Name: 마우스 모델에서 조직 공학 혈관의 생성 및 손톱 확장 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 4 s
Description: 배우세요 마우스 모델에서 조직 공학 혈관을 생성하는 방법을, PiPSCs와 생물반응기를 사용하여 기능성 이식편을 만듭니다. 이 기술은 혈관 재생의학 연구에 활용됩니다.

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이 연구는 영국 심장 재단(British Heart Foundation)과 오크 재단(Oak Foundation)의 지원을 받았습니다.

실험 동물의 사용 및 관리에 대한 기관위원회에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 모든 동물 실험을 수행합니다. 문화 미디어 1. 준비 <ol><li> F-12K 보통, 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 100 U / ml의 페니실린과 스트렙토 마이신 : 인간 섬유 아 세포주 CCL-153 배지 만들기. </li><li> PiPSC 생성을위한 프로그램을 다시 미디어를 확인 : 마네 둘 베코의 수정 독수리의 매체 (DMEM) 20 % 녹아웃 혈청 교체, 0.1 MM의 β-머 캅토 에탄올, 0.1 mM의 최소 필수 중간 (MEM) 비 필수 아미노산, 10 NG / ml의 염기성 섬유 아세포 성장 인자를 포함하는 2 (bFGF를-2) 및 100 U / ml의 페니실린과 스트렙토 마이신. 미디어를 사용하기 전에 bFGF를-2를 갓마다 추가합니다. </li><li> 평활근 세포를 유도 분화 매체 (DM)를 확인 (SMC) 분화 : 10 % FBS, 0.1 밀리미터 β 머 캅토 에탄올, 100 U가 / ㎖ 및 스트렙토 마이신 25 NG / ml의 혈소판 유래 성장 인자를 포함하는 미디어-MEM (α)(PDGF-ββ). </li><li> 확인 내피 분화 미디어 내피 세포 (EC)의 분화를 유도하는 (EC-DM) : 내피 성장 미디어 -2- (EGM-2) 50 NG를 함유 배지 / ㎖ 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 100 U / ml의 페니실린과 스트렙토 마이신. </li></ol> 부분적으로 유도 다 능성 줄기 세포로 재 프로그램 2. 인간 섬유 아세포 (PiPSC) <ol><li> 배양액을 0.04 % 젤라틴 용액 도포 플라스크에 배양 인간 섬유 아세포 세포주 CCL-153. </li><li> 통로 셀 (1)의 비율로 3 일마다 6. PiPSC 발생의 최적의 효율성을 위해 통로 (9) 전에 세포를 사용합니다. 90 % 컨 플루 - 세포는 80에 도달하면 형질 전환을위한 준비가되어 있습니다. </li><li> (4) 재 프로그래밍 인자를 함유하는 폴리 시스 트론 플라스미드 pCAG2LMKOSimO 선형화 옥타 - 결합 전사 인자 4 (인 Oct4)를 SOX2, 크 룹펠 형상 인자 4 (KLF4) 및 C-MYC (pCAG-OSKM). 37 ° C에서 3 시간 동안 PvuI 제한 효소 5 유닛 플라스미드 5 μg의 다이제스트. 정화제조 업체의 프로토콜에 따라 상용 키트와 함께 플라스미드. </li><li> 트랜 제조 업체의 프로토콜에 따라 인간 피부 섬유 아세포 (NHDF) nucleofection 키트와 함께 전기에 의한 선형 pCAG-OSKM 플라스미드 4 μg의 2 × 10 (6) 인간 섬유 아세포. 부드럽게 미리 예열 재 프로그래밍 매체 5 mL를 함유하는 미리 0.04 % 젤라틴 코팅 된 T25 플라스크에 형질 감염된 세포를 시드. </li><li> 24 시간 후, 형질 세포의 순수한 인구를 선택하는 25 ㎍ / ml의 네오 마이신의 보충제 매체 변경합니다. </li><li> 4 일까지 매일 매체를 변경합니다. 참고 : 인간 섬유 아세포는 재 프로그래밍 4 일 후에 PiPSC된다. </li></ol> 내피 세포 및 평활근 세포에 PiPSC 3. 차별화 <ol><li> 4 일 동안 DM을 포함하는 콜라겐 IV의 사전 코팅 요리에 씨 PiPSC는 SMCs로 분화를 유도합니다. 