Name: 루게릭 병에 TDP-43 변종 형태론 특정 시약의 분리에 대한 소설 원자 힘 현미경 기반 Biopanning (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 31 s
Description: 학습하세요 루게릭 병 관련 TDP-43 변종에 특이적인 항체를 원자 힘 현미경 기반 바이오패닝으로 분리하는 방법을. 이 기술은 낮은 농도의 질병 특이 단백질 변종을 복잡한 생물학적 샘플에서 선택적으로 인식하는 진단 및 치료 도구 개발에 활용됩니다.

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이 연구는 NIH의 연구비 지원 : R21AG042066. 우리는 화면 캡처 비디오를 만드는 그의 공헌 필립 슐츠에게 감사의 말씀을 전합니다.

<ol><li>Hedieh, B., Sharareh, E., Philip, S., Michael, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+recombinant+antibodies+against+specific+protein+morphologies+using+atomic+force+microscopy+and+phage+display+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Engineering+Design+and+Selection%22%5BJournal%5D)">Isolating recombinant antibodies against specific protein morphologies using atomic force microscopy and phage display technologies.</a> Protein Engineering Design and Selection. 19, 497-502 (2006).</li>
<li>Emadi, S., Barkhordarian, H., Wang, M. S., Schulz, P., Sierks, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+Human+Single+Chain+Antibody+Fragment+Against+Oligomeric+%CE%B1-Synuclein+that+Inhibits+Aggregation+and+Prevents+%CE%B1-Synuclein-induced+Toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of a Human Single Chain Antibody Fragment Against Oligomeric α-Synuclein that Inhibits Aggregation and Prevents α-Synuclein-induced Toxicity.</a> Journal of Molecular Biology. 368, 1132-1144 (2007).</li>
<li>Emadi, S., Kasturirangan, S., Wang, M. S., Schulz, P., Sierks, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+Morphologically+Distinct+Oligomeric+Forms+of+%CE%B1-Synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Detecting Morphologically Distinct Oligomeric Forms of α-Synuclein.</a> Journal of Biological Chemistry. 284, 11048-11058 (2009).</li>
<li>Kasturirangan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanobody+specific+for+oligomeric+beta-amyloid+stabilizes+nontoxic+form%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Nanobody specific for oligomeric beta-amyloid stabilizes nontoxic form.</a> Neurobiology of Aging. 33, 1320-1328 (2012).</li>
<li>Kasturirangan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+antibody+fragments+selective+for+specific+protein+morphologies+from+nanogram+antigen+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of antibody fragments selective for specific protein morphologies from nanogram antigen samples.</a> Biotechnology Progress. 29, 463-471 (2013).</li>
<li>Zameer, A., Kasturirangan, S., Emadi, S., Nimmagadda, S. V., Sierks, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-oligomeric+A%CE%B2+Single-chain+Variable+Domain+Antibody+Blocks+A%CE%B2-induced+Toxicity+Against+Human+Neuroblastoma+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Anti-oligomeric Aβ Single-chain Variable Domain Antibody Blocks Aβ-induced Toxicity Against Human Neuroblastoma Cells.</a> Journal of Molecular Biology. 384, 917-928 (2008).</li>
<li>Boddapati, S., Levites, Y., Sierks, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibiting+%CE%B2-Secretase+Activity+in+Alzheimer%27s+Disease+Cell+Models+with+Single-Chain+Antibodies+Specifically+Targeting+APP%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Inhibiting β-Secretase Activity in Alzheimer's Disease Cell Models with Single-Chain Antibodies Specifically Targeting APP.</a> Journal of Molecular Biology. 405, 436-447 (2011).</li>
<li>Boddapati, S., Levites, Y., Suryadi, V., Kasturirangan, S., Sierks, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bispecific+Tandem+Single+Chain+Antibody+Simultaneously+Inhibits+%CE%B2-Secretase+and+Promotes+%CE%B1-Secretase+Processing+of+A%CE%B2PP%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimer%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Bispecific Tandem Single Chain Antibody Simultaneously Inhibits β-Secretase and Promotes α-Secretase Processing of AβPP.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 28, 961-969 (2012).</li>
<li>Zhou, C., Emadi, S., Sierks, M. R., Messer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Human+Single-Chain+Fv+Intrabody+Blocks+Aberrant+Cellular+Effects+of+Overexpressed+%5Balpha%5D-Synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">A Human Single-Chain Fv Intrabody Blocks Aberrant Cellular Effects of Overexpressed [alpha]-Synuclein.</a> Mol Ther. 10, 1023-1031 (2004).</li>
<li>Vanden Broeck, L., Callaerts, P., Dermaut, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43-mediated+neurodegeneration%3A+towards+a+loss-of-function+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">TDP-43-mediated neurodegeneration: towards a loss-of-function hypothesis.</a> Trends in Molecular Medicine. 20, 66-71 (2014).</li>
<li>Akamatsu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+mouse+model+for+investigating+the+properties+of+amyotrophic+lateral+sclerosis-associated+protein+TDP-43%2C+by+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">A unique mouse model for investigating the properties of amyotrophic lateral sclerosis-associated protein TDP-43, by in utero electroporation.</a> Neuroscience Research. 77, 234-241 (2013).</li>
