Name: 프로브 기반의 실시간 PCR은 마이크로 RNA의 정량 측정을위한 접근 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: 학습하세요 프로브 기반 실시간 PCR을 활용한 혈장 및 혈청 샘플의 microRNA 정량 분석 방법입니다. 이 기술은 암과 당뇨병 등 다양한 질환의 새로운 바이오마커 발굴에 유용합니다.

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모든 저자는 NHMRC CTC, 시드니, 청소년 당뇨병 연구 재단 (JDRF), 호주의 대학과 레베카 쿠퍼 재단, 호주에서 인프라 지원을 인정합니다. 이 연구는 WW, RJF을 아하기 위해 호주 연구 협의회 (FT110100254)와 JDRF, 호주 (CRN201314)에서 보조금을 통해 자금을 지원하고 MVJ 모든 젖은 실험실 실험을 실시, ASJ 데이터 분석을 수행 하였다. WW는 첫 번째 초안을 썼다. AAH는 연구를 계획하고 데이터를 분석했다. 모든 저자 읽고 게시를 위해 제출 된 원고, 그림 및 워크 시트의 최종 버전에 동의했다.

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제 처리 / 출판 비용은 출판이 원고의 수락 다음, Life 기술이 적용되었다.

정확하고 재현성있는 결과를 얻기 위해 프로브 기반 qPCR의 프로토콜 내에서 중요한 단계는 RT-제품의 동일한 부피 및 농도는 각각 qPCR의 반응에로드되어) 있는지 일을한다, 2) 성분의 정확한 비율 및 볼륨에 필요한 qPCR의 반응은 제조 및 음, 3) 정확하고 일관된 볼륨 각각 qPCR의 반응에 첨가 혼합하고, 여전히 염두하면서 4) 각 샘플과 반응 혼합물의 제조 및 로딩, 가능한 한 짧은 시간에 완료된다 위의 중요한 단계는 앞에서 언급. 마이크로 유체 배열 카드는 적합한 원심 분리기 및 특정 버킷이 필요합니다. 각 버킷은 3 카드 (로드 / 빈)까지 저장할 수 있습니다. 항상 양동이의 3 슬롯을 점유하고 버킷 원심 분리기의 반대 슬롯에 비슷한 버킷 (이 양동이는 빈 또는 전체 중 3 카드를 포함한다) 배치로 균형되어 있는지 확인합니다. bucke에 카드를 배치하는 동안t 홀더, 8 저수지 위쪽으로 돌출 반응 우물이 원심 분리기의 외부 벽에 직면해야합니다. 실온에서 1 분 동안 331 XG에 카드 스핀. 제 1 스핀 후, 원심 분리기를 열고 시각적 반응 혼합물은 384 웰을 통해 분배 된 보장. 1 시간을 더 동일한 설정에서 스핀을 반복합니다. 양동이에서 카드를 제거하고 8 저수지의 각각에 반응 혼합물의 수준이 균일 있는지 확인하십시오. 저수지에 남아있는 액체 볼륨의 모든 불일치는 더 사용할 카드가 부적절합니다. RT-생성물의 동일한 농도가, 동일한 입력 RNA의 농도는 각각의 RT 반응에 첨가된다. 전체 RNA의 농도는 마이크로 volumespectrophotometer를 사용하여 측정된다. 260/280 비율이 관찰 혈장 / 혈청으로부터 분리 RNA 1.3 정도로 낮을 수있다; 다운 스트림 qPCR에 관련 프로세스 나 데이터 (30)를 생성에이 효과가 나타나지 않습니다. 마찬가지로, 260/280의 비율여기에 테스트 RNA 샘플을 관찰 qPCR에에서 더 이상 효과를 1.3 ~ 1.7 사이에 있었다. 이러한 biofluids시 그러한 낮은 함량 RNA 샘플을 사용할 때, 처리에 앞서 RNA을 정량화하기 어렵다. 우리는 RNA 분리에서 합성 스파이크에서의 사용뿐만 아니라, 역전사 단계가 추천. 우리의 경험, 애기 장대의 miRNA 후보 (ATH-은 miR-159A와 ATH-은 miR-172A)에서 우리의 경험에 더있을 수 있습니다 (예 : CEL-은 miR-39 또는 CEL-은 miR-54) 예쁜 꼬마 선충의 miRNA가 선호된다 A.에서보다 동성 장대. 이러한 특정 스테이지에서 스파이크의 사용은 서로 다른 시간에 복수의 샘플 분석 miRNA에 걸쳐 데이터의 정규화를 설명 할 수있다. cDNA 합성 반응에 고정 된 RNA의 양을 입력하여도 32, 33을 권장한다. miRNA의 정량화를위한​​ 세 가지 프로브 기반 프로토콜은 여기에 설명 된 다양한 양을 필요로총 RNA 입력, 다른 워크 플로우 및 비용. 워크 플로우의 각 miRNA의 타겟의 수와 분석 할 샘플의 수에 따라 서로 다른 스루풋에 맞추도록 설계된다. 처리량이 증가 (384 RXN 3072 RXN RXN 96)을, 반응 당 비용은 단위 시간에 걸쳐 얻어진 데이터의 양이 증가함에 따라 감소한다. 이러한 플랫폼 모두의 TaqMan 화학을 이용하기 때문에, 얻어진 데이터의 품질이 유사 할 것으로 예상 할 수있다. 의 TaqMan qPCR에 혈청 / 혈장 9,11,27에서의 miRNA의 풍부를 식별하기위한 잘 확립 된 방법이다. 여기서 설명하는 세 가지 플랫폼이 동일한 화학을 공유하지만, 반응 부피의 감소는 전 사체의 동적 검출 범위의 감소 (파르 RJ 외., 미발표)로 이끈다. 96 웰 qPCR의 플랫폼은 낮은 처리량,하지만 고감도 플랫폼이며, 우리의 관점에서, 모든 프로브 기반 (또는 기반 염료) PCR 플랫폼의 &quot;황금 표준&quot;. 그러나,이 월샘플의 수백 또는 수천 분석 및 여러 마이크로 RNA에 대한되는 경우 가장 경제적 또는 효율적인 플랫폼을 수 없습니다. 미세 유체 (TLDA)과 nanofluidics은 (OA) 플랫폼은 짧은 시간에 큰 데이터의 수집을 할 수 있도록 설계 높은 처리량 / 콘텐츠 플랫폼이다. 일괄 차이 TLDA 카드에서 관찰되었지만,이 같은 배치에서 TLDA 카드를 요청함으로써 최소화 될 수있다. 낮은 풍요의 miRNA를 TLDA 카드의 다른 배치에 동일한 샘플을 사용하여 테스트 할 때 - 우리는 TLDA 플랫폼 (그림 3) 중간의 17 %에 상당한 변화를 보여 주었다 관찰합니다. 따라서 우리는 TLDA 카드를 사용하여 분석을 위해 동일한 배치 번호를 사용하는 것이 좋습니다. 이 변화는 또한 잠재적 인로드 및 피펫 오류를 포함하여 기술 변화로 인해 수 있습니다. 그러나, 우리는 TLDA 카드의 동일한 배치를 요청 / 주문을 추천합니다. 유의 배치 변화는 OA 플랫폼에서 관찰되지 않았다. 그럼에도 불구하고,의 TaqMan experimen을 기반으로탈 qPCR의 혈장 / 혈청에서의 miRNA의 풍부를 측정하기 위해 제공 쉽게 접근한다. 여기서 설명 낮은, 중간 및 높은 처리량 접근법은 고도로 효율적이고 재현하고 깨끗한 (낮은 배경 잡음) 화학 제를 사용하여 샘​​플의 miRNAs의 범위를 분석 할 수있는 유연성을 제공한다.