4 일까지 매일 매체를 변경합니다. </li><li> 콜라겐 IV의 사전 코팅 요리 C에 씨앗 PiPSC육일에 대한 내피-DM을 ontaining은 내피 세포로 분화를 유도합니다. 6 일까지 매일 매체를 변경합니다. </li></ol> 4. 탈세 포화 대동맥 이식 준비 참고 : 모든 솔루션과 장비는 멸균해야한다. <ol><li> 자궁 경부 전위로 마우스를 희생하고 해부 현미경 부정사 위치에 마우스를 고정합니다. </li><li> 흉강을 엽니 다 흉골을 통해 흉곽 주위를 잘라. 대동맥을 노출 심장, 폐, 식도를 제거합니다. 부드럽게 집게로 사망시 대동맥의 지방을 제거합니다. </li><li> 가위로 앞쪽 끝에서 대동맥을 잘라 부드럽게 무딘 집게로 끝을 잡고. 무딘 절개에 의한 뒤에 척추 열에서 대동맥를 분리합니다. 조심스럽게 바이폴라 electrocoagulator와 결찰에 의해 대동맥에서 모든 분기 동맥을 닫고 가위로 결찰의 끝에서 절단. </li><li> 3m로 대동맥 루멘를 세척하기 위해 5 ML의 주사기를 사용하여혈전의 형성을 방지하기 위해 100 U 헤파린을 함유하는 식염수 L. </li><li> 신장으로 가지 전에 대동맥의 뒤쪽 끝을 잘라. 대동맥의 무결성을 유지하면 전체 절차를 수행하는 동안 매우 중요합니다. </li><li> 인산 완충 식염수 (PBS)에 희석 0.075 % 소듐 도데 실 설페이트 (SDS) 용액 5 ㎖와 대동맥 루멘 플러시. </li><li> 10cm 페트리 접시에 0.075 % SDS 솔루션의 흉부 대동맥을 적 십니다. 실온에서 150 rpm에서 2 시간 동안 진탕에 페트리 접시를 놓습니다. </li><li> PBS의 5 ml의 대동맥 루멘을 플래시합니다. </li><li> 10cm 페트리 접시에 PBS의 대동맥을 적 십니다. 실온에서 150 rpm에서 2 시간 동안 진탕에 페트리 접시를 놓습니다. PBS마다 20 분을 새로 고칩니다. </li><li> PBS의 5 ml의 대동맥 루멘을 플래시합니다. </li><li> 최대 일주일 동안 4 ° C에서 PBS에서 탈세 포화 대동맥 이식을 유지합니다. </li></ol> PiPSC 및 생물 반응기 컨디셔닝 5. 듀얼 시드 참고 : 모든 솔루션을s와 장비는 멸균해야한다. 조직 문화 후드에서 모든 작업을 수행합니다. <ol><li> 그림 1에 도시 된 바와 같이. 생물 반응기의 흐름 회로를 조립 튜브와 함께 배양 챔버, 미디어 저수지, 연동 펌프 및 규정 준수 챔버를 연결합니다. 순환에 필요한 매체의 최소한의 부피는 40 ml의입니다. </li><li> 전제 조건 10cm 페트리 접시에 DM 매체 대동맥 담가 배지와 탈세 포화 된 용기. 실온에서 50 rpm으로 1 시간 동안 진탕에 페트리 접시를 놓습니다. </li><li> 현미경으로 탈세 포화 된 선박의 양쪽에 1cm 길이 나일론 튜브 (OD 0.9 mm, ID 0.75 mm)를 삽입합니다. 선박과 8-0 실크 봉합사와 튜브를 묶어. </li><li> 챔버 벽으로부터의 입구 및 출구 포트 (1/32 &quot;튜브)와 나일론 튜브를 연결하여 배양 챔버에서 탈세 포화 된 대동맥 이식술을 조립한다. 매체의 5mls 각 시간 배양 챔버를 유지한다. </li><li> 추가 예열로를 Trypsinize PiPSC트립신은 배양 접시를 커버하고 부드럽게 요리 10 배 바위. 트립신을 취소하고 2 인큐베이터에서 접시를 떠나 - 3 분. 접시에 예열 문화 매체를 추가하고 세포와 매체를 혼합한다. </li><li> 혈구를 사용하여 세포 수를 계산합니다. 원심 분리기 300 x g에서 5 분 동안 5 × 105 세포를 함유하는 각각의 세포 현탁액의 두 분액. 완전히 뜨는을 대기음. </li><li> 완전히 상층 액을 흡입 한 후, DM의 50 μL에 주사위 세포 펠렛 1 펠렛을 재현 탁. 탈세 포화 혈관 내강에이 세포 현탁액을 주입한다. </li><li> 이어서, 마트 리겔 100 ㎕의 주사위에 다른 세포 펠렛을 재현 탁. 조심스럽게 탈세 포화 대동맥 이식 상 혼합물을 피펫. </li><li> 혼합물이 용기 외부 표면을 감싸는 고르게 겔 상태로 전환 때까지 15 분 - 10 기다립니다. DM으로 배양 챔버를 입력합니다. </li><li> 37 ° C에서 5 % CO 2 배양기에서 설정 전체 생물 반응기를 배치. 