루게릭 병에 TDP-43 변종 형태론 특정 시약의 분리에 대한 소설 원자 힘 현미경 기반 Biopanning

이 절차의 전반적인 목표는 타르 DNA 결합 단백질에 대한 형태학 특이적 시약을 분리하는 것입니다.LS에 존재하는 43개의 변이체는 2상 A FM 기반 무선 패닝 기술을 사용합니다. 이는 먼저 면역 튜브를 사용하여 다양한 파지 라이브러리에 off-target 항원에 대해 여러 차례의 음성 패닝을 적용함으로써 수행됩니다.

네거티브 패닝은 소 혈청 알부민, 응집된 알파 시누클레인 및 건강한 인간 뇌 조직에 대해 순차적으로 수행됩니다. 두 번째 단계는 원치 않는 모든 파지를 성공적으로 제거할 수 있도록 각 네거티브 패닝 세트 후에 FM 검증을 완료하는 것입니다. 이 네거티브 패닝 예제에서, 응집된 알파 시누클레인을 사용한 파지는 한 라운드 후에 볼 수 있지만 10번째 라운드 이후에는 나타나지 않습니다.

다음으로, 나머지 네거티브 패닝 라운드는 샘플 가용성이 제한되어 있기 때문에 MICA에서 수행됩니다. 면역에 반응하는 파지는 건강한 세포와 전두측두엽 치매 또는 FTD 조직에서 침전된 TDP 43을 순차적으로 제거합니다. 마지막 단계는 침전된 LS 면역에 결합하는 파지를 분리하는 것입니다.

운모 결합 파지를 사용하는 TDP 43은 트립신, 트리에틸, 아민 및 TG 1 세포를 사용하여 암시됩니다. 궁극적으로 이러한 잠재력의 특이성은 간접 fa, eliza 및 점 블롯, 균질화된 A-L-S-F-T-D 및 건강한 인간 뇌 조직을 사용하여 검증되며, 두 분석 모두에서 건강한 인간 뇌 조직이 고정됩니다. LS 조직에 대한 더 큰 반응은 일반적으로 다른 테스트 그룹에 비해 감지됩니다.

기존 파지 바이오 패닝에 비해 이 기술의 주요 장점은 FM에 의해 검증된 철저한 네거티브 패닝 프로토콜을 사용하여 낮은 농도로 존재하는 경우에도 복잡한 생물학적 샘플에서 직접 질병 특이적 단백질 변이체를 선택적으로 인식하는 시약의 분리를 보장한다는 것입니다. FM은 생체 분자 기능 및 상호 작용 조사에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 바이오 페닝의 진행 상황을 모니터링하고 단일 CLO의 특이성을 확인하는 것과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 파지 생성으로 이 절차를 시작하여 BSA에 대해 네거티브 패닝을 먼저 수행하고 밀리리터당 1밀리그램씩 4밀리리터를 추가합니다.

인산염 완충 식염수 또는 PBS의 BSA 용액을 12개의 면역관에 넣고 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 다음으로, 세 가지 라이브러리 각각에서 파지 입자를 결합하고, 나중에 네거티브 패닝 프로세스를 검증하기 위해 소량의 파지 혼합물을 따로 둡니다. 그런 다음 첫 번째 튜브에서 BSA 용액을 버리고 PBS로 튜브를 2-3회 세척하여 결합되지 않은 BSA를 제거하고, 결합된 파지 라이브러리를 이 첫 번째 튜브에 추가하고, 결합되지 않은 파지를 수집하기 전에 회전체에서 실온에서 30분 동안 배양합니다.

패닝 공정의 성공을 확인하기 위해 각 타겟에 대해 여러 차례의 네거티브 패닝을 완료한 후 소량의 파지를 저장하는 것이 중요하며, 오염이 있는 경우 매번 나머지 BSA 용액 튜브에 대해 네거티브 패닝 프로세스를 반복해야 합니다. 이전 튜브의 배양 후 수집된 결합되지 않은 파지를 사용합니다. 그런 다음 비디오의 다음 섹션에 자세히 설명된 A FM 절차를 사용하여 모든 BSA 파지 바인더의 제거를 확인합니다.