마이크로 RNA (miRNA가)는 유전자 발현 1-3 조정기로서 기능 ~ 22 뉴클레오티드 비 코딩 (NC)의 RNA. 동물의 대부분의 miRNA는 유전자 발현 2-4의 부정적인 규제에 이르게 3 &#39;UTR을 대상으로, mRNA의 DNA 서열의 특정 염기 쌍을 통해 작동합니다. 이것은 일반적으로 mRNA의 번역의 억제를 통해 또는 리보솜 드롭 오프에 의해 발생합니다. 순환의 miRNAs는 당뇨병 5-7, 8, 난소, 전립선 및 유방암 구 (10,11), (12) B 형 간염 및 다른자가 면역 질환과 같은 질병 (13)의 다양한 연구 및 임상 분야에서 새로운 바이오 마커 인 것으로 밝혀졌다. 연구는 더 접근하고 9,11-15 덜 침습적 인 인간 혈장 및 혈청에서 순환뿐만 아니라 다른 세포 또는 조직에서의 miRNA 풍부한를 식별하기 위해 실시되었다. miRNA의 정량화의 다른 방법은 전자되었습니다이러한 표준 96 웰 플레이트 플랫폼 4,12,16-18, 마이크로 유체 카드 플랫폼 12,18-23과 nanofluidics 어레이 플랫폼 17,24 등 여러 플랫폼을 사용하여에 stablished. 정량 실시간 PCR (qPCR에)는 여러 (염료 - 또는 프로브 기반) 화학 물질을 사용하여 성적의 상대 또는 절대 숫자를 측정 할 수있는 기능을 제공합니다. 프로브 기반 실시간 PCR 화학은 단일 전 사체를 검출하기 위해 복사본 낮은 배경 형광 및 높은 감도의 장점을 제공한다. 그것은 상대적으로 정량화 된 miRNA 발현 (25)를 결정하는 그것을 선호하는 방법을, 효과적인 사용이 간단하고 재현성이 높은 비용이다. 전사 (RT) 및 qPCR에 4,26,27 역 : 프로브 기반 qPCR의 방법은 일반적으로 두 단계를 포함한다. 줄기 루프 RT 프라이머 성숙한 또는 기본 miRNA의 분자에 하이브리드 및 보완 (C) DNA로 변환되는 경우 RT이다. cDNA의 생성물의 정량은 miRNA에 특이 PCR 프라이머를 사용하여 수행26 ~ 28. 프로브 기반 qPCR에의 원리는 형광 표지 된 프로브의 가수 분해를 포함 실시간으로 보완 가닥 확장의 검출을 기반으로합니다. 이 프로브는 형광 기자와 FRET (형광 공명 에너지 전송)을 할 수 있도록 단지 떨어져있는 거​​제를 포함하도록 설계되었습니다. 형광 기자 (에미 터)에서 방출의 검출은 소광 분자의 근접에 의해 마스크 처리됩니다. 을 Taq 폴리머 라제 (POL)가 상류 프라이머로부터 연장 및 포크 (프로브의 5 &#39;말단)에 도달 할 때의 Taq의 POL 엑소 뉴 클레아 제 활성은 소광에서 형광 방출의 물리적 분리 / 분리 선도, 프로브 가수 분해한다. 형광 터의 단일 분자의 릴리스는 검출기에 의해 기록이 아니라 / 반응에서 형광 신호의 증분 증가로 제시됩니다. 형광의 증가는 정확한 숨어 있도록, 생성 된 PCR 산물의 양에 비례증폭 된 대상 (26, 28)의 antification. 정량화 된 miRNA의 수요 증가, 높은 처리량에 기술 매체는 더 많은 샘플을 짧은 시간 안에 처리 할 수​​ 있도록 개발되었다. 저밀도의 TaqMan 어레이 (TLDA)은 하나의 플레이트에서 분석의 miRNA의 수의 증가를 제공하고 프로브 기반 qPCR의 화학에 기초하여 중간 처리량 마이크로 유체 혁신적인 디자인이다. TLDA는 cDNA의 합성에 사용되는 프라이머를 RT-소정 풀의 사용을 포함한다. 이러한 cDNA를 다음의 qPCR 22,26,29을 사용하여 여러 miRNAs의 발현을 결정하기 위해 사용자 정의 된 384 웰 미세 유체 카드에 방사된다. 카드의 각 웰 따라서 단일 TLDA 카드 (26)에서 처리 될 수있다 (384)의 반응까지, 특정의 miRNA (들)을 증폭하는 프라이머 및 프로브를 포함 건조. nanofluidics 어레이 유전자 전 사체의 검출을 위해 사용되는 높은 처리량 플랫폼 <sup&gt; 24 같은 프로브 기반 화학 제를 사용하여. 이 관통 구멍 스테인리스 슬라이드 (24)에 3,072의 배열로 33 나노 리터 반응 혼합물의 쉽게 로딩을 용이하게하기 위해 소수성 - 친수성 상호 작용을 제공하는 고유 행렬을 이용한다. 이 문서에서는 혈청 / 플라즈마에서의 miRNA를 정량화 이러한 방법이 수행하고 수행하고 이러한 데이터를 해석 할 때 고려해야 할 중요한 요소 방법을 시연에 초점을 맞추고 있습니다. 계정으로 연결, 개별 장점과 한계는이 문서에서 논의 될 것이다.