수동으로 처음 2 시간에서 탈세 포화 이식을 종축 모든 반 시간 약 90 ° 회전합니다. </li><li> 세포 부착 가능하도록 12 시간 동안 정적 문화를 유지합니다. </li><li> 평활근 세포의 분화를 유도하는 연동 펌프로 루멘을 통해 DM을 제공한다. 5 ml / 분 및 24 시간에 걸쳐 20 ㎖ / 분으로 단계적으로 증가시 초기 유속을 시작합니다. </li><li> 24 시간 동안 20 ㎖ / 분에서 매체 순환 유량을 유지. </li><li> 매체 흐름을 중지하고 인큐베이터에서 설정 생물 반응기를 이동합니다. </li><li> 다시 씨앗 PiPSC와 이식의 루멘. 5.6 -를 Trypsinize는, 단계 5.5로 계산 원심 분리기 1 × 6 PiPSC. 50 NG / ㎖ VEGF를 함유 EGM-2 배지에 50 μl의 세포를 재현 탁. 그래프트의 루멘으로 세포 혼합액을 주입한다. </li><li> 내피 세포의 분화를 유도하기 위해 50 NG / ml의 VEGF를 포함 EGM-2 배지에 배양 챔버 및 전체 순환 매체를 변경합니다. </li><li> 토륨 설정을 다시 생물 반응기를 이동전자 인큐베이터. 수동으로 이식을 처음 2 시간 90 ° 30 분마다 회전 한 다음 12 시간 동안 정적 문화를 유지. </li><li> 5 ㎖ / 분, 35 ㎖ / 분으로 단계적으로 상승에 순환류 시작. 오일에 35 ㎖의 유속 / 분 유지. 매일 순환 챔버 매체 변경합니다. </li><li> 마우스에 더 이식에 대한 설계 이식을 수확. </li></ol> 마우스로 두 번 시드 PiPSC 이식 6. 손톱 <ol><li> 사용 NOD.CB17-Prkdc의 SCID / 혈관 이식받는 사람으로 NcrCrl 수컷 마우스. 35g, 그리고 좋은 건강 상태를 유지하고 있습니다 - 항상 마우스는 약 10 주입니다 약 25의 무게를 확인합니다. </li><li> 복강 Hypnorm (25 ㎎ / kg) 및 Hypnovel (25 ㎎ / kg)의 조합을 투여함으로써받는 마우스를 마취. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 눈에 바셀린 안과 연고를 적용합니다. 마우스는 편안한 근육을 가지고 꾸준히 호흡하도록함으로써 효율적인 마취를 확인합니다. <ol><li> 목 면도 및 확장에 누운 위치에 마우스를 고정합니다. 마우스 호흡기가 선명합니다 있는지 확인하기 위해 마취제와 함께 아트로핀 황산 (1.7 ㎎ / ㎏)을 관리합니다. </li></ol></li><li> 마우스의 흉골에 하악에서 중간 선 절개를 준비합니다. 5 ~ 10 배 증폭과 해부 현미경, 측면 오른쪽 침샘을 들어 올려 오른쪽 경동맥을 노출 할 권리 cleidomastoid 근육을 제거합니다. </li><li> 조심스럽게 기단을 향해 선단에서 오른쪽 경동맥을 동원에 부착 된 조직을 제거합니다. 8-0 실크 봉합사로 두 번 경동맥 중간 부분을 결찰하고 두 관계 사이 해부. </li><li> 각 용기의 끝에서 멸균 나일론 튜브로 만든 커프를 통과 microhemostat 클램프 각 끝을 고정합니다. </li><li> 한 끝에 봉합 넥타이를 제거하고 헤파린의 드롭 (100 U / ml)에 적용됩니다. 직후 번째의 선단부를 반전전자 동맥 전체 커프 몸을 커버하고 팔목에 8-0 실크 봉합사로 반전 용기를 해결합니다. <ol><li> 동맥의 다른 부분에 동일한 절차를 반복한다. 식염수로 세척 동맥이 혈전을 제거합니다. </li></ol></li><li> 동맥 커프 통해 용기의 탈세 포화 된 단부 슬라이딩 8-0 실크 봉합사로 고정하여 경동맥 양단 탈세 포화 용기 그래프트 임플란트. 이식의 맥동을 평가하기 전에를 종료에서 혈관 클램프를 제거합니다. </li><li> 원래 위치로 오른쪽 침샘을 놓습니다. 6-0 polyglactin 봉합사를 사용하여 중단 된 봉합 수술 위치에 피부를 닫습니다. </li><li> 절차가 완료된 후에는 의식이 재개 될 때까지 지속적으로, 마우스의 활력 징후를 관찰한다. 자궁 경부 전위 수확 용기 이식에 의해 24 시간 이상 추가 분석을 위해 삼주를받는 사람 쥐를 희생. </li></ol>