<li>Keage, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43+in+the+Population%3A+Prevalence+and+Associations+with+Dementia+and+Age%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimer%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">TDP-43 in the Population: Prevalence and Associations with Dementia and Age.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 42, 641-650 (2014).</li>
<li>Honda, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ALS%2FFTLD-related+RNA-binding+proteins+TDP-43+and+FUS+have+common+downstream+RNA+targets+in+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Open+Bio%22%5BJournal%5D)">The ALS/FTLD-related RNA-binding proteins TDP-43 and FUS have common downstream RNA targets in cortical neurons.</a> FEBS Open Bio. 4, 1-10 (2014).</li>
<li>Baloh, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43%3A+the+relationship+between+protein+aggregation+and+neurodegeneration+in+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+frontotemporal+lobar+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">TDP-43: the relationship between protein aggregation and neurodegeneration in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal lobar degeneration.</a> FEBS Journal. 278, 3539-3549 (2011).</li>
<li>Ling, S. -C., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Converging Mechanisms in ALS and FTD: Disrupted RNA and Protein. 79, 416-438 (2013).</li>
<li>Sasaki, S., Takeda, T., Shibata, N., Kobayashi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+subcellular+localization+of+TDP-43+immunoreactivity+in+the+anterior+horns+in+sporadic+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Alterations in subcellular localization of TDP-43 immunoreactivity in the anterior horns in sporadic amyotrophic lateral sclerosis.</a> Neuroscience Letters. 478, 72-76 (2010).</li>
<li>Robertson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+TDP-43+abnormalities+in+mutant+SOD1+transgenic+mice+shows+disparity+with+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Lack of TDP-43 abnormalities in mutant SOD1 transgenic mice shows disparity with ALS.</a> Neuroscience Letters. 420, 128-132 (2007).</li>
<li>Shan, X., Vocadlo, D., Krieger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mislocalization+of+TDP-43+in+the+G93A+mutant+SOD1+transgenic+mouse+model+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Mislocalization of TDP-43 in the G93A mutant SOD1 transgenic mouse model of ALS.</a> Neuroscience Letters. 458, 70-74 (2009).</li>
<li>Yamashita, T., Hideyama, T., Teramoto, S., Kwak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+abnormal+processing+of+TDP-43+is+not+an+upstream+event+of+reduced+ADAR2+activity+in+ALS+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">The abnormal processing of TDP-43 is not an upstream event of reduced ADAR2 activity in ALS motor neurons.</a> Neuroscience Research. 73, 153-160 (2012).</li>
<li>Dong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curcumin+abolishes+mutant+TDP-43+induced+excitability+in+a+motoneuron-like+cellular+model+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Curcumin abolishes mutant TDP-43 induced excitability in a motoneuron-like cellular model of ALS.</a> Neuroscience. 272, 141-153 (2014).</li>
<li>Sheets, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+construction+of+a+large+nonimmune+phage+antibody+library%3A+The+production+of+high-affinity+human+single-chain+antibodies+to+protein+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Efficient construction of a large nonimmune phage antibody library: The production of high-affinity human single-chain antibodies to protein antigens.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, 6157-6162 (1998).</li>
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<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+single-chain+antibodies+from+a+human+synthetic+phage+display+library+for+detection+of+Bacillus+thuringiensis+%28Bt%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cry1B+toxin.+Ecotoxicology+and+Environmental+Safety%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of single-chain antibodies from a human synthetic phage display library for detection of Bacillus thuringiensis (Bt).</a> Cry1B toxin. Ecotoxicology and Environmental Safety. 81, 84-90 (2012).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+and+characterization+of+single-chain+recombinant+antibodies+against+spring+viraemia+of+carp+virus+from+mouse+phage+display+library%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Selection and characterization of single-chain recombinant antibodies against spring viraemia of carp virus from mouse phage display library.</a> Journal of Virological Methods. 194, 178-184 (2013).</li>
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<li>Wang, M. S., Zameer, A., Emadi, S., Sierks, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+Antibody+Specificity+to+Different+Protein+Morphologies+by+AFM%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Characterizing Antibody Specificity to Different Protein Morphologies by AFM.</a> Langmuir. 25, 912-918 (2008).</li>
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</ol>