<table><tbody><tr><td>96 웰-플랫폼</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>역전사용</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA 어세이 INV SM&nbsp;</td><td>응용 바이오시스템 &nbsp;</td><td>4427975</td><td>https://www.lifetechnologies.com/au/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-assays/mirna-ncrna-taqman-assays/single-tube-mirna-taqman-assays.html?ICID=search-4427975 분석은 RT 프라이머와 PCR 프라이머 팩으로 제공됩니다.</td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA 역전사 키트</td><td>Applied Biosystems &nbsp;</td><td>4366597 또는 4366596</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366597?ICID=search-4366597 또는 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366596?ICID=search-4366596 TaqMan MicroRNA 역전사 키트는 96웰 플랫폼, TLDA 및 OpenArray의 세 가지 모두에서 역전사에 사용되는 것과 동일한 키트입니다.</td></tr><tr><td>96-well 플랫폼에서</td><td></td><td></td><td></td>실행되는 qPCR의</tr><tr><td>경우, 2x TaqMan Fast Universal PCR Master Mix, AmpErase UNG&nbsp;</td><td>응용 바이오시스템 &nbsp;</td><td>4367846</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4367846?ICID=search-4367846 2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix는 qPCR에 사용됩니다. 두 가지 TaqMan 플랫폼(96-well 플랫폼 및 TLDA).</td></tr><tr><td>MicroAmp 광학 접착 필름</td><td>적용 Biosystems</td><td>4311971</td><td></td></tr><tr><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4311971?ICID=search-product MicroAmp Fast Optical 96-Well 반응 플레이트, 0.1 ml&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4346907</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4346907?ICID=search-product</td></tr><tr><td>Microfluidics platform (TLDA)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>역전사</td><td></td><td></td><td></td>의 경우</tr><tr><td>96-well 플랫폼 TaqMan MicroRNA 역전사 키트 키트(4366597 또는 4366596)를 참조하십시오(위 그림 참조).</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1</td><td>Applied Biosystems &nbsp;</td><td>4399966</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399966?ICID=search-4399966 Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1은 RT에 사용됩니다. 두 가지 TaqMan 플랫폼인 TLDA 및 OpenArray.</td></tr><tr><td>Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0</td><td>Applied Biosystems &nbsp;</td><td>4444281</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444281?ICID=search-4444281 Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0은 RT on&nbsp; 두 가지 TaqMan 플랫폼인 TLDA 및 OpenArray.</td></tr><tr><td>OR</td><td></td><td></td><td>OR</td></tr><tr><td>Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0</td><td>Applied Biosystems &nbsp;</td><td>4444750</td><td>http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444750?ICID=search-4444750 Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0은 RT에 사용됩니다. 두 가지 TaqMan 플랫폼인 TLDA 및 OpenArray.</td></tr><tr><td>사전 증폭</td><td></td><td></td><td></td>용</tr><tr><td>TaqMan PreAmp Master Mix</td><td>Applied Biosystems &nbsp;</td><td>4391128 또는 4488593</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4391128?ICID=search-4391128 또는 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4488593 TaqMan PreAmp Master Mix는 qPCR의 사전 증폭에 사용됩니다. 두 가지 TaqMan 플랫폼인 TLDA 및 OpenArray.</td></tr><tr><td>메가플렉스 프리앰프 프라이머, 휴먼 풀 B v3.0&nbsp;</td><td>응용 바이오시스템 &nbsp;</td><td>4444303</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444303?ICID=search-4444303 Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0은 qPCR의 사전 증폭에 사용됩니다. 두 가지 TaqMan 플랫폼인 TLDA 및 OpenArray.</td></tr><tr><td>Megaplex PreAmp 입문서, Human Pool A v2.1</td><td>Applied Biosystems &nbsp;</td><td>4399233</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399233?ICID=search-4399233 Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1은 qPCR의 사전 증폭에 사용됩니다. 두 가지 TaqMan 플랫폼인 TLDA 및 OpenArray.</td></tr><tr><td>TE 버퍼 1개(100ml)</td><td>Invitrogen</td><td>12090-015</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/12090015?ICID=search-product 1x TE Buffer는 qPCR의 사전 증폭에 사용됩니다. 두 가지 TaqMan 플랫폼인 TLDA 및 OpenArray.</td></tr><tr><td>384 웰 미세유체역학 (TLDA) 카드를</td><td></td><td></td><td></td>로드하고 실행하려면</tr><tr><td>TaqMan Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4444913</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444913</td></tr><tr><td>Nanofluidics platform (OpenArray)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>역전사</td><td></td><td></td><td></td>의 경우</tr><tr><td>96웰 플랫폼 TaqMan MicroRNA 역전사 키트 키트(4366597 또는 4366596)를 참조하십시오(위 그림 참조).</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>사전 증폭</td><td></td><td></td><td></td>의 경우</tr><tr><td>TLDA 사전 증폭 시약(위 그림 참조)슬라이드</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>로드 및 실행</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaqMan OpenArray Human MicroRNA Panel, QuantStudio 12K Flex(1 패널)</td><td>Applied Biosystems &nbsp;</td><td>4470187</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4470187?ICID=search-4470187</td></tr><tr><td>QuantStudio 12K Flex OpenArray 액세서리 키트&nbsp;</td><td>응용 바이오시스템 &nbsp;</td><td>4469576</td><td></td></tr><tr><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4469576?ICID=search-4469576 OpenArray 384웰 샘플 플레이트&nbsp; &nbsp;</td><td>응용 바이오시스템 &nbsp;</td><td>4406947</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4406947?ICID=search-4406947</td></tr><tr><td>TaqMan OpenArray Real-Time PCR 마스터 믹스</td><td>Applied Biosystems &nbsp;</td><td>4462159</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4462159?ICID=search-4462159</td></tr><tr><td>OpenArray AccuFill 시스템 팁&nbsp;</td><td>응용 바이오시스템 &nbsp;</td><td>4457246</td><td></td></tr><tr><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4457246?ICID=search-4457246 기타</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>뉴클레아제 프리 워터</td><td>Qiagen</td><td>129117</td><td>http://www.qiagen.com/products/catalog/lab-essentials-and-accessories/nuclease-free-water</td></tr></tbody></table>