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</ol>

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현재 프로토콜은 기능적 조직 공학 혈관 PiPSC 인간 섬유 아세포를 사용하여 생성 될 수있는 사운드, 빠르고, 단순하고 재현성 효율적인 전략을 나타낸다. 이 기술은 가까운 미래의 재생 의학, 조직 공학 및 잠재적 환자 맞춤형 세포 치료를위한 유용한 도구를 나타냅니다. 프로토콜의 효능을 보장하는 중요한 단계는 혈관 생물 반응기에서 PiPSC의 준비, 멸균 완전히 탈세 포화 대동맥 이식, 발판에 PiPSC의 성공적인 파종과 분화의 준비와 대동맥 이식의 유지 불임을 포함한다. 조직 공학 이식의 성공적인 생성을 시작하기 위해, PiPSC의 제조를 효과적으로 수행되도록하여 가장 중요하다. 프로토콜 성공적 pCAG2LMKOSimO OSKM 플라스미드와 nucleofection 통해 PiPSC로 인간 섬유 아세포 세포주 &#39;를 재 프로그램&#39;있다. surviv 중nucleofection 후 섬유 아세포의 알은 높은 품질의 OSKM 플라스미드를 사용하는 등 몇 가지 주요 포인트...

혈관 도관의 건설은 심혈관 질환으로 인한 손상 및 손상된 혈관의 수술 수리에 대한 기본적인 전략이다. , 동종 이식,자가 조직 (심낭 또는 복재 정맥)과 이종 이식 1, 현재까지 수술에 사용 된 이식 재료는 생체 적합성 합성 고분자 ([고어 텍스의 ePTFE] 또는 폴리에틸렌 테레 프탈레이트 [쿠론] 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 [테플론, 확장 된 폴리 테트라 플루오로 에틸렌)을 포함한다. 인공 이식 (예를 들어 고어 텍스 쿠론)이 가장 일반적으로 사용되는 반면, 이러한 재료 가능성 협착증, 칼슘 증착, 혈전 색전 감염을 포함 수많은 장단기 합병증을 일으킨다. 와 현재 생물학적 이식 환자는 혈전 색전증 감소하지만, 그들은 여전히 석회화 열화이 때문에 차 이식 실패 및 단축 내구성으로 제한을 발생합니다. 따라서, 수술 t을 크게 향상에도 불구하고년, 연구자와 임상의를 통해 echniques 여전히 혈관 질환을위한 이상적인 도관을 식별의 필요성 부담한다. 더 최근에, 혈관 조직 공학의 연구 분야는 세포를 성공적 래프팅 1 기능성 용기 전형 생체 모방 환경을 만들 목적으로, 생분해 성 지지체에 혼입되어있는 개념을 생성하고있다. 기본적으로 혈관 구조의 성공은 세 가지 필수 구성 요소에 따라 달라집니다; 즉, 발판, 내피 세포 내층 및 평활근 세포 층, 네이티브 맥관계에 필적 기계적 특성을 제공하기 위해 적절한 세포 외 기질을 함유하는 지지체, 및 / 조절을 개시에 필요한 세포 / 분자 시그널링을 포함 셀 수리. 장기 이식 개통과 신 조직의 지속적인 개발, 제 비계의 효과적인 세포 파종에 크게 의존ereby 매우 중요한 세포 유형의 결정을 렌더링. 몇몇 보고서 소경 도관 3-6 개발 성숙한 내피 다양한 소스로부터 평활근 세포의 사용을 입증한다. 유망하지만, 충분한자가 혈관 내피 부족 성숙한 평활근 세포가 상당한 부담으로 작용 얻었다. 최근에, 다양한 소스로부터의 줄기 세포는 혈관 조직 공학 어플리케이션에 이용되어왔다. 실제로, 배아 줄기 세포 (7)를 포함한 줄기 세포 다양한 종류의 유도 된 다 능성 줄기 세포 (iPSCs) 8,9, PiPSC 10,11, 골수 유래 단핵구 (12), 중간 엽 줄기 세포 (13), 혈관 내피 전구 세포 및 성숙한 혈관벽 줄기 세포 유래 한 항원 SCA (-1) + (14, 15)이 정의 된 모든 미디어에 응답 내피 기능 중 하나 또는 평활근 세포로 분화 할 수있는 것으로 입증되었다 줄기 / 선조 세포 및배양 조건. 또한, 줄기 세포의 무제한 자기 갱신 용량은 그들 만 성숙한 내피 성장 정지 및 노화를 진행하기 전에 한정된 횟수 위해 나눌 수 평활근 세포와 달리 더 나은 후보를 만든다. 그 래프팅은 생체 적합성, 생체 역학적 특성 및 생분해 속도 등 여러 가지 요인에 따라 달라위한 골격 물질의 선택은 성공적인 조직 공학적 용기를 생성한다. 기본적으로, 물질은 생분해해야 이식을위한 발판을 만드는 데 사용하고 불필요한받는 사람 면역 반응을 탑재되지 않습니다. 또한, 세포 부착과 이후의 생존에 적합한 기공 및 미세을 포함해야합니다. 현재까지, 혈관 조직 공학에서 사용되는 지지체 가장 일반적인 재료는 폴리 글리콜 산, 폴리 락트산, 폴리 카프로 락톤 ε (16)의 중합체를 포함한다. 최근 탈세 포화 된 생물학적 물질은 할또한 일부 성공을 적용. 여러 실험실자가 세포와 탈세 포화 인간, 개 또는 돼지의 혈관을 뿌리는 것은 응고 내막 증식증 17-19 저항 생물학적 이식을 한 것으로 나타났습니다. 혈관 조직 공학의 다른 전략은 비계 지원 (20), (21)없이 예를 들어, 세포 외 기질 단백질 기반의 혈관 이식, 섬유소 젤 (13)에 파종 세포 생성 세포 시트를 포함한다. 현재의 프로토콜 기능 내피 세포와 평활근 세포, 중증 합병 면역 결핍증에 조직 공학 혈관의 기능 PiPSC 유래 혈관 세포를 항구 탈세 포화 된 혈관 지지체로 구성된 생물 반응기 및 이식의 세대 (SCID에 인간 PiPSC의 분화를 보여줍니다 ) 마우스. PiPSC이 세포는 쥐에서 종양을 형성 윤리적 제기하지 않기 때문에 혈관 이식의 조직 공학에 사용할 최적의 세포 유형이며,동종 면역 반응. 더욱이, 우리는 핍 내피 세포 및 핍 - 평활근 세포를 생성하기위한 전략이 효율적인 10,11 재현임을 보여 주었다. 그 후, 우리는 따라서 이식과 생존 효능을 향상 밀접하게 네이티브 용기 내에 존재하는 기질 단백질을 모방하는 PiPSC 유래 혈관 세포의 파종을위한 탈세 포화 된 선박을 설계​​했습니다. 또한, 종래 PiPSC 뿌리기에 용기의 탈세 포화가 대 식세포 등의 면역 세포 유형에 의해 마운​​트 염증 반응의 발생을 방지한다. 더 중요한 것은,이 프로토콜은 단지 인간 번역에 대한 혈관 도관 유망 생성하는 방법을 나타내지 않는, 또한 연구 및 마우스 모델을 통해 혈관 조직 재생을 제어하는​​ 분자 메커니즘을 이해 귀중한 수단을 제공한다.

