골드 신경 세포의 자극을 광학 나노로드가 보조

이 프로토콜은 금 나노막대의 광학 흡수와 관련된 일시적인 가열을 사용하여 신경 세포의 분화 및 세포 내 칼슘 활성을 자극하는 방법을 설명합니다. 이러한 결과는 잠재적으로 신경 보철물 및 신경 과학의 기초 연구에 대한 새로운 응용 분야를 열 수 있습니다.

이 절차의 전반적인 목표는 근적외선 레이저 다이오드를 사용하여 금 나노 막대로 배양된 신경 세포를 자극하는 것입니다. 이것은 먼저 적절한 광학 밀도에서 금 나노 입자를 준비함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 신경 세포를 배양하고 나노 입자를 첨가하는 것입니다.

다음 단계는 레이저 조사입니다. 마지막 단계는 베타 3을 통해 튜불린 발현에 대한 세포 분화를 확인하는 것입니다. 궁극적으로 컨포칼 현미경은 세포 내 칼슘 과도도를 보여주는 데 사용됩니다.

우리는 세포 집단 중 단일 뉴런에서 활동 전위를 자극하는 방법을 찾고 있을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 가졌습니다. 절차를 시연하는 것은 Jamie May와 우리 연구실의 학부생들입니다. 이 절차를 시작하려면 UV 가시 분광 광도계에 금 나노 막대 용액 수의사를 놓습니다.

0.5에서 2나노미터 사이의 분해능으로 300나노미터에서 1000나노미터의 흡수 값을 기록하여 초기 광학 밀도를 측정합니다. 초기 금 anoro 샘플을 하나의 원심분리기의 광학 밀도로 희석하여 1ml의 스톡 용액을 준비합니다. 1 밀리리터의 금 나노 막대 용액을 두 번 사용하여 화학적 과잉을 제거하십시오.

그런 다음 상층액을 제거하고 금 나노 막대를 탈 이온수에 다시 현탁시킵니다. 세포 배양에 사용할 준비를 하려면 골드 아노로 용액을 5분 동안 초음파 처리한 다음 자외선으로 30분 동안 살균합니다. 이 절차에서는 세포 배양 배지에 대해 500ml의 멸균 dmem을 준비합니다.

다음으로, T 75 플라스크에서 10 밀리리터의 세포 배양 배지에서 NG 1 0 8 15 뉴런 세포를 성장시킨 후, 섭씨 37도 및 가습 분위기에서 배양한다. 세포가 70에서 80% 합류일 때, 매체를 따뜻한 신선한 매체로 바꾸십시오. 그 후, 융합 플라스크의 바닥을 부드럽게 두드려 세포를 기계적으로 분리합니다.

600G에서 5분 동안 세포 현탁액을 원심분리하고 2ml의 따뜻한 세포 분화 배지에 세포 팔레트를 재현탁합니다. 그런 다음 200마이크로리터의 세포 분화 배지가 있는 96웰 플레이트의 세포를 확인합니다. 샘플을 섭씨 37도에서 하루 동안 배양합니다.

다음날 금 나노 막대 용액을 넣고 추가로 24시간 동안 배양합니다. 이 절차에서는 레이저를 단일 모드 광섬유와 연결하고 FC 커넥터로 종단합니다. 나노 막대 배양 3일차에 표준 파워 미터로 출력 레이저 출력을 측정합니다.

FC 커넥터를 우물에 고정하고, 5일째에 다른 레이저 출력으로 연속파로 1분 동안 실온에서 샘플과 대조군을 조사하고, 샘플에서 세포 분화 매체를 제거하고 10분 동안 부피당 3.7%의 포름알데히드 용액으로 고정합니다. 그런 다음 20 분 동안 부피 당 0.1 % 볼륨 Triton X 100으로 세포를 투과시킵니다. 그 후, 60분 동안 샘플에 부피 BSA당 3%중량을 추가합니다.

