Name: 자식 작용의 분석에 페니 chrysogenum 형광 현미경과 조합 기아 패드를 사용하여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: 학습하세요 형광 현미경과 기아 패드를 이용해 Penicillium chrysogenum에서 자식 작용을 유도하고 관찰하는 방법을. 이 기법은 진균 세포 생물학 연구와 자식 조절 화합물 발굴에 활용됩니다.

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CQS는 통합 진균 연구(IPF)를 위한 로에베 엑설런스 클러스터(LOEWE Excellence Cluster for Integrative Fungal Research, IPF)로부터 펠로우십을 받았습니다. 저자는 이 작업에 사용된 P. chrysogenum 균주에 대해 Ida J. van der Klei에게 감사하고 rapamycin을 선물한 Andreas S. Reichert에게 감사를 표하고 싶습니다.

P. 1. 준비 chrysogenum 기아 실험에 대한 <ol><li> P. 경우 관심 chrysogenum 변형이 쌀 ( &#39;녹색 쌀&#39;)에 보관되어, 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 균사체를 포자 덮여 2-3 쌀 곡물을 배치합니다. 500 μL의 YGG (10g / L의 KCl, 20g / ℓ의 포도당 10g / L 효모 질소베이스, 5g / ℓ K 2 HPO 4, 20g / ℓ 효모 추출물)로 채 웁니다. <ol><li> 포자 효율적 벼에서 분리 할 수​​ 있도록 30 초 동안 와동 튜브. </li><li> 실온에서 1 날 (예를 들어, 20 내지 25 °의 C)에 대해 튜브를 부화. </li><li> 멸균 수돗물이 포자 현탁액의 1/50 희석을 준비, 잘 섞는다. </li></ol></li><li> P. 경우 관심 chrysogenum 균주 한천 플레이트 (예 YGG 한천 플레이트)에 보관하고, 400 μL 무균 수돗물 약 100 mg을 GL을 함유하는 1.5 ml의 마이크로 원심 분리 튜브에 균사체의 작은 조각을 전송할멸균 된 이쑤시개 또는 피펫 팁을 사용하여 엉덩이 구슬. <ol><li> 소용돌이는 2 분 동안 튜브되도록 균사체 단편화된다. 즉시 튜브의 내용을 사용합니다. </li></ol></li></ol> P.의 재배 2. 준비 단계 기아 패드에 chrysogenum <ol><li> 가열 접시에 전환하고 약 60 ° C로 설정합니다. </li><li> 전자 레인지 용액을 요리 수돗물 100 ㎖의 아가 2g을 녹인. 이 솔루션은 가열 후 완전히 명확주의하십시오. 그렇지 않은 경우, 아가 로스가 완전히 용해 될 때까지, 다시 조리. 아가로 오스 솔루션은 사용하기 전에 약 60 ° C로 냉각 보자. </li><li> 400 μL 멸균 탭 각 (추가 화합물이 첨가되지) 물이나와 (샘플의 수에 따라 2-4)를 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브 채우기 400-X μL (단계 2.5 화합물 용액 ㎕의 x를 추가)하고이를 배치 적어도 1 분 동안 가열 플레이트 상으로되도록 와트어 내부에 따뜻한 가져옵니다. </li><li> 적어도 1 분 동안 가열 접시에 중앙 캐비티를 포함하는 현미경 슬라이드를 놓습니다. </li><li> 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브와 소용돌이 짧게에서 솔루션에 아가로 오스 400 μL 2 %를 추가합니다. 원하는 경우이 단계 후에, 추가 화합물 (즉, 1 μM 라파 마이신)를 추가합니다. 이 작업을 수행 할 경우, 소용돌이 각각의 추가 물질은 튜브에 피펫되어 잠시 후. 조기 고화를 방지하기 위해, 가열 테이블에 다시 넣어 튜브. 주 : microcentrifuge 관의 총 부피는 800 ㎕를해야한다. </li></ol> 기아 패드를 포함하는 현미경 슬라이드 3. 준비 <ol><li> (정지 가열판에 위치) 현미경 슬라이드의 공동 내로 아가 용액 140 μL 피펫. 가능하면 거품을 피하기 위해보십시오. </li><li> 즉시 아가로 오스 솔루션 상에 커버 슬립을 배치합니다. 참고 :이 평평한 표면에 발생합니다. </li><li> 마이크로 넣어약 4 분의 실험실 벤치 위에 범위 슬라이드 아가로 오스 패드를 응고시킬 것입니다. </li><li> 조심스럽게 엄지 또는 검지의 도움으로 그것을 떨어져 밀어 아가로 오스 패드에서 커버 슬립을 제거 (오염을 방지하기 위해 장갑을 착용!). </li><li> 탈수를 방지하기 위해 젖은 챔버로 패드 현미경 슬라이드를 놓습니다. 권장 사항 : 여전히 피펫 팁을 유지하기위한 삽입을 가진 빈 팁 상자를 사용합니다. 바닥이 적용되도록 상자에 멸균 물을 추가합니다. 삽입에 현미경 슬라이드를 놓고 상자를 닫습니다. </li></ol> 4. P.와 기아 패드를 접종 chrysogenum 및 배양 <ol><li> 1/50 포자 (문화 쌀 재배 된 경우) 희석 또는 기아 패드의 중심에 (문화 agar 접시에 성장 된 경우) 균사체 단편을 포함하는 원액의 5 μL의 피펫 5 μL. </li><li> 이 역할 (습식 챔버를 닫고 비닐 봉지에 포장기아 패드의 탈수에 대한 추가 보호). 너무 많은 그렇지 않으면 접종 방울을 방해하기 때문에 상자를 이동하지 않도록주의하십시오. </li><li> 샘플을 분석하기 전에 적어도 20 시간 동안 실온에서 포장 상자를 보관하십시오. </li></ol> 샘플 5. 현미경 분석 <ol><li> 배양 20 시간 후 샘플을 현미경 분석을위한 준비; 드라이 티슈에 현미경 슬라이드를 넣어 (바닥에 물기가 경향). </li><li> 기아 패드 위에 물을 소량 (약 50 μL)를 피펫. 패드에 커버 슬립을 넣고 여분의 물을 짜 낸다. 티슈로 여분의 물을 제거합니다. </li><li> 형광 현미경의 관찰 테이블에 현미경 슬라이드를 넣습니다. 균사체 성장의 개요를 얻으려면, 20 배 목표를 사용합니다. 균사에서 GFP의 지역화 연구를위한 사용 63X 또는 100X 목표. 샘플에 대한 분석을하지 않는 샘플의 점진적인 탈수를 방지하기 위해,15 분 이상 습식 챔버에 다시 놓기 전에. </li><li> (40 시간과 성장의 60 시간 후, 예를 들면) 일정한 간격으로 5.3를 반복합니다. 참고 : 샘플은 습식 챔버에 다시 넣을 수 있습니다. 그것은 균사체 생장에 영향을주지 않는 커버 슬립을 제거 할 필요가 없다. </li></ol>