<table><tbody><tr><td>인간 섬유아세포, CCL-153</td>, <td>ATCC</td>, <td>CCL-153</td>, <td>태아기 인간 배아 섬유아세포,</td></tr><tr><td>ATCC F-12K 매체(Ham's F-12 매체의 Kaighn's Modification</td>)<td>ATCC</td><td>30-2004</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td>, <td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>배아 줄기세포에 최적화된 녹아웃 DMEM 배지</td><td>Life technologies (Gibco)</td><td>12660-012</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacement</td><td>Life technologies (Invitrogen)</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Human Basic FGF-2&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-837</td><td></td></tr><tr><td>알파 MEM 매체</td><td>생명 기술 (Invitrogen)</td> <td>32571093</td><td></td></tr><tr><td>인간 PDGF</td><td>R & D 시스템</td><td>120-HD-001</td><td></td></tr><tr><td>젤라틴 용액 2%</td><td>시그마</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>플라스미드 20866: pCAG2LMKOSimO (SOX2, OCT4, KLF4, C-MYC)</td><td>추가진</td><td>20866</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; PvuI 제한 효소</td><td>New England Biolabs</td><td>RO150S</td><td></td></tr><tr><td>SureClean Plus</td><td>Bioline</td><td>BIO-37047</td><td></td></tr><tr><td>Nucelofection Kit (NHDF Kit)</td><td>LONZA</td><td>VPD-1001</td><td></td></tr><tr><td>Neomycin</td><td>SIGMA</td><td>G418</td><td></td></tr><tr><td>KL 1500 LCD, Stereo Microscopy용 조명</td><td>SCHOTT</td><td>KL 1500 LCD</td><td>입체 현미경</td></tr><tr><td>용 냉광 조명니콘 줌 스테로현미경 SMZ800</td><td>니콘</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>헤파린 나트륨 염</td><td>시그마</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>10% SDS 원액 분자 생물학 시약</td><td>Severn Biotech</td><td>CAS 151-21-3</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco의 인산염 완충 식염수</td><td>시그마</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>마트리겔(10mg/ml)</td><td>BD</td><td>A6661</td><td></td></tr><tr><td>쉐이커 IKA Vibrax, 쉐이킹 플랫폼 VX 7&nbsp;</td><td>젭슨 볼튼, 잰키& Kunkel</td><td>S32-102</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S 디지털 펌프 드라이브</td><td>Cole-Parmer</td><td>WZ-07523-80</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S 6-채널, 6-롤러 카트리지 펌프 헤드</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07519-15</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S 펌프 헤드용 대형 카트리지</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07519-75</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex 백금 경화 실리콘 펌프 튜브, L/S 14, 25 ft</td><td>Cole-Parmer&nbsp;</td><td>WZ-96410-14</td><td>튜빙은 연동 펌프</td></tr><tr><td>0.5mm ID, 0.8mm OD 실리콘 튜빙</td>을 통과합니다. <td>SILEX</td><td>N/A</td><td>튜빙은 인큐베이션 챔버, 미디어 저장소 및 컴플라이언스 챔버를 연결합니다.</td></tr><tr><td>피팅 리듀서 0.5에서 1.6, 천연 폴리프로필린</td><td>Ibidi</td><td>10829</td><td>어댑터는 위의 두 가지 유형의 튜빙을 연결합니다</td></tr><tr><td>. 1/32" 튜빙, ID 0.01" (250&마이크로; m) 재료: PEEK</td><td>LabSmith</td><td>T-132-010P</td><td>튜브는 인큐베이션 챔버 벽을 통해 그라프트와 외부 튜브를 연결합니다</td></tr>. 일체형 <tr><td>피팅&nbsp;</td><td>LabSmith</td><td>T-132-100</td><td>인큐베이션 챔버 벽을 통해 위의 튜브를 고정</td></tr>하십시오 <tr><td>나일론 튜브 (OD 0.9mm, ID 0.75mm)&nbsp;</td><td>Smiths Medical</td><td>N/A</td><td>튜빙은 대동맥 이식편 NOD의 양쪽 끝에 삽입합니다</td></tr><tr><td>. CB17-Prkdcscid/NcrCrl 마우스</td><td>Charles River</td><td></td><td></td></tr><tr><td>외과용 봉합사, 8-0&nbsp; 실크</td><td>ETHICON</td><td>W819</td><td></td></tr><tr><td>Hypnorm</td><td>Vetapharm</td><td>Vm21757/4000</td><td>마우스용 Neuroleptanalgesic</td></tr><tr><td>Hypnovel (Midazolam)</td><td>Roche</td><td>59467-70-8</td><td>마취 유도</td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>나일론 튜빙</td><td>Portex LTD</td><td>800/200/100/200</td><td>직경 0.65 mm, 길이 1 mm; 동맥 커프를 만들기 위해</td></tr><tr><td>전기응고기</td><td>Martin&nbsp;</td><td>SN 54.131</td><td>대동맥 가지의 결찰</td></tr><tr><td>양극성 마이크로 지혈 겸자</td><td>Martin</td><td>80-91-12-04</td><td>혈관 말단 고정</td></tr><tr><td>혈관 확장기</td><td>S& T</td><td>JFX-7</td><td></td></tr><tr><td>혈관 확장기</td><td>S & T</td><td>JFL-3dZ</td><td></td></tr><tr><td>혈관 확장기</td><td>S & T</td><td>D-5aZ</td><td></td></tr><tr><td>미니 애플라이어&nbsp;</td><td>AESCULAP</td><td>FE572K</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 지혈 클립</td><td>AESCULAP</td><td>FE720K</td><td></td></tr><tr><td>외과용 봉합사, 6-0 VICRYL</td><td>ETHICON</td><td>V489</td><td></td></tr></tbody></table>

마우스 모델에서 조직 공학 혈관의 생성 및 손톱 확장

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

혈관 도관의 건설은 심혈관 질환으로 인한 손상되고 손상된 혈관의 외과적 복구를 위한 기본 전략입니다. 현재 프로토콜은 인간 섬유아세포의 부분 유도 만능 줄기세포(PiPSC)를 사용하여 기능적 조직 공학 혈관 이식편을 생성할 수 있는 효율적이고 재현 가능한 전략을 제시합니다. 우리는 생쥐에 이식하기 전에 PiPSC 내피 세포 또는 평활근 세포를 파종하기 위해 천연 혈관 내에 존재하는 기질 단백질 구조와 혈류를 밀접하게 모방하는 탈세포화된 혈관 골격 생물반응기를 설계했습니다. 이 접근법은 PiPSC 유래 이식편을 이식한 면역 결핍 마우스가 수술 3주 후 생존율이 현저히 증가했기 때문에 유리한 것으로 입증되었습니다. 이 프로토콜은 재생 의학, 조직 공학 및 가까운 장래에 잠재적으로 환자 맞춤형 세포 치료를 위한 귀중한 도구를 나타냅니다.

PiPSC의 성공적인 세대는 4 전사 인자, 인 Oct4, SOX2, KLF4 및 C-MYC (OSKM)를 운반하는 선형화 된 pCAG2LMKOSimO 플라스미드와 인간의 섬유 아세포를 nucleofecting 후 사일 확인되었다. PiPSC 섬유 아세포 (그림 2A)에 비해 현저하게 별개의 표현형을 표시의 mRNA (그림 2B)와 단백질 (그림 2C) 레벨 10에서 4 재 프로그래밍 요소를 표명했다. PiPSC 기반 혈관 이식의 효능은 모두 내피 세포와 평활근 계통으로 분화 할 수있는 PiPSC의 능력에 크게 의존한다. 그것은 그림 3. 혈관 이식을 생성하기 위해 그들을 이용하기 전에 정의 미디어의 세포를 구별하여 체외에서 PiPSC의 이러한 속성을 확인하는 것이 중요하다 (두 유전자 (그림 3A)에서 기능 내피 세포로 분화 할 수 PiPS...