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단백질 변이는 알츠하이머병, 파킨슨병, ALS 및 FTD1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11과 같은 많은 신경퇴행성 질환의 진행에 관여하는 것으로 나타났습니다. 이러한 다양한 단백질 변이 표적을 선택적으로 인식할 수 있는 항체의 분리는 이러한 질병을 연구, 진단 및 잠재적으로 치료하는 데 효과적인 시약이 될 수 있습니다. 이러한 변이 특이적 항체를 생성하기 위해 우리는 원자력 현미경을 활용하여 각 단계의 진행 상황을 모니터링하는 새로운 바이오패닝 공정을 개발했습니다. 유사한 음성 및 양성 바이오패닝 조합을 사용한 이전 연구에서는 올리고머 베타-아밀로이드5에 결합하는 클론이 생성되었습니다. 여기에서 우리는 인간 뇌 조직 샘플에 존재하는 질병 특이적 단백질 변이체에 선택적으로 결합하는 시약을 효율적으로 생성할 수 있음을 입증하기 위해 이러한 연구를 확장합니다. 우리는 인간 ALS 뇌 조직에 고유하게 존재하는 TDP-43 변이를 선택적으로 인식하는 형태학적 특이적 시약을 분리했습니다...

단백질 변이체의 존재는 알쯔하이머, ​​파킨슨, ALS 및 전 측두엽 치매 (FTD) 1,2,3,4,5,6,7,8,9 같은 신경 퇴행성 질환을 포함한 다양한 질환의 진행에 인자로서 연루되어왔다 , 10, 11. 단백질 베타 아밀로이드 및 알파 - 시누 클레인의 올리고머 형태의 알츠하이머와 파킨슨 각각 2,3,4,5에 대한 책임이있는 독성 종 것으로 생각된다. TAR DNA 결합 단백질 43 (TDP-43)의 집계는 ALS와 FTD 12,13,14에 연결되어있다. 따라서 선택적으로 다른 단백질 변종으로 진단 마커 및 잠재적 치료제를 제공 할 수있는 강력한 도구가 될 수 타겟팅 할 수있는 항체와 같은 시약. 이 연구에서 우리는 그러나이 문서에서 설명 된 기술은 제자의 넓은 범위에 대해 시약의 분리에 적용해야한다, 선택적으로 ALS에 연루 TDP-43 단백질의 변형을 결합 시약을 개발에 초점을 맞추고EIN은 변종. TDP-43의 세포질 집계 ALS 15,16,17,18,19의 병리학 적 기능으로 확인되었습니다. 그것은 세포질과 핵 15,17 사이를 이동하는 경향이 있지만, 일반적으로 TDP-43은 정상인의 모든 세포의 핵에서 발견된다. TDP-43의 그러나 ALS 집계 양식은 질병의 진행 16, 20시 세포질에 핵에서 TDP-43의 움직임을 제안하는 핵에있는 낮은 농도로 선택 신경 세포의 세포질과 아교 세포에서 발견된다. TDP-43의 응집 ALS의 대부분의 경우에서 발견되는 반면, 돌연변이에 연결된 1 % 총 ALS 케이스 (또는 15 % 가족 ALS 사례의 20 %)의 -2 % 보낸 모든 경우를 고려하지 않는다 슈퍼 옥사이드 디스 뮤 타제 1 (SOD1) 유전자 15,17. 때문에 ALS의 대부분의 경우에 TDP-43의 중요한 역할로, 여기에 우리가 선택적입니다 TDP-43 변형에 결합 할 수 항체 기반의 시약을 개발에 초점우리의 새로운 AFM 기반 biopanning 기술을 이용하여 인간의 ALS의 뇌 조직에 존재. 처음에 우리는 항체 결합 도메인의 다양한 레퍼토리를해야합니다. 우리는 세 가지 다른 파지 디스플레이 단일 쇄 가변 도메인 항체 단편 (scFvs) 라이브러리 (톰린슨 I 및 J 및 시트 라이브러리 21)를 결합했다. 