루게릭 병에 TDP-43 변종 형태론 특정 시약의 분리에 대한 소설 원자 힘 현미경 기반 Biopanning

이 절차의 전반적인 목표는 2단계 A FM 기반 방사성 패닝 기술을 활용하여, LS에 존재하는 tar DNA 결합 단백질의 43가지 변이체에 대해 형태 특이적 시약을 분리하는 것입니다. 이는 먼저 면역 튜브를 사용하여 비표적 항원에 대해 다회차 음성 패닝을 다양한 파지 라이브러리에 수행함으로써 이루어집니다.

음성 패닝(Negative panning)은 소 혈청 알부민, 응집된 alpha synuclein 및 건강한 인간 뇌 조직을 대상으로 순차적으로 수행합니다. 두 번째 단계는 각 음성 패닝 세트 이후에 FM 검증을 완료하여 원치 않는 모든 파지가 성공적으로 제거되었는지 확인하는 것입니다. 이 음성 패닝 예시에서, 응집된 alpha synuclein을 사용했을 때 1라운드 후에는 파지가 관찰되지만, 10라운드 후에는 소실됩니다.

다음으로, 샘플 양이 제한적이므로 나머지 음성 패닝 라운드는 MICA에서 수행합니다. 건강한 조직 및 전두측두엽 치매(FTD) 조직에서 면역 침전된 TDP 43에 반응하는 파지들을 순차적으로 제거합니다. 마지막 단계는 $\alpha$ LS 면역 침전물에 결합하는 파지를 분리하는 것입니다.

mica 결합 파지를 이용한 TDP-43 검출은 trypsin, triethyl amine 및 TG-1 세포를 사용하여 수행됩니다. 최종적으로, 이러한 잠재적 ALS 클론의 특이성은 간접 FA-ELISA 및 dot blot을 통해 검증하며, 두 분석법 모두에 균질화된 ALS-FTD 및 건강한 인간 뇌 조직을 고정합니다. 일반적으로 다른 시험군에 비해 ALS 조직에서 더 높은 반응성이 검출됩니다.

이 기술이 기존의 파지 바이오 패닝(phage bio panning)보다 갖는 주요 장점은 FM으로 검증된 철저한 음성 패닝 프로토콜을 사용하여, 복잡한 생물학적 시료 내에 낮은 농도로 존재하더라도 질환 특이적 단백질 변이체를 선택적으로 인식하는 시약을 분리해낼 수 있다는 점입니다. FM은 생체 분자의 특성과 상호작용을 조사하는 통찰력을 제공할 뿐만 아니라, 바이오 패닝의 진행 과정을 모니터링하거나 단일 CLO의 특이성을 확인하는 등 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 상세히 설명된 파지 생산 단계부터 시작하여 먼저 BSA에 대한 음성 패닝을 수행하며, 1 mg/mL 농도의 용액 4 mL를 추가하십시오.

12개의 면역 튜브(immuno tube)에 인산염 완충 식염수 또는 PBS 내의 BSA 용액을 넣고 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음으로, 세 가지 라이브러리 각각의 파지 입자를 혼합하며, 향후 음성 패닝(negative panning) 과정의 검증을 위해 이 파지 혼합물의 소량을 따로 보관합니다. 그런 다음 첫 번째 튜브의 BSA 용액을 버리고 PBS로 튜브를 2~3회 세척하여 결합되지 않은 BSA를 제거한 후, 혼합된 파지 라이브러리를 이 첫 번째 튜브에 넣고 회전기(rotator) 위에서 실온으로 30분 동안 배양한 다음 결합되지 않은 파지를 수집합니다.

각 표적에 대해 수차례의 음성 패닝(negative panning) 라운드를 마친 후, 패닝 과정의 성공 여부를 확인하기 위해 소량의 파지를 저장해 두는 것이 중요하며, 오염이 발생한 경우 남은 BSA 용액 튜브를 사용하여 매번 음성 패닝 과정을 반복하십시오. 이전 튜브의 배양 후 수집된 비결합 파지를 사용하십시오. 그런 다음, 비디오의 다음 섹션에 상세히 설명된 A FM 절차를 통해 모든 BSA 파지 결합체가 제거되었는지 확인하십시오.

