후 전사적으로 규제 유전자의 화학 변조기에 대한 높은 처리량 검사

이 실험은 전사체의 3개의 주요 번역되지 않은 영역을 통해 전사 후 제어 메커니즘을 조절하는 화합물에 대한 화학 라이브러리를 스크리닝합니다. 먼저, 표적 유전자에서 3개의 주요 비번역 관심 영역을 식별합니다. 이 3 프라임 UTR을 El luciferase control 리포터 플라스미드에 복제하여 El luciferase 3 프라임 UTR 키메라 전사체를 생성합니다.

그러면 안정적으로. 두 개의 플라스미드를 질병 관련 세포주에 통합하고, 96에서 키메라 전사체를 운반하는 세포를 시드합니다. 웰 플레이트는 24시간 동안 화합물 라이브러리로 처리한 다음 루시페라제 활성에 영향을 미치는 분자를 식별합니다.

추가 검증 스크리닝을 위해 선택한 분자를 체리 피킹(cherry pick)하고, 다음으로, 대조 세포와 루시페라제 3 프라임 UTR 키메라 전사체를 운반하는 세포를 모두 체리 피킹 라이브러리 서브셋으로 처리합니다. 결과는 화합물의 효과가 3개의 프라임 비번역 영역을 통해 매개되는지 아니면 다른 벡터 서열을 통해 매개되는지를 구별합니다. 대부분의 기자 기반 스크리닝 에세이와 달리.

전사 조절에 중점을 둔 분석은 세포 기반 분석을 보고하며, 3개의 프라임 및 번역 영역을 통해 mRNA 전사체 수준을 조절하는 화합물을 식별하는 데 중점을 둡니다. trypsin asian에 의해 안정적으로 transfection된 신경모세포종 세포를 수확합니다. 세포를 2 곱하기 10의 농도로 10 밀리리터당 5 번째 세포로 희석합니다.

27개의 플레이트에 대해 10%FBS와 1%L-글루타민을 함유한 RPMI에서. 최소 250ml의 세포 현탁액을 준비하며, 액체 취급, 트로프 데드 볼륨 및 반복적인 피펫팅 단계를 고려합니다. 그런 다음 세포 현탁액을 멸균 저장소에 붓고 로봇 책상 위에 놓습니다.

9개의 바코드가 있는 흰색 플랫을 적재합니다. 로봇 데스크 위의 하단 96웰 플레이트와 200마이크로리터 멸균 피펫 팁 상자. 세포 현탁액을 혼합한 다음 75마이크로리터의 세포를 9개의 플레이트로 구성된 각 웰에 분배합니다.

플레이트를 덮고 가장자리 효과를 최소화하기 위해 세포가 30분 동안 웰 바닥으로 침전되도록 합니다. 그런 다음 9개의 플레이트를 모두 섭씨 37도와 이산화탄소 5%로 놓고 24시간 동안 배양합니다. 마찬가지로 나머지 플레이트를 한 번에 9개씩 진행합니다.

복합 라이브러리 플레이트를 실온에서 해동합니다. PBS 용액의 한 트로프에 멸균 PBS를 채우고 다른 트로프에 0.5% DMSO를 채우고 로봇 데스크에 놓습니다. 각 도서관 플레이트에 대해.

그에 따라 준비하고 레이블을 지정합니다. 희석 플레이트 1개. 이제 컬럼의 각 웰, 2-11개의 희석 플레이트를 398마이크로리터의 멸균 PBS로 채웁니다.

그런 다음 1열과 12열을 멸균 PBS에서 50마이크로리터의 0.5%DMSO로 채웁니다. 다음으로 두 개의 희석판을 로드합니다. 라이브러리 플레이트 2개, 50마이크로리터 멸균 팁 상자 2개, 로봇 데스크 위의 셀 플레이트 6개.

이제 세포 플레이트를 열고 해당 희석 플레이트에 있는 두 개의 라이브러리 플레이트 중 하나에서 10밀리몰 스톡 용액 2마이크로리터를 피펫팅하고 잘 혼합합니다. 동일한 팁 세트를 사용합니다. 50마이크로몰 희석액 3마이크로리터를 세포가 들어 있는 바코드가 부착된 흰색 96웰 플레이트 3개로 옮깁니다.

전체 팁 세트를 교체하고 두 번째 라이브러리 플레이트에 대한 세포 유도를 반복합니다. 배양물을 덮고 24시간 동안 배양합니다. 그런 다음 나머지 라이브러리 플레이트에 대해 화합물 희석 및 세포 유도 과정을 반복합니다.

선택한 재구성된 luciferase 시약을 실온에 평형화합니다. 로봇 책상 위에 루시퍼라제 저장통을 놓고 시약을 붓습니다. 인큐베이터에서 유도 배양액 플레이트 9개를 제거합니다.