패닝 과정은 음성 및 양성 패닝 단계로 구분된다. 파아지 라이브러리의 첫번째 다수 오프 표적 항원을 제외 반응성 파지되는 동안 음의 패닝 처리가 실시된다. 각 오프 - 타겟 항원에 대한 부정적인 패닝 각 라운드의 종료 후, 처리는 오프 - 타겟 항원 결합 파지 모두가 제거되었는지를 확인하기 위해 AFM 촬상에 의해 모니터링된다. 만 모든 반응 파지가 제거 AFM 이미징에 의해 확인 후 우리는 다음 목표로 진행 않습니다. ALS에 연루 TDP-43 변종 시약을 분리하기 위해 우리는 다음과 같은 부정적인 패닝 항원을 사용 :<html> 1) BSA는 약하게 또는 비특이적 단백질에 결합하는 파지를 제거; 2) 집계 알파 - 시누 클레인 집계 단백질의 일반적인 구조 요소에 결합하는 파지를 제거; 3) 인간의 뇌 조직 균질은 단백질이나 건강한 사람의 뇌 조직의 사후 샘플에 존재하는 다른 구성 요소에 결합하는 파지를 제거; 4) 건강한 사람의 뇌와 관련된 모든 TDP-43 형태로 결합하는 파지를 제거하기 위해 건강한 사람의 뇌에서 TDP-43 면역; 5) TDP-43 비 ALS 병리와 관련된 TDP-43 변종을 결합하는 파지를 제거하기 위해 FTD 뇌 균질에서 격리 면역. 모든 오프 - 타겟 항원에 대한 반응성 모든 파지를 제거한 후에, 우리는 인간 ALS의 뇌 조직에서 면역 침전이 경우 TDP-43, 관심 항원 결합 항체 단편을 단리하는 동안, 포지티브 패닝 단계로 진행. 이러한 고립 된 항체는 TDP-43의 집계 또는 수정 된 형태로 반응 할 수있다. &quot;&gt; 기존 파지 biopanning가 긍정적 인 패닝 단계 (22, 23)에 주로 초점을 맞추고있다. 일반적으로 관심의 대상이 고정화되어, 파지 라이브러리를 추가하고 바운드 파지.이 증폭 배양 과정을 파지 한 후 증폭된다. 용출 다시 대상에 추가 이 프로세스의 변화가 타겟 항원의 넓은 범위에 대해 항체 시약을 분리하기 위해 광범위하게 사용되었지만, 일반적으로 양성 파지 결합의 비율을 증가시키기 위해 여러 번 반복된다. 그들은 일반적으로 정제 된 표적 항원 24,25,26 다량 필요 우리의 프로세스는 표적 항원 미량 필요 반면. 27 여기에서 설명한 프로토콜은 정제 및 패닝 필요없이 매우 낮은 농도로 존재 선택적 바인딩 대상 항원,에 대해 직접 수행 될 수 시약을 분리하는데 사용될 수있다 복잡한 조직 샘플에 존재하는 항원. 철저한 네거티브 패닝 프로토콜의 사용을 통해 입증AFM에 의해 정제 또는 농축하지 않을 경우 양의 항원에 대해 격리 클론 선택적으로도 대상을 결합하는 것을 보장한다. Kasturirangan 및 동료 (2003)는 타겟 (5)의 나노 그램의 농도를 이용하여 베타 - 아밀로이드 올리고머와 반응하는 항체를 분리하는 유사한 음성 및 양성 biopanning 처리를 실시했다. 여기에서 우리는 선택적으로 질병 특정한 단백질이 인간의 조직 샘플에서 직접 변종 결합 시약의 생성을 사용하려면이 프로세스를 확장합니다. 향후 연구에서 우리는 또한 여기뿐 절연 진단 시약의 값을 조사 할뿐만 아니라, ALS를 치료하기위한 그들의 치료 학적 관련성을 평가하고자. 전반적으로, 우리의 신규 biopanning AFM 기반 기술은, 단백질 정제 또는 변경의 필요성없이 생체 물질에 특이 질병 변이체 단백질의 분리에 적용되어야하는 경우에도 표적 항원 concentratioNS은 매우 낮다.