FM을 사용하여 파지 결합을 시각화하려면, 10~20 µL의 표적 항원을 절단된 mica에 첨가하고 5~10분 동안 배양합니다. MICA를 물로 5회 세척한 후, MICA에 10~20 µL의 파지를 첨가하고 5~10분 동안 배양합니다. mica를 물로 다시 5회 세척하고 공기 중에서 건조시킵니다.

실온의 공기 중에서 Nanoscope III 컨트롤러를 사용하여 AFM 태핑 모드로 AFM 이미징 프로세스를 수행합니다. 실리콘 AFM 프로브의 공진 주파수는 300 kHz이며 스프링 상수는 40 N/m입니다. AFM 팁을 팁 로더에 삽입하십시오.

팁 로더를 AFM 현미경에 부착합니다. 시료를 AFM 현미경 아래에 놓습니다. 노브를 사용하여 레이저를 AFM 팁에 맞춥니다.

스캔 속도를 3.05 hertz로, 스캔 해상도를 라인당 512 samples로 설정하십시오. 실리카 진동을 최적화하기 위해 장비를 Auto-Tune 하십시오. 팁의 주파수가 설정되면 샘플 스캔을 시작하십시오.

팁이 MICA 표면을 스캔하여 결합된 파지의 높이를 측정합니다. 파지는 긴 흰색 선으로 나타납니다. 획득 과정 이후, 각 이미지 내에서 모든 입자 크기를 비교 가능하게 하기 위해 배경을 기본 평탄화하여 이미지를 처리합니다. 다른 입자 크기와 스캔 영역으로 인해 이미지마다 파지의 너비가 다를 수 있으나, 이는 파지가 항원에 결합했는지 여부에 대한 정확성에 영향을 주지 않습니다.

이미지를 2D 이미지로 평면화하며, PEG 오염으로 인해 영상 품질이 낮은 영역은 향후 데이터 분석에서 제외하기 위해 표시합니다. 면역 침전된 단백질의 양이 적으므로, 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 건강한 인간 뇌 조직에서 건강한 TDP 43 단백질을 면역 침전시킵니다. MICA를 사용하여 이러한 음성 패닝(negative panning) 단계를 먼저 수행합니다. 약 100 µL의 면역 침전된 단백질을 첫 번째 MICA에 첨가하여 8개의 MICA 표면을 분리하고, 실온에서 5~10분 동안 배양합니다.

MICA를 0.1% phosphate buffered saline with tween 20(약어 PBST)으로 5회 세척합니다. 그다음, 건강한 인간 뇌 조직을 대상으로 한 음성 패닝(negative panning) 후의 파지를 약 100 µL 첨가하고 실온에서 5~10분 동안 배양합니다. 배양 중간에 면역침강된 단백질을 두 번째 MICA에 첨가합니다.

MICA를 0.1% PBST로 5회 세척하기 전에 첫 번째 MICA에서 파지를 수집합니다. 두 번째 MICA를 세척한 후, 이전에 수집한 파지를 첨가합니다. 면역 침강된 단백질이 포함된 8개의 모든 MICA에 대해 파지가 음성 패닝(negative panning)될 때까지 전체 과정을 반복합니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로, LS 환자의 뇌에서 TDP 43 단백질의 면역 침전물을 얻기 위해 FM을 사용하여 1회 및 8회차 음성 패닝 후 파지를 이용한 패닝 과정의 성공 여부를 확인하고, 3개의 MICA 표면을 분리합니다. 그 다음, 실온에서 5분간 배양 후 첫 번째 MICA에 50 µL의 A LS TDP 43를 첨가합니다. MICA를 0.1% PBST로 5회 세척합니다.

다음으로, 건강한 TDP 43에 대해 음성 패닝 후 수집한 파지를 50 µL 취하여 MICA에 첨가하고 5분 동안 배양합니다. 결합되지 않은 파지를 수집합니다. 이러한 패닝 단계에서 수집한 모든 파지를 각각 분리하여 보관하는 것이 중요합니다.

다음으로, 세 가지 용출 방법을 사용하여 결합된 파지를 수집합니다. 먼저, 각 MICA에 trypsin 50 µL를 첨가하고 10분 이내로 배양합니다. 용액을 수집하여 보관합니다.

