프로브 기반의 실시간 PCR은 마이크로 RNA의 정량 측정을위한 접근 방법

다음 실험의 전반적인 목표는 혈장 및 혈청 샘플에서 마이크로 RNA를 정량화하는 데 사용되는 세 가지 프로브 기반 Real-Time PCR 방법을 시연하는 것입니다. 프로브 기반 Real-Time PCR은 형광 리포터와 담금질제를 포함하는 형광 태그가 지정된 프로브의 가수분해 및 검출에 의해 달성됩니다. 점착성 중합효소가 업스트림 프라이머에서 확장되어 프로브의 5개 프라임 말단에 도달하면 담금질기에서 형광 이미터가 물리적으로 해리됩니다.

다음으로, fluoro four의 단일 분자가 방출되며, 이는 검출기에 기록되고 해당 반응으로 인한 형광 신호의 점진적인 증가로 표시됩니다. 궁극적으로 생성된 PCR 산물의 양은 형광의 증가를 기반으로 측정할 수 있으므로 증폭된 표적 증폭을 정확하게 정량화할 수 있습니다. 이 방법은 다양한 암 및 당뇨병과 같은 기타 질병에 대한 새로운 바이오마커를 발견하기 위한 유망한 방법으로 부상하고 있습니다.

이 방법은 혈청 및 혈장에 있는 microRNA의 풍부함에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 말초 세포 및 조직과 같은 다른 샘플에도 적용할 수 있습니다. 나노 유체 어레이 슬라이드를 밀봉하는 데 관련된 일부 단계는 프로토콜을 읽는 것만으로도 배우기 어려울 수 있으므로 이 프로토콜의 시각적 시연은 매우 중요합니다.프로브 기반 실시간 정량적 PCR 성숙한 마이크로 RNA 검출의 경우 광학 96웰 플레이트의 각 웰에 대한 개별 QPCR 시약 혼합물의 4.2마이크로리터에서, 그 다음, 0.8 마이크로리터의 적절한 새로 준비된 CDNA 반응 용액을 주입한다. 적절한 광학 커버로 플레이트를 밀봉한 다음 Real-Time PCR 시스템에서 QPCR을 시작합니다.

총 RNA 시작 입력이 1-1000 나노그램인 미세유체 어레이 카드를 준비하려면 먼저 풀 A 및 B 프라이머 버퍼, 데옥시 뉴클레오티드 인산염, 염화마그네슘 및 RNA 억제제를 얼음에서 해동합니다. 그런 다음 역전사를 수행하기 위해 각 RNA 샘플의 100나노그램을 풀 A 또는 풀 B 튜브에 분취한 다음 적절한 부피의 뉴클레아제 유리수를 추가하여 각 튜브의 총 부피를 3마이크로리터로 만듭니다. 다음으로, 4.5마이크로리터의 적절한 역전사 시약 혼합물을 적절한 해당 튜브에 분취합니다.

그런 다음 샘플을 thermocycler에 넣고 역전사를 시작합니다. 역 전사가 진행되는 동안. 1에서 350 나노그램 사이의 총 RNA 샘플 입력의 경우, 샘플이 준비되면 얼음 위에서 사전 정의된 사전 증폭 프라이머 풀을 해동하고 적절한 프리앰프 시약 22.5마이크로리터를 분취합니다.

풀 A와 풀 B 튜브에 혼합하고 2.5마이크로리터의 역 전사된 CDNA 샘플을 각각에 추가합니다. 그런 다음 샘플을 thermocycler에 넣고 프리앰프 사이클을 시작합니다. 사이클이 끝나면 75 마이크로 리터의 0.1 x tris EDTA 버퍼를 사전 증폭 된 CDNA에 추가하여 미세 유체 카드를로드합니다.

다음으로, 카드 A에 대해 9마이크로리터의 희석된 PREPL 증폭 CDNA에 450마이크로리터의 QPCR 시약 혼합물을 추가하고, 프라이머 풀 A를 사용하여 준비된 PREPL 증폭 산물을 사용하고, 441마이크로리터의 뉴클레아제 자유수를 최종 부피 900마이크로리터에 추가합니다. 그런 다음 실온에 도달하면 포장에서 tack man 저밀도 어레이 카드를 제거하고 깨끗한 곳에 호일 면이 아래로 향하게 놓습니다. PCR 반응 100마이크로리터를 추가합니다.

카드에 있는 8개의 주입 포트 각각에 섞습니다. 331GS와 실온에서 1분 동안 카드를 돌립니다. 그런 다음 느리고 꾸준하며 균일한 한 번의 스트로크로 실러의 끝점에 도달할 때까지 카드를 가로질러 캐리지를 밉니다.

밀봉된 어레이 카드를 제거하고 저장소를 차단합니다. 그런 다음 올바른 블록 가열 뚜껑과 샘플 캐리어가 미세유체 어레이 realtime PCR 시스템에 설치되어 있는지 확인합니다. 나노 유체 어레이를 로드하려면 희석된 prepl, 증폭된 cDNA 및 tack man 실시간 QPCR 시약을 해동합니다.