<table><tbody><tr><td>Tomlinson I and J Libraries</td><td>MRC (영국 케임브리지)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sheets Library</td><td>MRC (영국 케임브리지)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2xYT</td><td>BD Sciences</td><td>244020</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Amresco</td><td>0188-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Amresco</td><td>0339-25G</td><td>Irritant</td></tr><tr><td>KM13 Helper Phage</td><td>MRC (영국 케임브리지)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>OmniPur</td><td>5880</td><td>자극성</td></tr><tr><td>폴리에틸렌 글리콜 8000</td><td>OmniPur</td><td>6510</td><td>자극성</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>마크론</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 이염기성</td><td>Amresco</td><td>0404-1KG</td><td>자극성</td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>EMD</td><td>PX1405-1</td><td>자극성</td></tr><tr><td>칼륨 인산염 일염기성</td><td>Amresco</td><td>0781-500G</td><td>자극성</td></tr><tr><td>TG1 세포</td><td>MRC(영국 케임브리지)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luria-Bertani Agar</td><td>EMD</td><td>1.10283.0500</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Amresco</td><td>0332-100G</td><td></td></tr><tr><td>STEN 버퍼</td><td>Crystalgen Inc.</td><td></td><td></td>33429775</tr><tr><td>Immunotubes</td><td>Thermo Scientific</td><td>470319</td><td></td></tr><tr><td>Mica</td><td>Spruce Pine Mica</td><td>24365</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>EMD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma</td><td>T-0303</td><td>자극성</td></tr><tr><td>트리에틸아민</td><td>Sigma</td><td>T-0886</td><td>가연성</td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Amresco</td><td>0854-1L</td><td>자극제</td></tr><tr><td>DNA 플라스미드 준비 키트</td><td>qiagen</td><td>27106</td><td>자극성</td></tr><tr><td>무지방 분유 카</td><td>네이션</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-웰 고 결합 ELISA 플레이트</td><td>Costar</td><td>3590</td><td></td></tr><tr><td>Anti-M13 HRP</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>27-9421-01</td><td></td></tr><tr><td>ELISA Femto Chemiluminescence Substrate Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>37074</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TDP 43 Polyclonal Antibody</td><td>ProteinTech</td><td>10782-2-AP</td><td></td></tr><tr><td>A/G Agarose Beads</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2003</td><td></td></tr><tr><td>HB 2151 Cells</td><td>MRC (Cambridge, England)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropylthiogalactoside</td><td>Teknova</td><td>13325</td><td></td></tr><tr><td>9e10 HRP</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-40</td><td></td></tr><tr><td>니트로셀룰로오스 멤브레인</td><td>Biorad</td><td>162-0115</td><td>가연성</td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Thermo Scientific</td><td>Sorvall RC 6+</td><td></td></tr><tr><td>Nanoscope IIIa 원자력 현미경</td><td>Veeco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AFM 프로브</td><td>VistaProbes</td><td>T300R-10</td><td></td></tr></tbody></table>