프로브 기반의 실시간 pcr은 마이크로 rna의 정량 측정을위한 접근 방법

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

이 정확하고 재현성있는 분석을 제공 가장 민감한 검출 방법 중 하나이기 때문에 프로브 계 정량적 PCR (qPCR에)는, 전 사체 존재비를 측정하는 선호 방법이다. 프로브 기반 화학 다른 (염료 기반) 화학에 비해 최소한의 배경 형광을 제공합니다. 현재, 성적 증명서 풍부을 정량하는 그 사용 프로브 기반 화학 사용할 수있는 여러 가지 플랫폼이 있습니다. 96 웰 플레이트 (96) 그러나 qPCR에 샘플 또는 miRNA에 단지 최대 하나의 실행이 시험 될 수있는 가장 통상적으로 사용되는 방법이다. 샘플들의 다수 / miRNA가 분석되어야한다면 이는 시간 소모적이고 지루한 작업이다. 이러한 미세 유체 (예를 들면의 TaqMan 어레이 카드) 및 nanofluidics 배열 (예 : OpenArray) 제공 용이성 높은 처리량 프로브 기반 플랫폼은 재현하고 효율적으로 짧은 시간에 많은 수의 샘플에서 여러 마이크로 RNA의 풍요 로움을 감지한다. 여기서 우리는 실험 설정을 보여차 처리량의 증가 수준을 제공하는 프로브 기반 화학, 세 가지 서로 다른 플랫폼 (96 웰 플레이트, 미세 유체 및 nanofluidics 배열)를 사용하여 혈청 또는 혈장-EDTA 샘플에서 miRNA의 정량을위한 프로토콜입니다.