여기, 우리는 두 번 시드를 부분적으로 유도 만능 줄기 세포로 쥐에 이식을위한 기능적인 조직 설계 혈관 이식을 생성하는 프로토콜을 제시 (PiPSC은) - 탈세 포화 선박 발판 생물 반응기에서 유래 내피 세포 - 평활근 세포 및 PiPSC 산출했다.

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

본 절차의 전반적인 목표는 마우스 이식이 가능한 기능성 조직 공학 혈관 이식물을 제작하는 것입니다. 이를 위해 먼저 체외에서 인간 섬유아세포를 부분 유도 다능성 줄기세포로 리프로그래밍하여, 내피세포 및 평활근세포로 분화할 수 있도록 합니다. 그 후, 희생된 마우스에서 대동맥을 적출하고 sodium dodecyl sulfate 또는 SDS 용액으로 탈세포화하여 탈세포화 대동맥 이식물을 준비합니다.다음으로, 부분적으로 유도된 다능성 줄기세포의 이중 시딩을 위해 바이오리액터 유량 회로를 구성합니다. 마지막 단계는 이중 시딩된 부분 유도 다능성 줄기세포 이식편을 마우스에 이식하는 것입니다. 최종적으로, 이식 3주 후 마우스의 사망률 분석을 통해 조직 공학적 혈관 이식편의 기능성을 입증합니다.이 기술은 PIPS 세포를 사용하여 짧은 시간 내에 기능성 혈관을 성공적으로 생성할 수 있음이 입증되었으므로, 심혈관 질환 치료로 그 응용 범위가 확장됩니다. 일반적으로, 특히 이 방법에 익숙하지 않은 연구자의 경우, 전체 과정 동안 혈관 이식편을 온전하고 무균 상태로 유지하는 것이 매우 중요합니다. 먼저 인간 진피 섬유아세포 핵 도입 키트를 사용하여 4 µg의 선형화된 OSKM 플라스미드로 세포를 형질전환함으로써, 인간 섬유아세포를 부분 유도 만능 줄기세포 또는 PIPS 세포로 리프로그래밍하여 이 절차를 시작하십시오.인간 섬유아세포는 4일간의 재프로그래밍 과정을 거쳐 PIPS 세포가 됩니다. 경추 탈구법으로 마우스를 희생시킨 후, 해부 현미경 하에서 마우스를 배와 닿은 상태(supine position)로 놓습니다.그런 다음 흉골을 절개하고 늑골 주변을 잘라 흉강을 엽니다. 심장, 폐, 식도를 제거하여 대동맥을 노출시킨 후, 핀셋을 사용하여 대동맥 주변 지방을 조심스럽게 제거합니다. 가위로 대동맥의 앞쪽 끝부분을 자르고, 뭉툭한 핀셋으로 끝부분을 살며시 잡습니다.그런 다음 둔성 박리법을 통해 척추 뒤쪽에서 대동맥을 분리합니다. 양극 전극 응고기로 결찰하고 결찰 끝부분을 가위로 절단하여 대동맥에서 분지되는 모든 동맥을 조심스럽게 폐쇄합니다. 5 mL 주사기를 사용하여 100 units의 헤파린이 포함된 3 mL의 생리식염수로 대동맥 내강을 세척합니다.혈전 형성을 방지하기 위해, 대동맥이 신동맥으로 분지되기 전의 후단부를 절단합니다. 전체 과정 동안 대동맥의 무결성을 유지하는 것이 매우 중요합니다. 다음으로, 0.075 5 mL를 사용하여 대동맥 내강을 세척합니다.인산염 완충 식염수(phosphate buffer saline, PBS)로 희석한 도데실 황산나트륨(sodium dodecyl sulfate, SDS) 용액을 사용합니다. 10cm 페트리 접시에 0.075% SDS 용액을 넣고, 쥐의 대동맥(rat aorta)을 담가 상온에서 150 RPM의 오비탈 쉐이커로 2시간 동안 반응시킵니다. 그 후 5mL의 PBS로 대동맥 내강을 세척합니다. 이어서 대동맥을 10cm 페트리 접시에 담긴 PBS에 넣고, 상온에서 150 RPM의 오비탈 쉐이커로 2시간 동안 반응시킵니다.2시간 후부터 20분마다 PBS를 교체합니다. 대동맥 내강을 5 mL의 PBS로 세척합니다. 우선, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 바이오리액터 유동 회로를 조립합니다.다음으로, 실온에서 50 RPM으로 설정한 오비탈 쉐이커 위의 10 centimeter 페트리 접시에서 대동맥을 분화 배지에 담가 한 시간 동안 soak 함으로써 탈세포화된 혈관을 배양 배지로 재조건화합니다. 현미경 하에서 탈세포화된 혈관의 양 끝단에 1 centimeter 길이의 나일론 튜브를 삽입합니다. 그런 다음 8-0 실크 봉합사로 혈관과 튜브를 묶습니다.챔버 벽의 유입구 및 유출구 포트에 나일론 튜브를 연결하여 배양 챔버 내에 탈세포화된 대동맥 이식편을 조립합니다. 배양 챔버에는 매번 5 mL의 배지를 유지하십시오. 다음으로, 예열된 트립신을 첨가하여 PIPS 세포를 트립신 처리합니다.배양 접시를 덮고 가볍게 10회 흔들어 줍니다. 파이펫 팁을 제거하고 배양 접시를 배양기에 2~3분 동안 둡니다. 그 후, 미리 데워둔 배양 배지를 접시에 넣고 배지와 세포를 혼합합니다.다음으로, 혈구계수기(hemo cytometer)를 사용하여 세포 수를 측정합니다. 세포 현탁액을 각각 50만 개의 세포가 포함되도록 두 개의 분주액으로 나누어 300 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거한 후, PIPS 세포 펠릿 중 하나를 완전히 재현탁합니다. 50 µL의 dm에 세포 현탁액을 넣어 탈세포화된 혈관 내강에 주입합니다.그 다음, 나머지 PIPS 세포 펠릿을 100 µL의 matrigel에 재현탁합니다. 