<ol><li>Fischer, F., Hamann, A., Osiewacz, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+quality+control%3A+an+integrated+network+of+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial quality control: an integrated network of pathways.</a> Trends Biochem. Sci. 37 (7), 284-292 (2012).</li>
<li>Pollack, J. K., Harris, S. D., Marten, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+filamentous+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genet.+Biol%22%5BJournal%5D)">Autophagy in filamentous fungi.</a> Fungal Genet. Biol. 46 (1), 1-8 (2009).</li>
<li>Scheckhuber, C. Q., Osiewacz, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podospora+anserina%3A+a+model+organism+to+study+mechanisms+of+healthy+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Genet.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Podospora anserina: a model organism to study mechanisms of healthy ageing.</a> Mol. Genet. Genomics. 280 (5), 365-374 (2008).</li>
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<li>Kikuma, T., Ohneda, M., Arioka, M., Kitamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+the+ATG8+homologue+Aoatg8+and+role+of+autophagy+in+differentiation+and+germination+in+Aspergillus+oryzae%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot.+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of the ATG8 homologue Aoatg8 and role of autophagy in differentiation and germination in Aspergillus oryzae.</a> Eukaryot. Cell. 5 (8), 1328-1336 (2006).</li>
<li>Pinan-Lucarré, B., Balguerie, A., Clavé, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+cell+death+in+Podospora+autophagy+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot.+Cell%22%5BJournal%5D)">Accelerated cell death in Podospora autophagy mutants.</a> Eukaryot. Cell. 4 (11), 1765-1774 (2005).</li>
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</ol>