비반응성 단백질 결합 부위를 차단하려면 섭씨 4도에서 밤새 샘플에 안티 베타 3 튜불린을 표시합니다. 다음날, 적절한 2차 항체로 어둠 속에서 90분 동안 세포를 배양합니다. 그런 다음 10분 동안 DAP E로 세포핵을 표시합니다.

그런 다음 최소 20 x 대물렌즈를 사용하여 epi fluorescence 또는 confocal microscopy로 샘플을 이미지화합니다. 2차 항체에 따라 현미경 필터를 선택하고 DAPI 필터를 선택하여 세포핵을 시각화합니다. 이 단계에서는 10ml의 DMSO에 2g의 용질을 용해하여 onic F1 27의 부피당 20% 중량 스톡 용액을 준비합니다.

onic F1 27 용액을 섭씨 40도에서 20분 동안 가열하여 용해도를 높입니다. 아나로 배양 3일차에는 균형 잡힌 소금 용액을 준비합니다. 다음으로, 세포 분화 배지를 제거하고 BSS 용액으로 교체합니다.

독감 5마이크로몰, DMSO에서 오전 4:00 및 onic F1 27 원액 부피당 0.1%중량이 보충되었습니다. 그런 다음 레이저를 단일 모드 광섬유와 연결하고 팁을 절단합니다. 표준 기술을 사용합니다.

광학 현미경으로 결과 팁을 관찰하여 팁이 평평하고 광섬유 축에 수직인지 확인합니다. 그런 다음 표준 파워 미터로 출력 레이저 출력을 측정합니다. 다음으로, 광 전달 광섬유를 광섬유 홀더에 삽입하고 마이크로 포지셔너에 부착합니다.

그런 다음 오실로스코프를 신호 발생기에 연결합니다. 광 변조를 모니터링합니다. 가변 주파수와 펄스 길이를 가진 이진 신호를 사용합니다.

그런 다음 레이저를 연결하고 변조 신호를 현미경의 TTL 입력으로 사용합니다. 아르곤 이온 레이저를 사용하여 내재화된 독감 oh 4:00 AM 염료와 동기화된 레이저 dde를 자극합니다. endocytose nano rods의 excitation을 위해 세포를 도립 컨포칼 현미경 아래에 놓고 투과 조명 모드에서 광 전달 광섬유를 대상 세포에서 멀리 배치합니다.

그런 다음 대상에서 빔 반경을 계산합니다. 40 x objective를 사용하여 실온에서 샘플 및 대조군의 이미징을 수행하고 왕복 모드에서 프레임당 256 x 256 픽셀의 해상도로 시계열 스캔을 수집합니다. 그런 다음 레이저 DIO 여기 없이 기록을 수행하여 기준선 아르곤 이온 레이저 간섭을 식별하기 위해 여기에 표시된 것은 단독으로 배양하고 7.5와트 제곱센티미터의 레이저 출력으로 조사된 분화된 NG 1, 0, 8, 15 roal 세포의 에피 형광 이미지입니다.

그리고 이것은 1.25 와트 제곱 센티미터의 레이저 출력으로 조사된 금 나노 막대로 배양된 세포의 이미지입니다. 다음은 독감 오 4:00 AM 칼슘 지시약이 적재된 분화된 NG 1 0 8 15 신경 세포의 예입니다. 이미지는 40배 오일 이멀젼 대물렌즈가 있는 도립 컨포칼 현미경을 사용하여 촬영했습니다.

이 그림은 시간의 함수로서 레이저에 의한 칼슘 변화의 대표적인 샘플을 보여줍니다. NG 1 0 8 15에서, 신경세포 세포를 폴리스티렌 설포네이트 금 나노 막대, 금 나노 막대 및 나노 막대 없이 3일 동안 무혈청 조건에서 배양했습니다. F max가 F zero보다 크다는 것은 NG 1, 0, 8, 15 개의 신경 세포에서 검출 된 최대 형광의 증가를 나타냅니다.

이 기술은 신경 세포의 광학 시뮬레이션에서 향후 응용할 수 있는 길을 열었습니다.