혼합물을 탈세포화된 대동맥 이식편 위에 조심스럽게 피펫팅합니다. 혼합물이 젤 상태로 변하여 혈관 외벽을 고르게 감쌀 때까지 10분에서 15분 동안 기다립니다.그 시점에서 dm으로 배양 챔버를 구성합니다. 전체 바이오리액터 장치를 37°C, 5% 이산화탄소 배양기에 넣습니다. 그런 다음 배지 저장소와 컴플라이언스 챔버 사이에 연결된 튜빙을 연동 펌프에 장착합니다.배양기 내에서 진행합니다. 12시간 동안 정적인 상태로 배양한 후, 처음 2시간 동안은 30분마다 탈세포화된 이식편을 장축을 중심으로 90도씩 수동으로 회전시킵니다. 이후 연동 펌프를 통해 루멘으로 DM을 전달하여 평활근 세포 분화를 유도합니다. 초기 유량은 5 mL/min으로 설정합니다.그 후 순환 배지 유량을 20 milliliters per minute로 24시간 동안 유지한 다음, 24시간에 걸쳐 분당 20 milliliters씩 단계적으로 증가시킵니다. 배지 흐름을 중단하고 바이오리액터 설정을 인큐베이터 밖으로 이동합니다. 다음으로, 트립신 카운팅과 원심분리를 통해 1 million PIPS 세포를 사용하여 그라프트의 루멘을 PIPS 세포로 다시 채웁니다. 이전과 마찬가지로, 세포를 50 microliters의 혈관내피 성장 배지에 재현탁합니다.50 ng/mL의 혈관 내피 성장 인자가 포함된 EGM-2를 준비합니다. 그런 다음 세포 혼합물을 이식편의 내강에 주입합니다. 내피 분화를 유도하기 위해 배양 챔버와 전체 순환액의 배지를 VEGF가 포함된 EGM-2로 교체합니다.바이오리액터 설정을 다시 인큐베이터로 옮긴 후, 처음 2시간 동안은 30분마다 이식편을 수동으로 90도씩 회전시키고, 이후 12시간 동안 정적 배양을 유지합니다. 12시간 후, 5 mL/min부터 시작하여 단계적으로 35 mL/min까지 순환 유량을 증가시키고, 이후 5일 동안 유량을 35 mL/min으로 유지합니다. 그 다음, 나일론 튜브의 끝부분을 절단하여 공학적으로 제작된 이식편을 확보합니다.수혜 마우스를 마취시킨 후 이식 준비를 위해 신선한 e GM two 배지가 담긴 페트리 접시에 이식편을 둡니다. 마우스의 목 부분을 털 제거 후 신전시킨 상태에서 앙와위로 고정합니다. 5~10배 배율의 해부 현미경 하에서 마우스의 하악골부터 흉골까지 정중선 절개를 실시합니다.우측 이하선을 외측으로 들어 올리고 우측 유양돌기근을 제거합니다. 우측 총경동맥을 노출시키기 위해, 원위단에서 근위단 방향으로 부착된 조직을 조심스럽게 제거하여 우측 총경동맥을 박리합니다. 8-0 실크 봉합사로 총경동맥의 중간 부분을 두 번 결찰하고 두 결찰 부위 사이를 박리합니다. 각 혈관에 오토클레이브 가능한 나일론 튜브로 만든 커프를 통과시킵니다.각 끝부분을 마이크로 지혈집게(micro hemostat clamps)로 집어 고정합니다. 그런 다음 한쪽 끝의 봉합사를 제거하고 즉시 헤파린 한 방울을 도포합니다. 동맥의 원위단(distal end)을 뒤집어 커프 본체 전체를 덮고, 뒤집힌 혈관을 8-0 실크 봉합사로 커프에 고정합니다.동맥의 다른 부분에도 동일한 절차를 반복한 후, 생리식염수로 동맥을 세척하여 혈전물을 제거합니다. 다음으로, 탈세포화된 혈관 양 끝을 동맥 커프 위로 밀어 넣고 8-0 실크 봉합사로 고정하여 경동맥의 두 끝단 사이에 탈세포화된 혈관 이식편을 삽입합니다. 이식편의 박동을 평가하기 전 양 끝의 혈관 클램프를 제거한 다음, 오른쪽 아급선(submandibular gland)을 원래 위치로 되돌려 놓습니다.6-0 prolactin 봉합사를 사용하여 수술 부위의 피부를 단순 결절 봉합으로 봉합합니다. 텍스트 프로토콜 대표서에 기술된 대로 수술 후 관리를 계속하십시오. PIPS 세포로 리프로그래밍한 지 4일 후의 인간 섬유아세포 형태가 여기에 표시되어 있습니다.PIPS 세포는 섬유아세포와 비교했을 때 뚜렷하게 구별되는 표현형을 나타냈습니다. 예상대로 SDS로 2시간 동안 처리하여 대동맥의 모든 탈세포화를 달성했습니다. 그 결과, 탈세포화된 대동맥은 갓 채취한 대동맥과 비교하여 반투명한 무세포 지지체로 나타났습니다.탈세포화된 대동맥 내에 PIPS 세포를 이중 파종한 후, 제작된 혈관 이식편은 탈세포화 혈관 이식편과는 다른 내피세포 및 평활근 세포의 특성을 나타냅니다. 이는 내피세포를 나타내는 녹색 염색과 평활근 세포를 나타내는 적색 염색을 통해 시각화되었습니다. PIPS 세포 혈관 이식편을 이식한 마우스는 예상대로 이식 3주 후 60%의 생존율을 보였습니다.탈세포화된 혈관을 이식한 마우스는 개발 후 이르면 1일 차부터 현저히 높은 사망률을 보였습니다. 이 기술은 심장학 분야의 연구자들이 PIPS 세포와 탈세포화 혈관 이식물을 활용하여 기능적인 조직 공학 혈관 도관을 생성하는 방법을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청하신 후, 탈세포화 혈관 이식물을 준비하는 방법, 바이오리액터를 조립하는 방법, 그리고 재세포화된 이식물을 마우스에 다시 이식하는 방법에 대해 충분히 이해하시기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