소용돌이치면서 QPCR 시약 병을 혼합하고 혼합합니다. 다음으로, 22.5 μl의 QPCR 시약 혼합물을 22.5 μl의 희석된 prepl, 증폭된 cDNA에 추가합니다. 그런 다음 각 샘플의 풀 A와 풀 B를 배치하도록 주의하면서 각 샘플의 나노 유체 어레이 워크플로우 384 웰 샘플 플레이트의 8개 웰에 각 샘플을 5마이크로리터씩 추가합니다.

모든 샘플이 이송된 후 인접한 8개의 웰 블록에서 플레이트의 각 섹션을 개방형 어레이 샘플 플레이트 씰러 조각으로 덮습니다. 그런 다음 약 15분 후에 첫 번째 나노 유체 어레이 슬라이드를 실온으로 해동합니다. 나노 유체 어레이 시스템에 올바른 블록 편집 뚜껑과 샘플 캐리어가 설치되어 있는지 확인한 다음 침지 유체 주사기의 플런저를 부드럽게 당겨 풉니다.

캡을 제거하고 팁을 제자리에 놓고 팁에서 공기를 씻어냅니다. 그런 다음 로딩 시스템 팁을 로딩 시스템 내에 놓습니다. 뚜껑을 열고 샘플 플레이트를 로딩 시스템에 넣습니다.

이제 꼭 맞는 장갑을 끼십시오. 슬라이드 포장을 조심스럽게 열고 상단을 건드리지 않고 패키지에서 슬라이드를 천천히 기울여 빼냅니다. 바코드가 왼쪽에 오도록 슬라이드를 적재 시스템에 놓습니다.

그런 다음 적재용 샘플 플레이트 부분에서 실러를 제거하고 로딩 시스템 소프트웨어를 사용하여 슬라이드 바코드 슬라이드 위치, 샘플 위치 및 팁 구성을 입력합니다. 슬라이드가 로드되는 동안 슬라이드 뚜껑 바닥에서 투명하고 빨간색 플라스틱을 제거합니다. 그런 다음 적재 과정이 끝난 후 90초 이내에 슬라이드를 조심스럽게 제거하고 밀봉합니다.

플레이트 cl 내에 슬라이드를 놓습니다.amp 및 슬라이드 덮개를 슬라이드에 30초 동안 올려 놓고 바코드가 올바르게 표시되도록 덮개가 배치되었는지 확인합니다. 그런 다음 팁이 뚜껑을 누르도록 슬라이드 내에 침지 주사기를 놓고 액체가 뚜껑을 따라 흐르도록 주의하면서 슬라이드에 침지 유체를 천천히 채웁니다. 슬라이드가 가득 차면 플러그로 밀봉하고 핸들이 부러질 때까지 나사를 돌립니다.

마지막으로 슬라이드 뚜껑 상단의 플라스틱 덮개를 제거하고 슬라이드를 Real-Time PCR 시스템의 슬라이드 캐리어에 조심스럽게 넣습니다. 슬라이드 상단을 건드리지 않고 슬라이드 하단을 내릴 때 지지하도록 주의하십시오. 그런 다음 PCR 시스템을 초기화하고 샘플을 로드한 후 1시간 이내에 정량적 PCR 프로그램을 시작합니다.

이 절차를 사용하면 5마이크로리터의 반응 부피가 강한 상관 관계를 가진 20마이크로리터 부피를 사용하여 얻은 것과 유사한 결과를 생성할 수 있습니다. 여기에서 최대 39 사이클까지, 미세유체 어레이 카드를 사용하여 동일한 샘플에서 테스트한 모든 754 마이크로 RN에 대해 부드러운 Altman 및 상관 도표가 표시되며, 두 트레일에서 CT 값이 0에서 19.99 사이인 microRNA도 98%의 결정 계수로 유사한 발현을 나타냅니다.또한, 30에서 40 사이의 CT 값을 선택할 때 시험 간에 관찰된 상당한 차이를 가진 microRNA의 수가 증가합니다. 이 그래프에는 모든 754개의 microRNA에 대한 나노 유체 어레이 플랫폼 데이터가 표시됩니다.

증폭 곡선을 검사하여 결과가 실제 증폭을 나타내는지 확인하는 것이 중요합니다. U six와 같은 하우스키핑 microRNA도 가변성을 검사해야 합니다. 예를 들어, 이 그래프에서는 낮은 표준 편차를 나타내는 U 6 반복의 일반적인 클러스터링이 표시되어 데이터의 신뢰성을 나타냅니다.

마지막으로, 이러한 데이터는 두 번째 샘플에서 U 6회 반복의 변동성 증가를 보여줍니다. 미세유체역학(microfluidics) 및 나나(Nana) 유체 어레이와 같은 고처리량 프로브 기반 기술은 매우 짧은 시간에 많은 수의 시료에서 여러 microRNA의 풍부함을 재현성 있고 효율적으로 검출할 수 있는 용이성을 제공합니다. 각 워크플로우는 microRNA 타겟의 수와 분석할 샘플의 수에 따라 서로 다른 처리량을 충족하도록 설계되었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 마이크로 NA 풍부도를 전공하기 위해 다양한 프로브 기반 real time PCR 기술을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.