miRNA의 프로브 기반 분석 qPCR의 반응에 권장되는 볼륨은 20 μL이다. 참고 : 5 μL의 반응 부피가 20 μL 부피 4,7,30을 사용하여 달성 된 것과 유사한 결과를 얻을 수 있다는 것을 확인했다. 5 μL로 반응 부피를 낮추면 감도의 상당한 손실없이 시약 비용의 75 % 감소를 허용한다. 그림 2에 제시된 바와 같이, 반응 20 μL의 볼륨과 5 μL 최대 (0.92 R 2, P = 0.0002)와 39 회까지 강력한 협력 관계를 보여줍니다. 마이크로 유체 어레이는 통상적 인 96 개의 웰 플레이트 PCR들에 비해 다수의 샘플을 분석하는 더 효율적인 방법이다 (카드, 카드 B의 경우) 약 5 시간에 시료에서 발현 754 miRNA에 대한 데이터를 획득하기위한 수단을 제공한다. &lt;B는 개성 - 알트 플롯을 (표시 - 우리는 같은 샘플에 대한 miRNA의 마이크로 유체 배열 카드 비교 (샘플 및 반복 샘플)도 3a를.강한&gt; 3A) 및 이들 샘플 테스트를 모든 754의 miRNA에 대한 상관 관계 플롯 (3B). 카드 (카드 A와 B) 여러 위치에서 모두 랜덤하게 배치 된 3 가지 제어 miRNA가 (U6, RNU44 및 RNU48)이 있습니다. U6주기 임계 값 (CT) 값이 2 실행 사이에 비교하면, 우리는 값 (표 4) 사이에 유의 한 차이가 관찰되지 않았다. 그것은 U6는 평가 샘플에서 더 풍부 (낮은 코네티컷 값)에서 표현되는 점에 유의하는 것이 중요하다. 우리는 전체 공동 효율 98 %의 결정 (그림 3C-D)와 miRNA가 유사한 표현했다 런 (N = 150) 모두에서 0-19.99 사이 코네티컷 값이 모두의 miRNA를 비교했다. betwee 상당한 차이가있는 miRNA의 수입니다. - 모두 실행 20과 29.99 사이에 코네티컷 값이있는 모든 277의 miRNAs 중 16 미르는 원래 반복 실행 (F 그림 3E) 사이에 크게 차이코네티컷 값이 모두 실행 (- H 그림 3G)에 대해 30 ~ 40 사이에서 선택했을 때 N 실행은 (327의 89) 증가했다. nanofluidics 어레이 플랫폼은도 4a에 나타낸 바와 같이 테스트 각 혈청 / 혈장 샘플로부터 754 miRNA에 대한 데이터를 제공하며 이러한 증폭 곡선을 검토하는 것이 중요 -. 그것은 모든 qPCR에와 같이 - 결과가 참 증폭 나타내는되도록. (48) 서브 어레이의 각 (그림 1) 또한 세 가지 가장 인기있는 &quot;가사&quot;ncRNAs에 대한 분석이 포함되어 있습니다. U6는 RNU44 및 RNU48도 4b는 U6의 전형적인 클러스터링이 하나의 샘플에서 복제 보여줍니다. 이러한 복제물 낮은 표준 편차 (SD &lt;0.5) 표시 등 안정성의 지표입니다. 대안 적으로,도 4C는 제 2 샘플에서 U6의 복제물 (SD&gt; 0.5)의 변동성이 증가 보여준다. 이 유효성 O를 부정하지 않습니다나머지 분석 f를, 비록 그것은보다 철저한 비판을 필요로한다. U6는 생체 액에서 가장 &quot;가사&quot;의 miRNAs와 같은 변수 표현을 할 수 있습니다. 이것은도 4c에 설명 된 샘플 중 하나는도 4b에 제시된 것 이상 U6 콘텐츠를 4 배 표시 주목해야한다. 도 4c에 제시된 샘플 U6의 레벨이 하나의 패널 (b)에 제시된보다 처음부터 75 % 이하이기 때문에, 큰 기술적 변동은 작은 반응 부피 (17)에 의해 악화된다 사체의 푸 아송 분포로 인해 예상된다. 실행이 완료되면 또 다른 유용한 도구는 수출에 사용할 수있는 품질 관리 (QC) 이미지입니다. 이들의 선택은 각각의 관통 구멍이 올바르게 (도 5)로드되었는지 확인 ROX, qPCR에 시약 믹스 검색된 패시브 염료의 형광을 사용한다. EN 관통 구멍, 또는 실제로<html> 타이어 부분 배열이 불충분 샘플 볼륨, 증발, 384 웰 샘플 플레이트, 완전히 Accufill 시스템 또는 끝에서 샘플 플레이트 씰, 또는 결함을 제거하기 위해 실패의 우물에 존재하는 거품 인해로드되지 않을 수 있습니다. 구멍을 통해 현실의 분석이로드되지 않을 때, &quot;탐지&quot;로 라벨의 miRNA를 방지하기 위해 확인해야하는 모든 언로드. 이런 문제가 발생하면, 샘플 / mastermix의 적어도 5 μL를 384- 웰 샘플 플레이트의 각 웰에로드되었는지 확인, 샘플 플레이트가 적절히 로딩 전에 원심 분리하여, 호일 시일을 완전히 제거하고,로드 OpenArray 슬라이드 밀​​봉 및 모든 연속적인 실행을 위해 할당 된 시간 내에서 실행됩니다. 로딩 문제가 여전히 지속되면, 이러한 가능성이 특정 배치 또는 배열의 많은 또는 관련 소모품 및 추가 지원에 관한 될 수있다 제조 업체를 찾아야한다. &quot;SRC =&quot;/ 파일 / ftp_upload / 52586 / 52586fig1.jpg &quot;/&gt; 그림 1 : Nanofluidics 배열 워크 플로우 샘플의 레이아웃 : (A) 각 384 웰 샘플 플레이트는 최대 8 nanofluidics 배열에 대한 샘플을 보유 할 수 있습니다. (B) 희석은 사전 증폭 된 cDNA를 인접한 8 웰 그룹에 수영장과 풀 B로, 8 우물 (4 행으로 2 열)에 배치됩니다. 각 원은 잘 하나를 나타냅니다. (C) 샘플 플레이트의 각 웰은 nanofluidics 어레이의 하나의 부분 배열에로드한다. 각각의 작은 사각형은 하나의 부분 배열을 나타냅니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig2.jpg" /> 그림 2 : 기존의 96 웰 PCR 플랫폼을위한 협력 관계 분석 : 20 μL와 CT 값 (39주기)의 표준 96 웰 플레이트 플랫폼을 사용의 TaqMan 실시간 qPCR에 5 μL 반응 볼륨 사이의 협력 관계. 우리는 4 개의 마이크로 RNA를 비교 (은 miR-375, 4 다른 인간의 혈청 및 혈장 샘플은 miR-30C 미르-30D 미르-7). 다른 사람들이 발견 할 때부터 만 11 데이터 포인트는 플롯됩니다. R 2 = 0.92, P = 0.0002. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig3.jpg" /> . 그림 3 : (- B) 마이크로 유체 배열 카드를 사용하여 miRNA의 프로파일 링을 순환 2 미세 유체 카드 (카드 및 카드-B)를 사용하여, 754의 miRNA의 프로파일이 생성됩니다. 여기에 도시 된 바와 같이, 우리는 2 미세 유체 배열에 대해 동일한 샘플을 사용은 마이크로 유체 카드 결과의 재현성을 확인하기 위해 실행됩니다. 우리는 0-19.99 사이 코네티컷 값으로, 전체의 miRNAs의 유사한 표현을 관찰 (C - D). 반복 실행 사이의 20-29.99과 유의 한 차이 (- F E) 사이의 코네티컷 값을 몇 가지의 miRNA (277의 16)이있다. (327)의 여든 아홉높은 코네티컷 값이 마이크로 RNA (30 ~ 40)은 모두 실행 (- H G) 사이에 유의 한 차이를 나타냈다. &#160; 데이터가 짝 T 테스트를 사용하여 분석 하였다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52586/52586fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig4.jpg" /> 그림 4 : PCR 제품 증폭 곡선의 대표 프로필 : 인간 혈장 샘플에 대한 모든 miRNA의 대상의 결합 (A) 증폭 곡선의 대표적인 그림입니다. U6에 대한 분석 (공통 제어 ncRNA)는 모든 부분 배열에 배치됩니다. (B)의 샘플은 &lt;(0.5 (C)가 높은 표준 편차 SD)를 보여줍니다 동안 (0.5 낮은 변동성 SD)&gt;을 U6는 복제 내을 보여줍니다. 두 샘플자는 tota 있습니다인간 혈장에서 분리 리터의 RNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52586/52586fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig5.jpg" /> 그림 5 : Nanofluidics 배열의 QC 분석 : 올바르게로드 nanofluidics 배열 (왼쪽)와 잘못 넣었 nanofluidics 배열 (오른쪽)의 품질 관리 (QC) 이미지. (qPCR에 시약 믹스에 존재) 수동 염료, ROX는 올바르게로드 관통 구멍을 나타 내기 위해 형광. 