로봇 책상 위에 놓고 덮개를 열고 실온으로 평형을 이룹니다. 그런 다음 플레이트 사이에 웰당 50마이크로리터의 루시퍼라제 시약을 추가합니다. 한 플레이트의 발광 판독 시간과 동일한 지연을 도입합니다.

30분 배양 후. 먼저 플레이트의 바코드를 기록하여 해당 데이터 파일과 연결합니다. 다음으로 광도계에 첫 번째 플레이트를 놓고 발광을 측정합니다.

짧은 흔들기 단계 후에 모든 유도 플레이트에 대한 발광 판독 값을 반복합니다. 그런 다음 남은 Lucifer 레이스 시약을 모아 섭씨 영하 20도에서 보관합니다. 1차 스크리닝의 실험 데이터가 처리되면 카운터 스크리닝 체리에 의한 화합물 특이성을 확인하기 위해 히트를 선택합니다.

선택한 히트를 선택하고 컨트롤의 위치를 포함하여 새 스크리닝 플레이트의 레이아웃을 만듭니다. 그런 다음 단일 2D 바코드 튜브에 저장된 부분 표본에서 새로운 HIIT 플레이트를 만듭니다. 스크리닝을 위한 동일한 프로토콜을 따릅니다.

hi plate당 각 stable cell line의 96웰 플레이트 3개를 준비합니다. 다음날, 라이브러리 화합물로 세포를 처리합니다. 각 hi plate를 사용하여 24시간 내에 2마이크로몰 작업 농도에서 CHP 1 34 micken 플레이트 3개, Prime UTR 플레이트 3개, 대조 세포가 있는 플레이트 3개를 처리할 수 있습니다.

모든 CHP 1 34 플레이트, 3개의 프라임 미번역 및 대조군 세트에서 루시페라제 활성을 측정합니다. 1차 스크리닝의 데이터 분석과 마찬가지로 처리된 유정의 실험 데이터를 플레이트 차량 처리 대조군의 평균으로 정규화합니다. 그런 다음 테스트된 각 화합물 계산에 대한 반복실험에 대한 평균 및 표준 편차를 계산합니다.

CHP 1 34 McIn 3 프라임 UTR과 CHP 1 34에서 루시페라제 활성의 폴드 변화. 대조 셀은 1.5보다 큰 임의의 완전 변화 컷오프와 0.01 미만의 유의성 P 값을 선택합니다. 이 실험은 2000 화합물 라이브러리에서 마이크 및 종양 유전자의 3 개의 프라임 UTR을 통해 발휘되는 전사 후 제어 메커니즘의 잠재적 조절자에 대한 잠재적 인 조절자를 스크리닝했으며, 25 개의 대표적인 라이브러리 플레이트 중 하나의 루시 페라 아제 신호의 결과를 처리 된 차량의 백분율로 표시했습니다.

대조군은 대부분의 화합물이 3개의 프라임 UTR에 뚜렷한 영향을 미치지 않음을 보여줍니다. 모든 분석 값에 대해 평균값과 표준 편차를 계산한 곳에서 히트를 선택했으며, 루시페라아제 활성을 20% 미만으로 감소시키는 화합물은 화합물의 뚜렷한 세포 독성을 나타낼 가능성이 가장 높습니다. 이 그래프는 WX, Y 및 Z로 지정된 4개의 선택된 화합물에 대한 카운터 스크리닝에 대한 대표적인 결과를 보여줍니다.두 화합물 W 및 X 모두 폴드 변경 차이 및 T-테스트에서 알 수 있듯이 종양유전자 3 프라임 UTR 리포터에서 루시페라제 발현을 증가시킵니다.

화합물 X는 CHP 1 34 대조 세포에서 정규화된 루시페라제 신호에 의해 표시된 바와 같이 일부 세포독성 활성을 나타내지만, 2마이크로몰 농도에서 화합물 Y와 화합물 Z 모두 루시페라제 농도에 대한 A 3 프라임 UTR 의존 효과를 나타내지 않습니다. 화합물 Y로 처리한 후 1차 스크리닝에서 검출된 루시페라아제 활성의 감소는 오히려 세포독성의 결과입니다. 화합물 Z의 경우, 증가된 루시페라아제 활성은 바이러스 프로모터의 3가지 프라임 UTR 활성화 측면에서 비특이적 때문입니다.

이 고처리량 분석법에서 대조군 세트와 번역되지 않은 세트 모두에서 동등한 상향 조절이 관찰되기 때문에, 대조군 세포에서 1차 열을 검증하는 것이 프로모터를 통해 작동하는 화합물과 3개의 프라임 번역되지 않은 영역을 통해 실제로 작용하는 화합물을 구별