자식 작용의 분석에

본 실험 절차의 목적은 사상균에서 오토파지를 유도하고 관찰하는 것입니다. 먼저 영양 성분이 포함된 배지에 소량의 포자 또는 작은 균사 조각을 접종합니다. 두 번째 단계에서는 유리 현미경 슬라이드의 홈에 기아 패드(starvation pad)를 준비한 후, 접종물을 해당 패드로 옮깁니다.

마지막 단계로, 자가포식을 유도하기 위해 기아 상태 패드를 습윤 챔버에서 배양합니다. 최종적으로, 형광 현미경을 사용하여 관심 있는 형광 마커 단백질의 액포 전위를 모니터링함으로써 자가포식을 추적할 수 있습니다. 이 방법은 자가포식 과정을 조절하는 새로운 화합물의 발굴과 같이 세포 생물학 분야의 핵심 과제를 연구하는 데 도움이 될 수 있습니다.

기아 실험을 준비하기 위해, 관심 있는 P cresa genum 균주를 녹색 쌀에서 배양 중인 경우, 먼저 균사가 덮인 쌀알 2~3개를 1.5 µL 원심분리 튜브에 넣고 500 µL의 효모 추출물 포도당 성장 배지 또는 GG 배지를 채웁니다. 그다음, 포자가 쌀에서 분리되도록 튜브를 30초 동안 볼텍싱하고 실온에서 하루 동안 배양합니다. 다음 날, 포자 현탁액을 멸균된 수돗물로 1:50 농도로 희석하고 잘 섞어줍니다. 만약 p cryogen이 한천 배지에서 배양 중인 경우에도 동일하게 수행합니다.

피펫 팁을 사용하여 균사체의 작은 조각들을 400 µL의 멸균 수돗물과 약 100 mg의 유리 비드가 들어 있는 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 튜브를 2분 동안 볼텍싱하여 균사체가 파쇄되도록 합니다. 기아 패드(starvation pad)에서 PCE 유전자를 배양하려면, 먼저 가열판을 약 60 °C로 가열합니다.

다음으로, 100 mL의 수돗물에 2 g의 aros를 넣고 결과 용액이 완전히 투명해질 때까지 전자레인지로 가열한 후, aros를 약 60 °C까지 식힙니다. 샘플당 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 400 µL의 멸균 수돗물 또는 화합물 용액을 분주합니다. 그런 다음 가열판 위에서 튜브와 현미경 슬라이드를 최소 60초 동안 가온합니다.

60 °C로 가열된 aros 400 µL를 모든 튜브에 옮겨 각 튜브의 총 부피를 800 µL로 맞춘 뒤, 튜브를 짧게 볼텍싱하고 다시 가열판 위에 올려 조기 응고를 방지합니다. 이제 적절한 aros 용액 140 µL를 각 현미경 슬라이드의 캐비티에 피펫으로 분주합니다. 기포가 생기지 않도록 주의하며 즉시 커버슬립으로 aros를 평평하게 덮은 다음, 슬라이드를 약 4분 동안 그대로 둡니다.

실온에서 agar 패드가 응고되면, 엄지 또는 집게손가락을 사용하여 커버 슬립을 조심스럽게 밀어 제거하고 현미경 슬라이드와 패드를 습윤 챔버에 넣습니다. 다음으로, 이전에 준비한 P er genum 5 µL를 기아 패드 중앙에 피펫팅하고, 건조를 추가로 방지하기 위해 습윤 챔버를 플라스틱 백으로 감싸되, 박스를 너무 많이 움직이거나 배양물을 방해하지 않도록 주의합니다. 그런 다음 샘플을 분석하기 전까지 접종물을 실온에서 최소 20시간 동안 보관합니다.

다음 날, 슬라이드를 건조한 티슈 페이퍼로 옮긴 후 각 기아 패드(starvation pad)에 50 µL의 물을 분주합니다. 커버슬립을 사용하여 과잉된 물을 밀어내고 새 티슈 페이퍼로 제거합니다. 그런 다음 각 슬라이드에 대해 20x 대물렌즈를 사용하여 균사 성장의 전체적인 모습을 관찰합니다.

Hy-Fi 내 GFP의 국소화를 평가하기 위해, 63배 또는 100배 대물렌즈로 이미지를 관찰하십시오. 마지막으로, 각 관찰이 끝난 후 다음 실험 시간까지 슬라이드를 습윤 챔버에 다시 넣어 보관하십시오.

이 이미지들에서 보듯이, 배양 20시간째의 퍼옥시좀 분해를 평가하기 위해 G-F-P-S-K-L-P Creo Genum 균주가 사용되었습니다. 액포에서 GFP가 관찰되지 않았으며, 해당 소기관들이 비대해지지도 않았습니다. 그러나 성장 40시간째에는 일부 균사에서 GFP가 표지된 액포를 시각화할 수 있었으며, 이는 오토파지의 활성화를 나타냅니다. 60시간째에는 GFP 형광이 더욱 관찰되고 액포가 비대해진 것이 확인되었습니다.

본 실험에서는 p caressa Genum의 delta 80 G one 돌연변이체를 음성 대조군으로 사용하였습니다. 처리되지 않은 G-F-P-S-K-L 균주에서 관찰된 것과 마찬가지로, 양성 대조군으로서 오토파지 자극 약물인 rapamycin을 사용했음에도 불구하고 성장 60시간째까지 액포 확대와 GFP가 나타나지 않았음에 유의하십시오. GFP가 표지된 액포는 성장 40시간 후에 보이기 시작했으며, 60시간째에는 Hy-Fi가 거대한 GFP 함유 액포로 완전히 채워졌습니다.

이 영상을 시청하고 나면, mentis fungi의 자가포식(autophagy)을 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.