오른쪽에 배열 통공 qPCR의 시약 믹스로드되지 이들은 위음성 PCR 반응으로 식별되어야 몇몇 하위 어레이 / 갖는다. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 구성 요소들 </td><td> 5 μL 반응 당 볼륨 (μL) </td></TR&gt; <tr><td> RT 완충액 (10 배) </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> 의 dNTPs (100 mM의) </td><td> 0.05 </td></tr><tr><td> 의 RNase 억제제 </td><td> 0.6 </td></tr><tr><td> 뉴 클레아없는 물 </td><td> 1.39 </td></tr><tr><td> 역전사 효소 </td><td> 0.33 </td></tr><tr><td> 총 볼륨 </td><td> 2.33 </td></tr></tbody></table> 표 A : 표준 96 웰 플레이트 플랫폼을 사용의 TaqMan 실시간 qPCR에 대한 5 μL RT 반응 준비 RT 시약 믹스 구성 요소. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 구성 요소들 </td><td> 5 μL 반응 당 볼륨 (μL) </td><td> 20 μL 반응 당 볼륨 (μL) </td></tr><tr><td> 고속 PCR의 mastermix (2 배) </td><td> 2.5 </td><td> (10) </td></tr><tr><td> 의 TaqMan qPCR의 분석 (20 배) * </td><td> 0.25 </td><td> (1) </td></tr><tr><td> 뉴 클레아 무료물 </td><td> 1.45 </td><td> 5.8 </td></tr><tr><td> 총 양 : </td><td> 4.2 </td><td> 16.8 </td></tr></tbody></table> * 테스트 선택한 miRNA를 기반​​으로 분석 구성 요소입니다. 표 1B : 표준 96 웰 플레이트 플랫폼을 사용의 TaqMan 실시간 qPCR에 대한 5 또는 20 μL qPCR의 반응 준비 qPCR에 시약 믹스 구성 요소. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 구성 요소들 </td><td> 반응 당 볼륨 (μL) </td></tr><tr><td> Megaplex의 RT 프라이머 (10 배) </td><td> 0.8 </td></tr><tr><td> dTTp (100 mM의)과의 dNTPs </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> Multiscribe 역전사 효소 (50 U / μL) </td><td> 1.5 </td></tr><tr><td> 10 배 RT 버퍼 </td><td> 0.8 </td></tr><tr><td> 의 MgCl 2 (25 mM의) </td><td> 0.9 </td></tr><tr><td> 의 RNase 억제제 &amp; #<html> (160); (20 U / μL) </td><td> 0.1 </td></tr><tr><td> 클레아없는 물 </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> 합계 </td><td> 4.5 </td></tr></tbody></table> 표 2A : TLDA miRNA의 패널 5 μL RT 반응 준비 RT 시약 믹스 구성 요소. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 구성 요소들 </td><td> 반응 당 볼륨 (μL) </td></tr><tr><td> 의 TaqMan 프리 앰프 Mastermix (2 배) </td><td> 12.5 </td></tr><tr><td> Megaplex의 프리 앰프 프라이머 (10 배) </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> 뉴 클레아없는 물 </td><td> 7.5 </td></tr><tr><td> 합계 </td><td> 22.5 </td></tr></tbody></table> 표 2B : TLDA miRNA의 패널 용 25 μL 사전 amplication 반응 준비 프리 앰프 시약 믹스의 구성 요소. &quot;cellspacing =&quot;0 &quot;&gt; <tbody><tr><td> 구성 요소들 </td><td> 반응 당 볼륨 (μL) </td></tr><tr><td> Megaplex의 RT 프라이머 (10 배) </td><td> 0.75 </td></tr><tr><td> dTTp (100 mM의)과의 dNTPs </td><td> 0.15 </td></tr><tr><td> Multiscribe 역전사 효소 (50 U / μL) </td><td> 1.5 </td></tr><tr><td> 10 배 RT 버퍼 </td><td> 0.75 </td></tr><tr><td> 의 MgCl 2 (25 mM의) </td><td> 0.9 </td></tr><tr><td> 의 RNase 억제제 (20 U / μL) </td><td> 0.09 </td></tr><tr><td> 클레아없는 물 </td><td> 0.35 </td></tr><tr><td> 합계 </td><td> 4.5 </td></tr></tbody></table> 표 3A : 프로브 기반 nanofluidics의 miRNA의 패널 5 μL RT 반응 준비 RT 시약 믹스의 구성 요소. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 구성 요소에스 </td><td> 반응 당 볼륨 (μL) </td></tr><tr><td> 의 TaqMan 프리 앰프 Mastermix (2 배) </td><td> 12.5 </td></tr><tr><td> Megaplex의 프리 앰프 프라이머 (10 배) </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> 뉴 클레아없는 물 </td><td> 7.5 </td></tr><tr><td> 합계 </td><td> 22.5 </td></tr></tbody></table> 표 3B :. 프로브 기반 nanofluidics의 miRNA의 패널 25 μL 예비 amplication 반응 제제의 프리 앰프 시약 믹스 성분 NOTE : 쌍방향 보충은, 세 가지 플랫폼이 제공 스프레드 시트 엑셀 이미 에러 피펫 팅을 보상하기 위해 5 %의 첨가를 차지한다. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 샘플 </td><td> 반복 샘플 </td></tr><tr><td> 15.535 </td><td> 16.156 </td></tr><tr><td> 15.471 </td><td> 15.652 </td></tr><tr><td> 15.(623) </td><td> 16.063 </td></tr><tr><td> 15.963 </td><td> 15.889 </td></tr><tr><td> 14.006 </td><td> 13.993 </td></tr><tr><td> 14.502 </td><td> 14.623 </td></tr><tr><td> 14.907 </td><td> 14.384 </td></tr><tr><td> 13.732 </td><td> 14.946 </td></tr></tbody></table> 표 4 : 마이크로 유체 배열 카드를 사용의 miRNA U6 프로파일 링을 순환. 두 개의 마이크로 유체 어레이 카드 (A 및 B)를 사용. 샘플로부터 U6 제어의 miRNA의 CT-값 (총 = 8). 실행 사이에 관찰 일관된 U6 제어 miRNA의 풍부.