우리는 마우스의 복부 대동맥의 한 부분이 단지 allogeneic 또는 syngeneic받는 사람의 신장 동맥 아래에 orthotopically 이식되는 기술을 설명합니다. 이 기술은 균일 한 크기의 큰 동맥의 이식이 유리한 것으로 간주되는 연구에 유용 할 수 있습니다.

혈관 질병의 연구에 대한 마우스의 Orthotopic 대동맥 이식

우리는 우리의 마우스 이식 arteriosclerois (GA) 같은 근친 교배 균주의받는 사람에 마우스 선박 세그먼트의 개재를 포함 모델에 대한 프로토콜을 설명합니다. 용기 기증자에 추가 유전자 변화를 교잡에 의해, 모델은 GA에 특정 유전자의 효과를 평가할 수 있습니다.

이식 동맥 경화에 대한 마우스 모델

뮤린 자궁 심장 이식 모델은, 면역뿐만 아니라 허혈 재관류 손상 연구에 매우 적합하다. 우리는 비 봉합 커프 기술을 사용하여 절차를 수정이 방법으로 1,000 개 이상의 성공적인 이식을 수행 하였다.  여기서, 우리는 비디오를 보충하기위한이 기술의 추가 정보를 제공합니다.

수정 커프 기술을 사용하여 쥐의 자궁 심장 이식 모델

세포 및 분자 neotissue 형성에 대한 우리의 지식을 개선하기 위해, TEVG의 쥐 모델은 최근에 개발되었다. 이식은 C57BL / 6 마​​우스의 신동맥 대정맥 개재 이식으로 이식되었다. 이 모델은 우리의 임상 연구에서 달성 된 것과 유사한 결과를 얻을 수 있지만, 훨씬 단축 된 시간 과정을 통해.

마우스 모델에서 하대 정맥 끼어 이식의 주입

고형 장기 및 혈관 복합 동종 이식을 결합하기 위해 경추 비봉합 커프 기술을 사용하여 마우스에서 새로운 이종성 흉벽, 흉선 및 심장 이식 모델을 설명합니다.

마우스의 소설 미세 수술 이소성 모델, 욕실 공산권 가슴 벽, 흉선, 및 심장 이식

우리는 orthotopic 대동맥 이식 모델 마우스에 슬리브 기술을 사용 하 여 현재. 혈관 질환의 연구에 사용할 수 있는 매우 빠른 문 합 방법 이다.

대동맥 이식-교육용 비디오의 마우스 모델에서 소매 기법을 사용 하 여

이식 협 조직 설계 기도 교체에서 중요 한 장애물을 포즈. 협 기본 셀룰러 메커니즘을 조사, 우리 시드 골 단 세포 (BM-MNC)와 조직 설계 tracheal 교체의 murine 모델을 활용 합니다. 여기, 우리가 우리의 프로토콜을 비 계 제조, BM MNC 절연, 이식 시드, 및 주입을 포함 하 여 선발.

시드 및 마우스 모델에서 생 합성 조직 설계 Tracheal 이식의 이식

여기서, 우리는 자궁 경부 뮤린 모델에서 비 봉합술 커프 기술을 사용하여 마우스에서 이종성 대동맥 이식의 프로토콜을 제시한다. 이 모형은 만성 동종 이식 혈관병증 (CAV)의 근본적인 병리를 공부하기 위하여 이용될 수 있고 그것의 대형을 방지하기 위하여 새로운 치료에이전트를 평가하는 것을 도울 수 있습니다.

수정된 비봉합사 커프 기술을 사용한 뮤린 자궁 경부 대동맥 이식 모델

마우스 심장 이식 모델은 이식 면역학을 연구하기 위한 귀중한 연구 도구입니다. 본 프로토콜은 층류 혈류를 허용하기 위해 수혜자의 총 경동맥 및 기증자의 폐동맥 트렁크에 커프를 배치하는 것을 포함하는 마우스 이종 자궁 경부 심장 이식을 자세히 설명합니다.

혈관 수갑을 이용한 마우스 이종 자궁 경부 심장 이식

여기에서는 커프 기법을 사용하여 조직 공학 혈관 이식편을 마우스 경동맥에 이식하기 위한 프로토콜을 제시하여 혈관 조직 재생 메커니즘을 조사하는 데 적합한 동물 모델을 제공합니다.

커프 기법을 통한 마우스 경동맥에 조직 공학 혈관 이식편 이식

이 연구는 대퇴 동맥의 소구경 이식편을 평가하기 위한 돼지 모델을 제시합니다. 이 모델은 인간의 혈관 역학을 모방하고 이식편 개통성, 혈류역학 및 혈관 리모델링을 종합적으로 평가합니다. 혈관 이식편을 검사하고 도플러 초음파 및 혈관 조영술로 모니터링할 수 있는 유용한 플랫폼을 제공합니다.

소구경 혈관 이식편을 테스트하기 위한 돼지 모델에 대퇴 혈관 이식편 이식

배우세요 마우스 모델에서 조직 공학 혈관을 생성하는 방법을, PiPSCs와 생물반응기를 사용하여 기능성 이식편을 만듭니다. 이 기술은 혈관 재생의학 연구에 활용됩니다.

마우스 모델에서 조직 공학 혈관의 생성 및 손톱 확장

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