저자는 공개할 것이 없습니다.

여기에 제시된 방법은 P.에서 자식 작용의 편리하고 재현성 연구를 할 수 있습니다 chrysogenum. 예를 들면, 곰팡이는이 아닌지의 자식 작용 반응을 조절할 수있는 여부를 다양한 화합물의 효능의 스크리닝에 사용될 수있다. 라파 마이신과 결과는 TOR 신호 전달의 억제는 P.에서 자식 작용의 뚜렷한 유도에 이르게 입증 chrysogenum 다른 생물 (11)에 대한 입증 된. 그것은 더 정교한 현미경 (예, 공 초점 레이저 주사 현미경) 분석에 대한 고갈 균사 성장 패드를 사용하는 것이 가능하다. 이 샘플은 목적 (반전 현미경) 위의 목적 아래에 배치되어 있는지 여부를 중요하지 않습니다. 특정 구획을 대상으로 다양한 형광 단백질은 자식 작용하는 동안 다른 세포 소기관의 운명 (예를 들어, 미토콘드리아 모니터링하는 데 사용할 수있는 -&gt; mitophagy...

사상균은 발달 과정의 연구를위한 훌륭한 모델 시스템입니다. 그들은 싼 재배, 자손 유전 적 접근성의 높은 번호와 같은 몇 가지 실험적인 혜택을 제공합니다. 마지막 포인트는 다양한 세포 메커니즘에 대한 이제까지의지지 않은 유전자의 중요성을 조사 허용 형질 전환 체의 건설을위한 특별한 관련이있다. 사상 균류는 잉여 및 / 또는 장애 세포 구성 요소의 제거를 위해 미토콘드리아 무결성과 자식 작용을 유지하고 유지하기위한 몇 가지 요소와 비정상적인 단백질, 미토콘드리아 역학의 분해 단백질 분해 효소 활동 등 셀룰러 품질 관리 경로의 메커니즘의 해명을위한 수단이되었습니다 기아 1,2,3 번에서 세포 생존 능력. 사상 균류 2 자식 작용의 연구에 사용할 수있는 여러 가지 실험 기법이있다 : 공포의 (ⅰ) 조사 전프로테아제는 투과 전자 현미경 (4)에 의해 억제 될 때 F 이들은 치밀 포식 체를 포함하는, (II)의 형광 염료 monodansyl의 카다를 이용하여 형광 현미경 5,6- 산성화 autophagosomal 구조 (III) 검출을 통해 GFP-Atg8 병소 모니터링함으로써 autophagosomes 가시화 7. 여기에, 자식 작용의 연구에 페니 chrysogenum 성장의 새로운 방법을 제시한다. 주요 요소는 단순히 아가 살균 수돗물에 용해 된 1 %로 구성 &#39;기아 패드&#39;이다. 추가 화합물 (예, 스트레스는, 스 캐빈 저는, 자식 작용 변조기)만큼 그들은 자동 형광 표시되지 않는 패드에 첨가 될 수있다. 패드는 얕은 중앙 캐비티를 포함 현미경 슬라이드에 있습니다. 포자 현탁액 또는 작은 균사체 파편 중 하나 접종에이 패드. 관심의 변형이 sporulat하지 않았을 경우에는, 후자는 것이 좋습니다효율적 전자 (예를 들어, Δ의 atg1 균주 8). 슬라이드는 샘플의 탈수를 방지하기 위해 (이들 용이 빈 피펫 팁 박스를 사용하여 구성 될 수있다)하고, 실온에서 배양 습윤 챔버에 위치된다. P. chrysogenum 이러한 조건 하에서 몇일 성장할 수있다. 자식 작용은 곰팡이 자식 작용에 대한 긍정적 인 마커 액포 확대하여 현미경으로 관찰 할 수있다. 이 기여, P.에서 chrysogenum 변형 (위스콘신 54-1255)는 자사의 C 말단 &#39;SKL&#39;순서 9 퍼 옥시 솜를 대상으로 녹색 형광 단백질을 형성하는 데 사용됩니다. 그러므로 페 록시의 열화를 모니터링하는 것이 가능하다. 이는 적절한 위치 파악 신호를 이용하여도 셀 (예를 들면, 미토콘드리아)의 다른 구획에 라벨 그들의 열화를 분석 가능하다. P. 데이터 있지만 chrysogenum Ws54-1255 (GFP-SKL)는 확실히 가능하고, 여기에 제시다른 진균에 대해서도 &#39;기아 패드&#39;방법을 사용하려면 (예를 들어, 뉴로 crassa의, Sordaria의 macrospora, 아스 페르 길 루스 종 등).

