의 종 특이 검출을위한 루프 - 매개 등온 증폭 (LAMP) 분석 실험

이 절차의 전반적인 목표는 닭 또는 닭 무리에서 I myea 종 기생충의 발생을 진단하는 것입니다. 이는 먼저 루프 매개 등온 증폭 또는 램프 반응을 위해 시약을 준비함으로써 수행됩니다. 다음으로, 전체 게놈 DNA는 사후 하나 이상의 장 부위에서 준비됩니다.

그런 다음 게놈 DNA를 램프 마스터 믹스에 첨가하고 배양합니다. 마지막으로 램프 테스트의 결과를 평가합니다. 궁극적으로 LAMP는 특정 I miria 종의 발생을 결정하여 재고 관리를 개선하고 질병 진단을 위한 도구로 사용됩니다.

따라서 형태학적 현미경 검사법 또는 PCR과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 주관적이지 않고 값비싼 실험실 시설이 필요하지 않기 때문입니다. 이 접근 방식을 사용하면 아리안 감염 진단을 개선하여 닭의 건강과 복지를 개선할 수 있습니다. Erea 램프 ase에 대한 템플릿을 준비하려면 테스트할 장 부분을 선택합니다.

이 표를 샘플 사이트 선택과 가장 많이 존재할 가능성이 있는 에리아 종에 대한 지침으로 사용하십시오. 닭을 감염시키는 각 종은 멸균 가위나 메스를 사용하여 표적으로 하는 장 부위에 의해 정의되기 때문에 이것은 매우 중요합니다. eria를 검사하기 위해 선택한 장 단면의 5cm 이상의 길이를 절제합니다.

샘플을 세로로 자릅니다. 대부분의 장 내용물을 제거하고 멸균 유리 현미경의 가장자리를 사용하십시오. 가위 날을 밀거나 살균하여 점막층에서 세포를 긁어냅니다.

긁어낸 재료를 100%의 무게로 멸균 TE 100마이크로리터가 들어 있는 멸균 1.5ml 나사 상단 마이크로 원심분리기 튜브에 넣고 볼륨 셀 X 100 수지를 넣고 상단을 단단히 조입니다. 샘플을 1분 동안 세게 흔든 다음 끓는 물 중탕에서 10분 동안 배양합니다. 끓인 후 각 샘플을 주변 온도에서 1-2분 동안 식히십시오.

I miria 램프 뇌관 주식을 준비하기 위하여 템플렛으로 이용될 램프 분석실험 당 상등액의 2개의 마이크로리터를 모으기 전에 1 분 동안 10, 000 시간 G에 표본을 원심분리기하십시오. 100마이크로몰 피펫 농도에 분자 등급 물을 60마이크로리터의 분자 등급 물을 추가하여 분석할 각 홍채 종에 대해 별도의 0.5ml 플립 탑 마이크로 원심분리기 튜브에 추가하여 각 동결건조된 I miria 램프 프라이머를 재구성합니다. 이 표에 표시된 볼륨을 사용합니다.

프라이머, F-I-P-B-I-P-F 3 B, 3 LF 및 LB 특정 대상 에리아 종을 물에 첨가합니다. 7종의 특이적 프라이머 믹스 시리즈를 만듭니다. 프라이머 용액을 간단히 반전시켜 혼합하고 펄스를 가하여 마이크로 퍼지를 실행하고 필요할 때까지 얼립니다.

이 표에 나열된 부피와 텍스트 프로토콜의 지침을 사용하여 각 홍채 종에 대한 램프 반응 마스터 믹스를 준비하여 램프 분석 피펫 23마이크로리터의 IEA 종 특이적 B-S-G-D-N-A 중합효소 램프 마스터 믹스를 0.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다. 이전에 준비된 DNA 템플릿 2마이크로리터를 추가하여 최종 반응 부피 25마이크로리터를 양성 대조군으로 만듭니다. 하나의 반응에 2마이크로리터의 eria 종 특이적 게놈 DNA를 추가합니다.

분자 등급의 물 2마이크로리터를 음성 대조군으로 반응에 첨가하여 섭씨 62도에서 30분 동안 수조 또는 열 블록을 배양합니다. 선택적으로 B-S-T-D-N-A 중합효소를 섭씨 80도까지 10분 동안 가열하여 비활성화합니다. 실내 조명 아래에서 배양이 끝날 때 반응을 즉시 읽지 못할 경우 눈으로 각 반응의 색상을 평가하십시오.

부정적인 결과는 분홍색에서 보라색으로 나타나고 긍정적인 결과가 나타납니다. 선택적으로 하늘색. 램프 분석 결과를 확인하려면 5마이크로리터의 램프 반응 생성물과 1마이크로리터의 DNA 겔 로딩 버퍼를 혼합하고 사전 염색된 2%ARO 겔에서 실행합니다.

1개의 킬러 염기 분자 크기의 DNA 사다리를 사용하여 3개의 단편 크기를 결정합니다. 감시 프로그램의 일환으로 미국 육계 농장에서 수집한 조류는 다음과 같이 3세트의 장 샘플을 산출했습니다. 종 특이적 램프 분석의 표적 적용 및 각 I miria에 대해 선호되는 장 부위의 우선 순위를 지정합니다.

이 종은 하이드록시 나탈 블루(hydroxy natal blue)를 지표로 사용하여 테스트한 모든 조류에서 홍채 감염을 시각적으로 식별할 수 있었습니다. 하이드록시를 사용할 때 음의 램프 반응으로 얻어진 색상은 보라색에서 분홍색까지 다양할 수 있지만 항상 긍정적인 결과로 얻은 파란색과 구별됩니다. aose gel 전기영동에 의한 확인은 여기에 나타난 것과 유사한 결과를 제공했습니다.

각 특정 장 부위에서 수집된 물질을 나타내는 조류 한 마리당 하나의 채취한 샘플에서 DNA를 준비하고 7개의 램프 분석으로 테스트한 결과 각 장 부위를 별도로 처리했을 때와 동일한 결과를 얻을 수 있었습니다. 이 기술을 마스터하면 이 절차에 따라 적절하게 수행하면 45분 이내에 수행할 수 있습니다. 전반적인 장 건강을 평가하기 위해 병변 점수와 같은 다른 기술도 수행할 수 있습니다.