순환 마이크로 RNA는 최근 각종 암 및 기타 질환에 대한 유망한 새로운 바이오 마커로 등장했다. 이 문서의 목적은 세 가지 다른 프로브 기반의 실시간 PCR 플랫폼 및 정량화 및 마이크로 RNA 순환의 풍요 로움을 결정하는 데 사용할 수있는 방법을 논의하는 것입니다.

프로브 기반의 실시간 PCR은 마이크로 RNA의 정량 측정을위한 접근 방법

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

다음 실험의 전반적인 목표는 혈장 및 혈청 샘플에서 마이크로 RNA를 정량화하는 데 사용되는 세 가지 프로브 기반 Real-Time PCR 방법을 시연하는 것입니다. 프로브 기반 Real-Time PCR은 형광 리포터와 담금질제를 포함하는 형광 태그가 지정된 프로브의 가수분해 및 검출에 의해 달성됩니다. 점착성 중합효소가 업스트림 프라이머에서 확장되어 프로브의 5개 프라임 말단에 도달하면 담금질기에서 형광 이미터가 물리적으로 해리됩니다.다음으로, fluoro four의 단일 분자가 방출되며, 이는 검출기에 기록되고 해당 반응으로 인한 형광 신호의 점진적인 증가로 표시됩니다. 궁극적으로 생성된 PCR 산물의 양은 형광의 증가를 기반으로 측정할 수 있으므로 증폭된 표적 증폭을 정확하게 정량화할 수 있습니다. 이 방법은 다양한 암 및 당뇨병과 같은 기타 질병에 대한 새로운 바이오마커를 발견하기 위한 유망한 방법으로 부상하고 있습니다.이 방법은 혈청 및 혈장에 있는 microRNA의 풍부함에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 말초 세포 및 조직과 같은 다른 샘플에도 적용할 수 있습니다. 나노 유체 어레이 슬라이드를 밀봉하는 데 관련된 일부 단계는 프로토콜을 읽는 것만으로도 배우기 어려울 수 있으므로 이 프로토콜의 시각적 시연은 매우 중요합니다.프로브 기반 실시간 정량적 PCR 성숙한 마이크로 RNA 검출의 경우 광학 96웰 플레이트의 각 웰에 대한 개별 QPCR 시약 혼합물의 4.2마이크로리터에서, 그 다음, 0.8 마이크로리터의 적절한 새로 준비된 CDNA 반응 용액을 주입한다. 적절한 광학 커버로 플레이트를 밀봉한 다음 Real-Time PCR 시스템에서 QPCR을 시작합니다.총 RNA 시작 입력이 1-1000 나노그램인 미세유체 어레이 카드를 준비하려면 먼저 풀 A 및 B 프라이머 버퍼, 데옥시 뉴클레오티드 인산염, 염화마그네슘 및 RNA 억제제를 얼음에서 해동합니다. 그런 다음 역전사를 수행하기 위해 각 RNA 샘플의 100나노그램을 풀 A 또는 풀 B 튜브에 분취한 다음 적절한 부피의 뉴클레아제 유리수를 추가하여 각 튜브의 총 부피를 3마이크로리터로 만듭니다. 다음으로, 4.5마이크로리터의 적절한 역전사 시약 혼합물을 적절한 해당 튜브에 분취합니다.그런 다음 샘플을 thermocycler에 넣고 역전사를 시작합니다. 역 전사가 진행되는 동안. 1에서 350 나노그램 사이의 총 RNA 샘플 입력의 경우, 샘플이 준비되면 얼음 위에서 사전 정의된 사전 증폭 프라이머 풀을 해동하고 적절한 프리앰프 시약 22.5마이크로리터를 분취합니다.풀 A와 풀 B 튜브에 혼합하고 2.5마이크로리터의 역 전사된 CDNA 샘플을 각각에 추가합니다. 그런 다음 샘플을 thermocycler에 넣고 프리앰프 사이클을 시작합니다. 사이클이 끝나면 75 마이크로 리터의 0.1 x tris EDTA 버퍼를 사전 증폭 된 CDNA에 추가하여 미세 유체 카드를로드합니다.다음으로, 카드 A에 대해 9마이크로리터의 희석된 PREPL 증폭 CDNA에 450마이크로리터의 QPCR 시약 혼합물을 추가하고, 프라이머 풀 A를 사용하여 준비된 PREPL 증폭 산물을 사용하고, 441마이크로리터의 뉴클레아제 자유수를 최종 부피 900마이크로리터에 추가합니다. 그런 다음 실온에 도달하면 포장에서 tack man 저밀도 어레이 카드를 제거하고 깨끗한 곳에 호일 면이 아래로 향하게 놓습니다. PCR 반응 100마이크로리터를 추가합니다.카드에 있는 8개의 주입 포트 각각에 섞습니다. 331GS와 실온에서 1분 동안 카드를 돌립니다. 그런 다음 느리고 꾸준하며 균일한 한 번의 스트로크로 실러의 끝점에 도달할 때까지 카드를 가로질러 캐리지를 밉니다.밀봉된 어레이 카드를 제거하고 저장소를 차단합니다. 그런 다음 올바른 블록 가열 뚜껑과 샘플 캐리어가 미세유체 어레이 realtime PCR 시스템에 설치되어 있는지 확인합니다. 나노 유체 어레이를 로드하려면 희석된 prepl, 증폭된 cDNA 및 tack man 실시간 QPCR 시약을 해동합니다.