<table><tbody><tr><td>중앙 캐비티가 있는 현미경 슬라이드</td><td>Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany</td><td>H884.1</td><td>세척 후 여러 번 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>유리 구슬</td><td>Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany</td><td>A553.1</td><td>직경 : 0.25 - 0.50 mm</td></tr></tbody></table>

자식 작용의 분석에<em&gt; 페니 chrysogenum</em&gt; 형광 현미경과 조합 기아 패드를 사용하여

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

세포 품질 관리 시스템에 대한 연구는 현대 연구에서 매우 역동적이고 관련성이 높은 분야로 부상했습니다. 세포가 핵산, 지질 및 단백질과 같은 생물학적으로 관련된 분자의 손상에 대한 여러 방어선을 가지고 있다는 것이 분명해졌습니다. 소기관 역학(융합/분열/운동성/유전)과 엄격하게 제어된 단백질 분해 효소 활성 외에도 자가포식(세포 '자가 먹기')에 의한 잉여, 손상 또는 손상된 소기관의 분해는 과학계에서 많은 관심을 받고 있습니다. 자가포식의 조절은 매우 복잡하며 유전적 및 환경적 요인에 따라 달라지며, 그 중 많은 부분이 지금까지 규명되지 않았습니다. 여기에서는 사상균 Penicillium chrysogenum의 자가포식을 편리하게 연구할 수 있는 새로운 방법을 제시합니다. 이는 재현 가능한 방식으로 자가포식을 자극하기 위해 소위 '굶주림 패드(starvation pads)'에서 곰팡이의 성장을 기반으로 합니다. 샘플은 현미경으로 직접 분석하고 자가포식 유도/진행을 평가합니다. 여기에 제시된 프로토콜은 P. chrysogenum에 사용하도록 제한되지 않으며 다른 사상균에 사용하기 위해 쉽게 조정할 수 있습니다.

P.에 퍼 옥시 저하 위에 설명 된 프로토콜의 유틸리티를 설명하기 위해 chrysogenum 변형 Ws54-1255 (GFP-SKL)을 분석 하였다. 이 변형에서 GFP-SKL은 일반적으로 퍼 옥시 솜 (9)로 가져옵니다. 시료를 형광 현미경을 통해 분석 될 때 여러 구형의 모양을 초래한다. 자식 작용이 발생하는 경우, 액포는 확대. GFP-SKL은 자식 작용 (pexophagy)에 의해 공포에 통합된다. 인해 GFP는 액포 프로테아제 분해에 대한 저항성이 있다는 사실 이들 소기관 열 라벨. 따라서 액포이 변형, 공포의 확대 및 GFP-SKL의 현지화 자식 작용 (pexophagy)를 관찰하기위한 두 개의 매개 변수가 편리 형광 현미경으로 모니터링됩니다. 배양 20 시간에서, GFP가 액포 (도 1)에서 관찰되지 않는다. 또한, 공포의 확대가 이루어지고 있지 않습니다. 그러나...