루게릭 병에 tdp-43 변종 형태론 특정 시약의 분리에 대한 소설 원자 힘 현미경 기반 biopanning

Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis

단백질 변형은 TDP-43 루게릭 병에 (ALS)에서, 알파 - 시누 클레인 등 많은 질환에 중요한 역할을하기 때문에 파킨슨 병 및 알츠하이머 병에서 베타 - 아밀로이드와 타우, 그것은 형태 특정 시약을 선택적으로 타겟팅 할 수 있습니다 개발하는 것이 매우 중요하다 이러한 질병 특정한 단백질은 질병 병리학에 잠재적 인 진단 및 치료 응용 프로그램에 대한 이러한 변형의 역할을 연구하는 변종. 우리는 선택적 질병 특정한 단백질 변이체를 인식 시약의 분리를 가능하게 신규 원자력 현미경 (AFM) 계 biopanning 기술을 개발했다. 프로세스, 음성 및 양성 패닝 단계에 관여하는 두 가지 주요 단계가 있습니다. 네거티브 패닝 단계 동안 오프 - 타겟 항원에 대한 반응성이 파지 엄선 오프 표적 항원을 이용한 서브 트랙 티브 시리즈 패닝 여러 발사를 통해 제거된다. 음의 핵심 기능패닝 단계는 프로세스를 모니터링하고 모든 바람직하지 않은 파지 입자를 제거하는 것을 확인하기 위해 AFM을 이용하여 촬상된다. 포지티브 패닝 위상 관심 표적 항원은 운모 표면에 고정되고 결합 된 파지를 용출 선택적 표적 항원에 결합 된 파지를 식별하기 위해 스크리닝한다. 목적 단백질 변이체는 적절한 네거티브 패닝 제어가 사용되어왔다 제공 정제 할 필요가 없다. 심지어 양의 패닝 단계에서 이용 될 수있는 복잡한 생체 물질은 매우 낮은 농도로 존재하는 유일한 단백질 변이체를 타겟팅. 이 기술의 응용 프로그램을 통해, 우리는 선택적으로 인간의 ALS의 뇌 조직에서 발견되는 TDP-43의 단백질 변형에 대한 항체를 인수했다. 우리는이 프로토콜은 선택적으로 다른 생물학적 과정 및 다양한 질병에 존재하는 단백질 변이체를 생성하는 바인딩 시약에 적용 할 것을 기대한다.

그림 1에서 회로도는 우리가 immunotubes를 사용하여 우리의 라이브러리에서 오프 대상 항원을 결합 파지를 제거하는 부정적인 패닝 과정을 보여줍니다. 이 공통 차단 에이전트와 미래의 면역에 문제가 될 것이 목표 비특이적 반응만한 파지이기 때문에 우리는 처음 BSA 시작했다. 다음으로, 우리는 집계 단백질 (즉, 집계 알파 - 시누 클레인에 교차 반응 것 항체, TDP-43, 아 베타 등)의 일반적인 구조와 반응성이 파지를 제거하기 위해 집계 된 알파 - 시누 클레인에 바인더를 제거했습니다. AFM 결과 파지 집계 된 알파 - 시누 클레인에 대한 부정적인 패닝의 1 라운드 (그림 2A) 구속력이되고 더 8 라운드 (그림 2B) 구속력을 보였다. 우리는 다음 음으로 건강한 사람의 뇌 균질에 존재하는 많은 항원을 결합 파지를 제거하기 위해 건강한 사람의 뇌 조직에 대해 됐어요. 그림 2C</...