다음으로, 각 MICA에 100 millimolar triethylamine 50 µL를 첨가하고 10분 이내로 배양합니다. 1 molar tris HCL buffer pH 7.4를 동일한 부피로 넣어 용액을 수집하고 저장한 뒤, TG one 세포 50 µL를 MICA에 직접 첨가하고 37 °C에서 30분 동안 배양합니다. 또한, 처음 두 가지 용출 방법으로 수집한 파지들을 동일한 농도의 TG one 세포 100 µL에 첨가하고 37 °C에서 30분 동안 배양합니다.

다음으로, 두 번째 MICA를 사용하여 이 과정을 반복합니다. 첫 번째 MICA(A LST DP 43)를 통해 수집된 결합되지 않은 파지를 취해 두 번째 MICA(A-A-L-S-T-D-P 43)에 넣고 5분 동안 배양합니다. 각 A LST DP 43 MICA에서 트립신으로 처리하여 파지가 감염된 TG1 세포를 결합시킨 후, ampicillin이 포함된 LB agar 플레이트 또는 LBA 플레이트에 도말합니다.

두 세트의 A LS TDP 43 MICA에서 얻은 triethyl amine 및 TG one 관련 파지에 대해 동일한 과정을 반복하여 총 3개의 플레이트를 준비합니다. 세 번째 A LS MICA를 사용하여 모든 단계를 반복하되, 이 경우에는 전두측엽 치매(frontotemporal dementia)에 대해 두 차례의 음성 패닝(negative panning)을 거친 후 수집한 파지를 사용합니다. T DP 43 플레이트의 감염된 TG one 세포를 3개의 LBA 플레이트에 도말하고 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.

다음 날, ALS 클론 가능성이 있는 6개의 LBA 플레이트에서 콜로니 수를 측정합니다. 건강한 TDP-43 생성 파지에 대해 음성 패닝(negative panning)을 수행한 후, 두 차례의 양성 패닝을 거쳐 도말한 3개의 LBA 플레이트에 비해, 세 번째 ALS MICA 이후 도말한 3개의 LBA 플레이트에서는 콜로니 수가 더 적어야 합니다. 이 클론들로부터 파지 및 수용성 단일 사슬 가변 도메인 항체 단편(scV)을 생성하고, 다양한 면역 분석법을 사용하여 ALS 조직에 대한 특이성을 검증합니다.

다양한 표적에 대한 음성 패닝 단계에서 모든 반응성 파지가 제거되었는지 확인하기 위해 FM 이미징을 사용합니다. FM 결과, 응집된 alpha synuclein에 대해 1라운드의 음성 패닝 후에는 파지 결합이 나타났으나, 8라운드 후에는 결합이 나타나지 않았습니다. 정상 인간 뇌 호모게네이트에 존재하는 수많은 항원에 결합하는 파지를 제거하기 위해 정상 인간 뇌 조직을 대상으로 음성 패닝을 수행하였습니다.

여기에서는 1회의 음성 팬닝(negative panning) 후 건강한 조직에 결합하는 파지와 10회의 음성 팬닝 후에는 더 이상 결합하는 파지가 남지 않은 모습이 나타나 있습니다. 잠재적 클론으로부터 파지와 가용성 SCFE를 모두 준비한 후, LS 조직에 대한 특이성을 확인하기 위해 간접 엘라이자(indirect Eliza) 테스트를 수행했습니다. 거의 모든 파지가 건강한 조직보다 LS 조직에 대한 선호도를 보였습니다.

파지의 결합력을 LS 조직과 전두측두엽 치매 또는 FTD 조직과 비교했을 때도 유사한 결과가 얻어졌습니다. 건강한 조직과 FTD 조직 모두에서 LS 조직에 대한 SCFV 결합력을 비교한 결과, 거의 모든 클론에서 다시 한번 LS 조직에 선택적 결합이 나타났습니다. LS 조직에 대한 결합력을 추가로 검증하고, 다른 면역학적 응용 분야에서 어떤 클론이 반응성을 보이는지 확인하기 위해 도트 블롯 면역 분석법을 사용하였습니다.

본 영상에서는 LS 조직에 결합하는 두 개의 클론을 보여줍니다. 이 영상을 시청한 후에는 질병 특이적 표적 단백질에 대응하는 시약을 분리하기 위해 FM 기반의 바이오패닝을 적용하는 방법과, 잠재적인 진단 및 치료 도구로 활용될 수 있는 시약들의 활용법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.