소용돌이치면서 QPCR 시약 병을 혼합하고 혼합합니다. 다음으로, 22.5 μl의 QPCR 시약 혼합물을 22.5 μl의 희석된 prepl, 증폭된 cDNA에 추가합니다. 그런 다음 각 샘플의 풀 A와 풀 B를 배치하도록 주의하면서 각 샘플의 나노 유체 어레이 워크플로우 384 웰 샘플 플레이트의 8개 웰에 각 샘플을 5마이크로리터씩 추가합니다.모든 샘플이 이송된 후 인접한 8개의 웰 블록에서 플레이트의 각 섹션을 개방형 어레이 샘플 플레이트 씰러 조각으로 덮습니다. 그런 다음 약 15분 후에 첫 번째 나노 유체 어레이 슬라이드를 실온으로 해동합니다. 나노 유체 어레이 시스템에 올바른 블록 편집 뚜껑과 샘플 캐리어가 설치되어 있는지 확인한 다음 침지 유체 주사기의 플런저를 부드럽게 당겨 풉니다.캡을 제거하고 팁을 제자리에 놓고 팁에서 공기를 씻어냅니다. 그런 다음 로딩 시스템 팁을 로딩 시스템 내에 놓습니다. 뚜껑을 열고 샘플 플레이트를 로딩 시스템에 넣습니다.이제 꼭 맞는 장갑을 끼십시오. 슬라이드 포장을 조심스럽게 열고 상단을 건드리지 않고 패키지에서 슬라이드를 천천히 기울여 빼냅니다. 바코드가 왼쪽에 오도록 슬라이드를 적재 시스템에 놓습니다.그런 다음 적재용 샘플 플레이트 부분에서 실러를 제거하고 로딩 시스템 소프트웨어를 사용하여 슬라이드 바코드 슬라이드 위치, 샘플 위치 및 팁 구성을 입력합니다. 슬라이드가 로드되는 동안 슬라이드 뚜껑 바닥에서 투명하고 빨간색 플라스틱을 제거합니다. 그런 다음 적재 과정이 끝난 후 90초 이내에 슬라이드를 조심스럽게 제거하고 밀봉합니다.플레이트 cl 내에 슬라이드를 놓습니다.amp 및 슬라이드 덮개를 슬라이드에 30초 동안 올려 놓고 바코드가 올바르게 표시되도록 덮개가 배치되었는지 확인합니다. 그런 다음 팁이 뚜껑을 누르도록 슬라이드 내에 침지 주사기를 놓고 액체가 뚜껑을 따라 흐르도록 주의하면서 슬라이드에 침지 유체를 천천히 채웁니다. 슬라이드가 가득 차면 플러그로 밀봉하고 핸들이 부러질 때까지 나사를 돌립니다.마지막으로 슬라이드 뚜껑 상단의 플라스틱 덮개를 제거하고 슬라이드를 Real-Time PCR 시스템의 슬라이드 캐리어에 조심스럽게 넣습니다. 슬라이드 상단을 건드리지 않고 슬라이드 하단을 내릴 때 지지하도록 주의하십시오. 그런 다음 PCR 시스템을 초기화하고 샘플을 로드한 후 1시간 이내에 정량적 PCR 프로그램을 시작합니다.이 절차를 사용하면 5마이크로리터의 반응 부피가 강한 상관 관계를 가진 20마이크로리터 부피를 사용하여 얻은 것과 유사한 결과를 생성할 수 있습니다. 여기에서 최대 39 사이클까지, 미세유체 어레이 카드를 사용하여 동일한 샘플에서 테스트한 모든 754 마이크로 RN에 대해 부드러운 Altman 및 상관 도표가 표시되며, 두 트레일에서 CT 값이 0에서 19.99 사이인 microRNA도 98%의 결정 계수로 유사한 발현을 나타냅니다.또한, 30에서 40 사이의 CT 값을 선택할 때 시험 간에 관찰된 상당한 차이를 가진 microRNA의 수가 증가합니다. 이 그래프에는 모든 754개의 microRNA에 대한 나노 유체 어레이 플랫폼 데이터가 표시됩니다.증폭 곡선을 검사하여 결과가 실제 증폭을 나타내는지 확인하는 것이 중요합니다. U six와 같은 하우스키핑 microRNA도 가변성을 검사해야 합니다. 예를 들어, 이 그래프에서는 낮은 표준 편차를 나타내는 U 6 반복의 일반적인 클러스터링이 표시되어 데이터의 신뢰성을 나타냅니다.마지막으로, 이러한 데이터는 두 번째 샘플에서 U 6회 반복의 변동성 증가를 보여줍니다. 미세유체역학(microfluidics) 및 나나(Nana) 유체 어레이와 같은 고처리량 프로브 기반 기술은 매우 짧은 시간에 많은 수의 시료에서 여러 microRNA의 풍부함을 재현성 있고 효율적으로 검출할 수 있는 용이성을 제공합니다. 각 워크플로우는 microRNA 타겟의 수와 분석할 샘플의 수에 따라 서로 다른 처리량을 충족하도록 설계되었습니다.이 비디오를 시청한 후에는 마이크로 NA 풍부도를 전공하기 위해 다양한 프로브 기반 real time PCR 기술을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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연구

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생물학

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