바이오패닝 기술과 원자력 현미경을 사용하여 낮은 농도에서도 모든 생물학적 물질에 존재하는 질병 특이적 단백질 변이체에 대한 항체를 획득하는 음성 및 양성 바이오패닝 시스템을 만들었습니다. 우리는 근위축성 측삭 경화증(Amyotrophic Lateral Sclerosis)과 관련된 TDP-43 단백질 변이체에 대한 항체를 획득하는 데 성공했습니다.

루게릭 병에 TDP-43 변종 형태론 특정 시약의 분리에 대한 소설 원자 힘 현미경 기반 Biopanning

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in ...

이 절차의 전반적인 목표는 2단계 A FM 기반 방사성 패닝 기술을 활용하여, LS에 존재하는 tar DNA 결합 단백질의 43가지 변이체에 대해 형태 특이적 시약을 분리하는 것입니다. 이는 먼저 면역 튜브를 사용하여 비표적 항원에 대해 다회차 음성 패닝을 다양한 파지 라이브러리에 수행함으로써 이루어집니다.음성 패닝(Negative panning)은 소 혈청 알부민, 응집된 alpha synuclein 및 건강한 인간 뇌 조직을 대상으로 순차적으로 수행합니다. 두 번째 단계는 각 음성 패닝 세트 이후에 FM 검증을 완료하여 원치 않는 모든 파지가 성공적으로 제거되었는지 확인하는 것입니다. 이 음성 패닝 예시에서, 응집된 alpha synuclein을 사용했을 때 1라운드 후에는 파지가 관찰되지만, 10라운드 후에는 소실됩니다.다음으로, 샘플 양이 제한적이므로 나머지 음성 패닝 라운드는 MICA에서 수행합니다. 건강한 조직 및 전두측두엽 치매(FTD) 조직에서 면역 침전된 TDP 43에 반응하는 파지들을 순차적으로 제거합니다. 마지막 단계는 $\alpha$ LS 면역 침전물에 결합하는 파지를 분리하는 것입니다.mica 결합 파지를 이용한 TDP-43 검출은 trypsin, triethyl amine 및 TG-1 세포를 사용하여 수행됩니다. 최종적으로, 이러한 잠재적 ALS 클론의 특이성은 간접 FA-ELISA 및 dot blot을 통해 검증하며, 두 분석법 모두에 균질화된 ALS-FTD 및 건강한 인간 뇌 조직을 고정합니다. 일반적으로 다른 시험군에 비해 ALS 조직에서 더 높은 반응성이 검출됩니다.이 기술이 기존의 파지 바이오 패닝(phage bio panning)보다 갖는 주요 장점은 FM으로 검증된 철저한 음성 패닝 프로토콜을 사용하여, 복잡한 생물학적 시료 내에 낮은 농도로 존재하더라도 질환 특이적 단백질 변이체를 선택적으로 인식하는 시약을 분리해낼 수 있다는 점입니다. FM은 생체 분자의 특성과 상호작용을 조사하는 통찰력을 제공할 뿐만 아니라, 바이오 패닝의 진행 과정을 모니터링하거나 단일 CLO의 특이성을 확인하는 등 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 상세히 설명된 파지 생산 단계부터 시작하여 먼저 BSA에 대한 음성 패닝을 수행하며, 1 mg/mL 농도의 용액 4 mL를 추가하십시오.12개의 면역 튜브(immuno tube)에 인산염 완충 식염수 또는 PBS 내의 BSA 용액을

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

Source: Williams, S. M. et al. Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates tapping-mode AFM to visualize phage–antigen interactions on a mica surface. It outlines the steps for antigen immobilization, phage binding, and high-resolution nanoscale imaging.

Atomic Force Microscopy to Visualize Phage–Antigen Interactions

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