FM을 사용하여 파지 결합을 시각화하려면 10-20마이크로리터의 표적 항원을 절단된 운모에 첨가하고 5-10분 동안 배양합니다. 운모를 물로 5회 세척한 다음 10-20마이크로리터의 파지를 운모에 넣고 5-10분 동안 배양합니다. 운모를 물로 5회 더 씻고 자연 건조시킵니다.

나노 스코프 3, 실온의 공기 중 컨트롤러로 FM 태핑 모드를 사용하여 FM 이미징 프로세스를 실행합니다. 실리콘 A FM 프로브는 300 킬로헤르츠의 공진 주파수와 미터당 40 뉴턴의 스프링 상수를 가지고 있습니다. FM 팁을 팁 로더에 삽입합니다.

팁 로더를 A FM 현미경에 부착합니다. 샘플을 A FM 현미경 아래에 놓습니다. 손잡이를 사용하여 레이저를 A FM 팁에 정렬합니다.

스캔 속도를 3.05Hz로 설정하고 스캔 해상도를 라인당 512개 샘플로 설정합니다. 실리카 진동을 최적화하기 위해 기계를 자동 조정합니다. 팁의 빈도, 샘플 스캔을 시작합니다.

팁은 결합된 파지의 높이를 측정하는 MICA의 표면을 스캔합니다. 파지는 긴 흰색 선으로, 획득 후 배경을 기본적으로 평평하게 하여 이미지를 처리하여 각 이미지 내에서 모든 입자 크기가 비슷한지 확인합니다. 파지 폭은 다른 입자 크기와 스캐닝 영역으로 인해 이미지마다 다를 수 있지만, 파지가 항원에 결합하는지 여부의 정확도에는 절대 영향을 미치지 않습니다.

이미지는 2D 이미지로 평탄화되고 PEG 오염으로 인해 이미지가 불량한 영역은 향후 데이터 분석에서 제거할 수 있도록 강조 표시됩니다. 면역 침전 단백질의 양이 적기 때문에 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 건강한 인간 뇌 조직에서 건강한 TDP 43 단백질을 면역 침전시킵니다. MICA를 먼저 사용하여 이러한 네거티브 패닝을 수행하고, 약 100마이크로리터의 면역 침전 단백질에서 8개의 MICA 표면을 첫 번째 MICA로 절단하고 배양 후 실온에서 5-10분 동안 배양합니다.

0.1% 인산염 완충 식염수로 MICA를 20 약식 PBST로 5회 세척합니다. 그런 다음 건강한 인간 뇌 조직에 대한 음성 패닝 후 약 100마이크로리터의 파지를 추가하고 실온에서 5-10분 동안 배양합니다. 중간 배양에서 면역 침전 단백질을 두 번째 운모에 추가합니다.

첫 번째 운모에서 파지를 채취한 후 0.1%PBST로 운모를 5회 세척합니다. 두 번째 운모를 세척한 후 이전에 수집된 파지를 추가합니다. 파지가 면역 침전된 단백질을 가진 8개의 운모 모두에 대해 음으로 패닝될 때까지 전체 과정을 반복합니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 LS를 가진 개인의 뇌에서 TDP 43 단백질을 면역 침전시키기 시작하기 위해 FM을 사용한 첫 번째 및 8 라운드의 음성 패닝 후 파지를 사용하여 패닝 프로세스의 성공을 확인하고 3개의 운모 표면을 절단합니다. 그런 다음 실온에서 5분 동안 배양한 후 첫 번째 운모에 50마이크로리터의 A LS TDP 43을 추가합니다. 0.1%PBST로 운모를 5회 세척합니다.

다음으로, 건강한 TDP 43에 대한 음성 패닝 후 수집된 파지 50마이크로리터를 MICA에 추가하고 5분 동안 배양합니다. 바인딩되지 않은 파지를 수집합니다. 이러한 패닝 단계에서 수집된 모든 파지를 별도로 보관하는 것이 중요합니다.

다음으로, 세 가지 엘루시안 방법을 사용하여 결합된 파지를 수집합니다. 먼저 각 MICA에 50마이크로리터의 트립신을 첨가하고 10분 이상 배양하지 않습니다. 솔루션을 수집하고 저장합니다.

