이메리아 기생충의 핵 과 생체 내 전파

우리는 기존의 RT-PCR 기술에 비해 상대적으로 짧은 기간 동안 간단한 악기를 사용하여 틸라피아 물고기에서 TiLV의 검출을위한 RT-LAMP 분석법을 제시한다. 이 프로토콜은 특히 개발도상국에서 TiLVD의 전염병 확산을 제어하는 데 도움이 될 수 있습니다.

틸라피아 호수 바이러스의 특이적이고 신속한 검출을 위한 역전사 루프 매개 등온 증폭(RT-LAMP) 분석

루프 매개 이소성 증폭(LAMP)은 병원체 검출 분야에 대한 폭넓은 관심을 받고 있는 이더스말 핵산 증폭 시험(iNAAT)이다. 여기서, 우리는 동물성 식품에서 살모넬라를 선별하고 문화 격리에서 추정 살모넬라를 확인하는 신속하고 신뢰할 수 있고 강력한 방법으로 다연구소 검증 살모넬라 LAMP 프로토콜을 제시합니다.

동물성 식품에서 살모넬라를 선별하고 문화 격리에서 살모넬라를 확인하기 위한 루프 중재 이더말 증폭

현장이나 실험실에서 분석할 수 있는 루프 매개 이더스말 증폭(LAMP) 분석과 결합된 필터 종이 DNA 추출 방법을 사용하여 수원에서 피토프토라 캡시 동물원을 검출하는 방법을 개발했습니다.

루프 매개 이소르말 증폭을 사용하여 관개물에서 피토프토라 캡시 검출

다양한 박테리아 병원체는 호흡기 감염을 일으킬 수 있으며 정확하게 감지하고 신속하게 치료하지 않으면 심각한 건강 문제를 초래할 수 있습니다. 루프 매개 등온 증폭을 통해 이러한 병원체를 빠르고 정확하게 검출하면 임상 환경에서 호흡기 감염을 효과적으로 관리하고 제어할 수 있습니다.

Microfluidic-Chip-based Loop-Mediated Isothermal Amplification을 통해 하기도 감염을 일으키는 세균성 병원체의 신속한 검출

이 프로토콜은 전체 세포의 급속한 탐지 다음 토마토와 다른 신선한 농산물의 표면 샘플링을위한 간단한 접착제 테이프 기반의 접근 방식을...

접착제 테이프 기반의 샘플링 및 형광의 조합 현장에서</em의 신속한 감지를 위해> 하이브 리다이 제이션 살모넬라균 신선한 농산물에 대한

배우세요 닭의 에이메리아 감염을 LAMP 분석으로 진단하는 방법을. 장 샘플에서 DNA를 추출하여 45분 내에 종 특이 검출을 완료하고 양계 관리를 개선할 수 있습니다.

의 종 특이 검출을위한 루프 - 매개 등온 증폭 (LAMP) 분석 실험

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