기아 패드(중앙 공동이 있는 현미경 슬라이드에서 아가로스와 수돗물의 혼합물)를 사용하여 Penicillium chrysagenum의 자가포식을 연구하는 편리하고 강력한 방법이 여기에 제시되어 있습니다.

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

본 실험 절차의 목적은 사상균에서 오토파지를 유도하고 관찰하는 것입니다. 먼저 영양 성분이 포함된 배지에 소량의 포자 또는 작은 균사 조각을 접종합니다. 두 번째 단계에서는 유리 현미경 슬라이드의 홈에 기아 패드(starvation pad)를 준비한 후, 접종물을 해당 패드로 옮깁니다.마지막 단계로, 자가포식을 유도하기 위해 기아 상태 패드를 습윤 챔버에서 배양합니다. 최종적으로, 형광 현미경을 사용하여 관심 있는 형광 마커 단백질의 액포 전위를 모니터링함으로써 자가포식을 추적할 수 있습니다. 이 방법은 자가포식 과정을 조절하는 새로운 화합물의 발굴과 같이 세포 생물학 분야의 핵심 과제를 연구하는 데 도움이 될 수 있습니다.기아 실험을 준비하기 위해, 관심 있는 P cresa genum 균주를 녹색 쌀에서 배양 중인 경우, 먼저 균사가 덮인 쌀알 2~3개를 1.5 µL 원심분리 튜브에 넣고 500 µL의 효모 추출물 포도당 성장 배지 또는 GG 배지를 채웁니다. 그다음, 포자가 쌀에서 분리되도록 튜브를 30초 동안 볼텍싱하고 실온에서 하루 동안 배양합니다. 다음 날, 포자 현탁액을 멸균된 수돗물로 1:50 농도로 희석하고 잘 섞어줍니다. 만약 p cryogen이 한천 배지에서 배양 중인 경우에도 동일하게 수행합니다.피펫 팁을 사용하여 균사체의 작은 조각들을 400 µL의 멸균 수돗물과 약 100 mg의 유리 비드가 들어 있는 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 튜브를 2분 동안 볼텍싱하여 균사체가 파쇄되도록 합니다. 기아 패드(starvation pad)에서 PCE 유전자를 배양하려면, 먼저 가열판을 약 60 °C로 가열합니다.다음으로, 100 mL의 수돗물에 2 g의 aros를 넣고 결과 용액이 완전히 투명해질 때까지 전자레인지로 가열한 후, aros를 약 60 °C까지 식힙니다. 샘플당 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 400 µL의 멸균 수돗물 또는 화합물 용액을 분주합니다. 그런 다음 가열판 위에서 튜브와 현미경 슬라이드를 최소 60초 동안 가온합니다.60 °C로 가열된 aros 400 µL를 모든 튜브에 옮겨 각 튜브의 총 부피를 800 µL로 맞춘 뒤, 튜브를 짧게 볼텍싱하고 다시 가열판 위에 올려 조기 응고를 방지합니다. 이제 적절한 aros 용액 140 µL를 각 현미경 슬라이드의 캐비티에 피펫으로 분주합니다. 기포가 생기지 않도록 주의하며 즉시 커버슬립으로 aros를 평평하게 덮은 다음, 슬라이드를 약 4분 동안 그대로 둡니다.실온에서 agar 패드가 응고되면, 엄지 또는 집게손가락을 사용하여 커버 슬립을 조심스럽게 밀어 제거하고 현미경 슬라이드와 패드를 습윤 챔버에 넣습니다. 다음으로, 이전에 준비한 P er genum 5 µL를 기아 패드 중앙에 피펫팅하고, 건조를 추가로 방지하기 위해 습윤 챔버를 플라스틱 백으로 감싸되, 박스를 너무 많이 움직이거나 배양물을 방해하지 않도록 주의합니다. 그런 다음 샘플을 분석하기 전까지 접종물을 실온에서 최소 20시간 동안 보관합니다.다음 날, 슬라이드를 건조한 티슈 페이퍼로 옮긴 후 각 기아 패드(starvation pad)에 50 µL의 물을 분주합니다. 커버슬립을 사용하여 과잉된 물을 밀어내고 새 티슈 페이퍼로 제거합니다. 그런 다음 각 슬라이드에 대해 20x 대물렌즈를 사용하여 균사 성장의 전체적인 모습을 관찰합니다.Hy-Fi 내 GFP의 국소화를 평가하기 위해, 63배 또는 100배 대물렌즈로 이미지를 관찰하십시오. 마지막으로, 각 관찰이 끝난 후 다음 실험 시간까지 슬라이드를 습윤 챔버에 다시 넣어 보관하십시오.이 이미지들에서 보듯이, 배양 20시간째의 퍼옥시좀 분해를 평가하기 위해 G-F-P-S-K-L-P Creo Genum 균주가 사용되었습니다. 액포에서 GFP가 관찰되지 않았으며, 해당 소기관들이 비대해지지도 않았습니다. 그러나 성장 40시간째에는 일부 균사에서 GFP가 표지된 액포를 시각화할 수 있었으며, 이는 오토파지의 활성화를 나타냅니다. 60시간째에는 GFP 형광이 더욱 관찰되고 액포가 비대해진 것이 확인되었습니다.본 실험에서는 p caressa Genum의 delta 80 G one 돌연변이체를 음성 대조군으로 사용하였습니다. 처리되지 않은 G-F-P-S-K-L 균주에서 관찰된 것과 마찬가지로, 양성 대조군으로서 오토파지 자극 약물인 rapamycin을 사용했음에도 불구하고 성장 60시간째까지 액포 확대와 GFP가 나타나지 않았음에 유의하십시오. GFP가 표지된 액포는 성장 40시간 후에 보이기 시작했으며, 60시간째에는 Hy-Fi가 거대한 GFP 함유 액포로 완전히 채워졌습니다.이 영상을 시청하고 나면, mentis fungi의 자가포식(autophagy)을 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