다음으로, 각 MICA에 50마이크로리터의 100밀리몰 트리에틸아민을 추가하고 10분 이상 배양하지 않습니다. pH 7.4의 1몰 HCL 완충액과 동일한 부피로 용액을 수집하고 세 번째로 저장하고 50마이크로리터의 TG 1 세포를 MICA에 직접 첨가하고 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 또한 처음 두 가지 elucian 방법에서 수집된 파지를 동일한 농도의 TG one 세포 100마이크로리터에 첨가하고 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다.

그런 다음 두 번째 운모로 이 과정을 반복합니다. A LST DP 43이 있는 첫 번째 MICA를 사용하여 수집된 결합되지 않은 파지를 취하고 A-A-L-S-T-D-P 43이 있는 두 번째 MICA에 5분 동안 배양합니다. 각 A LST DP 43 운모의 트립신과 모든 루리아 부라니 오거 플레이트의 플레이트에서 추출한 파지에 감염된 TG one 세포를 암피실린 또는 LBA 플레이트와 결합합니다.

트리에틸 아민과 TG 1에 대해 동일한 과정을 반복하여 총 3개의 플레이트에 대해 A, LS, TDP, 43, 운모의 두 세트에서 암시된 파지를 만듭니다. 세 번째 A LS 운모로 모든 단계를 반복하되, 이 경우 전두측두엽 치매에 대해 두 차례의 음성 패닝 후 수집된 파지를 사용합니다. T DP 43은 감염된 TG 1 세포를 3개의 LBA 플레이트에 플레이트화하고 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양합니다.

다음 날. LS 클론 가능성이 있는 6개의 LBA 플레이트에 있는 콜로니의 수를 계산합니다. 건강한 TDP 43에 대해 음성 패닝 후 파지를 활용하여 파지를 활용하여 두 차례의 포지티브 패닝 후 3개의 LBA 플레이트에 비해 세 번째 A LS 운모의 3개의 LBA 플레이트에 더 적은 콜로니가 있어야 하며, 이러한 클론에서 파지 및 용해성 단쇄 가변 도메인 항체 단편 또는 s cv를 생성하고 LS 조직에 대한 특이성을 확인하기 위해 다른 면역 분석을 사용하여 분석합니다.

FM 이미징은 모든 반응성 파지가 제거되었는지 확인하기 위해 다양한 표적에 대한 네거티브 패닝 단계를 모니터링하는 데 사용됩니다. FM 결과는 응고된 알파 시누클레인에 대해 1라운드의 음성 패닝 후 파지 결합을 보여주었고 8라운드 후에는 결합이 없음을 보여주었습니다. 건강한 인간 뇌 균질화에 존재하는 많은 항원과 결합하는 파지를 제거하기 위해 건강한 인간 뇌 조직에 대한 음성 패닝을 수행했습니다.

다음은 1라운드의 negative panning 후 건강한 조직에 대한 파지 결합과 10라운드의 negative panning 후 파지가 결합되지 않은 상태입니다. 잠재적 클론으로부터 파지(phage)와 용해성 SCFE를 모두 준비한 후, LS 조직에 대한 특이성을 위해 간접 Eliza에서 테스트했습니다. 거의 모든 파지가 건강한 조직보다 LS 조직을 선호했습니다.

LS에 대한 파지 결합을 전두측두엽 치매 또는 FTD 조직과 비교할 때도 유사한 결과를 얻을 수 있습니다. 건강한 조직과 FTD 조직 모두에서 LS 조직에 대한 SCFV 결합을 비교한 결과, 거의 모든 클론에서 LS 조직에 대한 선택적 결합이 다시 나타났습니다. 점 블롯 면역분석법은 LS 조직에 대한 결합을 추가로 확인하고 다른 면역학적 응용 분야에서 어떤 클론이 반응하는지 확인하는 데 사용되었습니다.

여기서, LS 조직에 대한 결합 2개를 복제하는 것이 도시되어 있다. 이 비디오를 시청한 후에는 FM 기반 바이옵 패닝을 적용하여 잠재적인 진단 및/또는 치료 도구로 사용될 수 있는 질병, 특정 관심 대상, 시약에 대한 시약을 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.