analysis-autophagy-penicillium-chrysogenum-using-starvation-pads

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

저하 및 재활용을위한 효모 공포의 산성 루멘에 organelles의 전달을 모니터링하는 강력한 방법이 설명되어 있습니다. 방법은 유전자 인코딩 듀얼 발광 형광 산도 - 바이오 센서 및 형광 현미경을 사용하여 개별 세포의 시각화와 대상 organelles의 특정 상표에 의존합니다.

효모에서 모니터링 Mitophagy을위한 형광 현미경 분석 Saccharomyces cerevisiae

자식 작용은 세포가 단백질과 세포 소기관을 분해하고 재활용 할 수있는 유비쿼터스 프로세스입니다. 우리는 시각화하고 작은 정량화 고급 형광 현미경을 적용하지만, autolysosomes로 형성과 autophagosomes와 리소좀의 배포, 자신의 융합 등 자식 작용의 유도와 관련된 필수, 물리적 변화.

고급 3D 형광 현미경을 사용하여 자식 작용의 정량 분석

찬란 autophagy에 마커의 시간 경과 현미경은 높은 시간적 해상도로 동적 autophagy에 응답을 모니터링 할 수 있습니다. 3 가지 색상의 조합으로 특정 자식 작용과 세포 기관 마커를 사용하여, 우리는 강력한 공간과 시간적 맥락에서 autophagosome 형성 단백질의 기여를 볼 수 있습니다.

초기 자식 작용 이벤트의 셀 이미징 라이브 : Omegasomes을 넘어

실험 패혈증은 맹장 결찰과 천자 (CLP) 방법을 사용하여 마우스에서 유발 될 수있다. CLP - 유도 패혈증의 컨텍스트에서 생체에 autophagy를 평가하는 현재의 프로토콜이 여기에 제시된다 : (GFP) - LC3 마우스를 사용 autophagy에 측정을위한 프로토콜, 및 전자 현미경에 의해 autophagosome 형성을 측정하기위한 프로토콜.

맹장 결찰 및 마우스에서 autophagy에 공부를 모델로 패혈증 관통 유도

병원균의 확산을 대응하기 위해 숙주 세포는 박테리아를 구획하고 자식 작용을 유도하는 자신의 세포 골격을 재구성. 조직 배양 세포, 호스트와이 프로세스를 기본 병원체 결정의 사용 이질균 감염 식별 특징으로한다. 시겔 감염 제브라 피쉬 모델을 사용하여, 분자 발견 및 메커니즘의 역할은 생체에 조사된다.

사용<em&gt; 시겔 flexneri</em&gt; 자식 작용 - 세포 뼈대의 상호 작용을 연구하는

여기에 LC3 spot counting과 함께 3 개의 autophagy marker의 밝은 디테일 이미지를 비교하고 co-localization을 정량화하는 분석적인 특징을 가진 multispectral imaging flow cytometry가 객관적이고 정량적이며 통계적으로 강력한 방식으로 autophagy를 측정하는 데 사용되었습니다.

Multispectral Imaging Flow Cytometry를 사용하여 LC3, p62 및 LAMP1 Co-Localization 측정을 통한 Autophagic Flux 평가

단백질 집계 및 autophagic 플럭스의 초파리 모델의 중앙 신 경계에서의 형광 이미징-기반 세포 생물학 연구에서 양적 데이터를 추출 하는 간단 하 고 융통성 있는 워크플로 개발 했습니다. neurodegeneration입니다.

ImageJ를 사용 하 여 붙일 태그가 단백질의 편견된 분석 통해 초파리 에서 Neurodegeneration의 양적 세포 생물학

이 논문에서는 스틸, 형광 이미지 및 고해상도 투과 전자 현미경 이미지를 사용하여 연구되는 크립토코카인 세포 및 아메바의 공동 배양을 준비하기 위한 프로토콜을 자세히 설명합니다. 여기에 예시된 것은 정량적 데이터가 이러한 정성적 정보를 보완하는 방법입니다.

크립토코커스-아메바 상호 작용 을 연구할 때 현미경 기술과 형광 읽기의 상호 보완적 사용

현재 프로토콜은 영양소 고갈을 통한 초파리 멜라노가스터 유충 지방체에서 자가포식 유도를 설명하고 형질전환 파리 균주를 사용하여 자가포식의 변화를 분석합니다.

Drosophila melanogaster 유충 지방체에서 기아로 인한 자가포식 분석

이 프로토콜의 목표는 LC3 면역형광 및 LC3 도트 정량화를 통해 췌장암 및 췌장 전초 세포의 자가포식 수준을 결정하는 것입니다.

LC3 면역형광법을 사용하여 두 가지 다른 췌장 세포 모델에서 자가포식 수준 평가

여기서는 세포 초미세 구조와 관련된 희귀 단백질의 국소화를 조사하기 위한 도구로서 내인성 형광 표지를 기반으로 하는 최적화된 절편 상관 광전자 현미경을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 접근법의 힘은 바필로마이신 처리 없이 굶주린 세포에서 내인성 LC3의 초구조적 국소화에 의해 입증되었습니다.

On-Section Correlative Light-Electron Microscopy를 통한 내인성 LC3의 초구조적 국소화

학습하세요 형광 현미경과 기아 패드를 이용해 Penicillium chrysogenum에서 자식 작용을 유도하고 관찰하는 방법을. 이 기법은 진균 세포 생물학 연구와 자식 조절 화합물 발굴에 활용됩니다.

자식 작용의 분석에

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