이미징 CA

본 절차의 전체적인 목적은 형광 바이오센서를 사용하여 마우스 망막의 원추광수용체로부터 빛 자극에 의해 유도된 칼슘 신호를 기록하는 것입니다. 이는 원추광수용체에서만 유전적으로 부호화된 칼슘 센서가 발현되는 형질전환 마우스 라인에서 망막을 분리함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 망막 조직을 수직 단면으로 절단하는 것입니다.

다음으로, 망막 절편을 커버슬립에 고정하여 이광자 현미경 아래에 배치합니다. 마지막 단계는 빛 자극에 반응하는 원추광수용기 개별 시냅스 말단의 칼슘 신호를 기록하는 것입니다. 최종적으로, 기록된 칼슘 신호를 오프라인으로 분석합니다.

이 방법을 통해 우리는 여러 옥수수 광수용체의 활성을 세포하 분해능으로 동시에 기록할 수 있습니다. 이는 더 어렵고 시간이 많이 소요되는 전기생리학적 단일 세포 기록과 같은 기존 기술에 비해 갖는 주요한 장점입니다. 따라서 우리가 해결하고자 하는 문제는 칼슘이 광수용체 퇴행에 관여하는지 여부와 그 방식입니다.

이 방법은 칼슘 유입이 광수용기 퇴행을 유도하는지, 아니면 세포 사멸의 결과로 나타나는 현상인지를 판단할 수 있게 해줍니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자들은 망막의 빛 민감성을 유지해야 하기 때문에 어려움을 겪으며, 따라서 망막 박리와 슬라이스 제작을 포함한 모든 섬세한 단계는 적색광 아래에서 수행되어야 합니다. 이 절차를 시작하려면, 쥐의 안구를 신선한 탄산가스가 포화된 세포외 용액이 담긴 페트리 접시로 옮기십시오.

날카로운 주사 바늘을 사용하여 각막과 공막 사이의 경계선을 따라 안구를 찌릅니다. 다음으로, 핀셋으로 공막 부분을 잡고 가위 날 하나를 구멍 속으로 조심스럽게 삽입합니다. 톱니연합(ora serrata)을 따라 절개하여 안구의 앞부분을 안구 컵으로부터 분리합니다.

그 다음, 망막의 배측 위치를 나타내는 펜 표시 지점을 따라 안구 컵을 방사형으로 절개합니다. 그런 다음 배측 절개 부위가 바깥쪽을 향하도록 안구 컵을 배치합니다. 핀셋 팁을 망막과 공막 사이에 삽입하여 안구 컵의 좌우측 공막을 잡습니다.

그 후, iica의 공막 부분을 부드럽게 반전시켜 망막을 분리합니다. 마지막으로 시신경을 절단하여 공막으로부터 망막을 완전히 분리합니다. 핀셋 한 쌍으로 망막의 가장자리를 잡고, 다른 핀셋 한 쌍을 사용하여 망막 표면에서 잔해와 유리체를 조심스럽게 제거합니다.

망막 표면이 깨끗해지면, 3개의 짧은 방사형 절개를 추가로 수행합니다. 이제 유리 슬라이드를 조직 근처의 세포외 용액에 천천히 담급니다. 기계적 손상과 조직 접힘을 줄이기 위해 가장자리를 잡아 신경절 세포층이 위로 오도록 망막을 유리 슬라이드 위로 조심스럽게 끌어올립니다.

다음으로, 곡선형 메스 날을 사용하여 선택한 망막 영역에서 약 1 x 2 mm 크기의 직사각형 조각을 절단하고 조직 주변의 과잉 용액을 닦아냅니다. 그런 다음, 신경절 세포 측이 막에 부착되도록 미리 준비한 니트로셀룰로오스 섬유 막을 망막 조각 위에 올립니다. 즉시 막 위에 세포외 배지를 한 방울 떨어뜨려 조직이 막에 단단히 부착되도록 합니다.

막에 고정된 망막 조직을 신선한 세포외 용액이 들어 있는 절편 챔버로 옮깁니다. 그 다음 망막을 200 µm 두께의 수직 절편으로 자릅니다. 조직 절단기를 사용하여, 고진공 그리스로 미리 준비된 유리 커버 슬립에 막에 고정된 절편 하나를 접착합니다.

유리 표면을 망막 아래에 유지하고 기름기가 없도록 하십시오. 그 후, 상온의 홀딩 챔버에 장착된 각 커버슬립 슬라이스에 세포외 용액 한 방울을 추가합니다. 작은 물 저장조에 버블링하여 카보젠을 챔버에 도입함으로써 홀딩 챔버 내의 분위기를 습윤하게 유지하십시오.

슬라이스를 기록 챔버로 하나씩 옮기기 전, 유지 챔버에서 10~15분 동안 안정시킵니다. 유지 챔버에서 기록 챔버로 슬라이스를 옮긴 후 즉시 탄산화된 세포외 용액으로 관류를 시작합니다. 관류 유속은 2 mL/min, 온도는 37 °C로 유지합니다.

기록 챔버 내에서 수행합니다. 20 x 0.95 NA 수침 렌즈와 CCD 카메라를 기록 챔버 아래의 적외선 LED와 함께 사용하십시오. 망막 절편의 위치를 찾으려면 제조업체의 지침에 따라 이광자 이미징 시스템을 작동시키십시오.

다음으로, 레이저를 켜고 860 nanometers로 설정하십시오. ECFP 및 citrine의 형광 이미징을 위해 두 개의 검출 채널을 켭니다. 이어서, 이미지 획득 소프트웨어를 사용하여 이광자 현미경을 제어해 기록할 원추세포 말단(cone terminals) 행을 스캔하고 선택하십시오. 이미지 획득 설정을 128 by 16 픽셀 이미지 또는 이와 유사한 구성으로 설정하고, 외절(outer segments) 내 광색소의 표백을 방지하기 위해 스캔 영역을 원추세포 말단으로 제한하십시오.

레이저를 켭니다. 빛 자극을 제시하거나 약물을 처리하기 전, 원추세포가 스캐닝 레이저와 자극 배경광에 적응할 수 있도록 20~30초 동안 기다립니다. 이제 임의의 자극 제시를 시작합니다.

전용 소프트웨어로 제어되는 마이크로프로세서 보드를 사용하여 두 LED의 강도를 시간에 따라 조절함으로써 자극을 생성합니다. 그런 다음 각 영상 획득 소프트웨어를 사용하여 두 형광 채널을 동시에 기록하기 시작합니다. 기록은 망막 절편 내 원추 광수용기의 시냅스 말단에 집중하여 수행되었습니다.

이것은 7개의 개별 터미널이 있는 기록된 영역의 예시입니다. 형광은 두 개의 채널을 사용하여 기록되었으며, 하나는 fre scepter citrine용이고 다른 하나는 fret donor.ECFP용입니다. 여기 제시된 것은 단일 관심 영역에서 기록된 citrine 및 ECFP 형광의 빛 유발 변화입니다.

다음은 5초 간격으로 가해진 일련의 1초간 밝은 빛 자극에 대한 원뿔세포 말단의 칼슘 반응입니다. 이 수치는 빛에 의해 유도된 원뿔세포 칼슘 반응의 전형적인 정량 분석 결과를 보여줍니다. 그리고 여기 단일 원뿔세포 말단에서 측정된 빛 유도 칼슘 반응이 있습니다.

이 그림은 평균 칼슘 반응의 결정 과정을 보여줍니다. 정지 칼슘 수준은 빛 자극 이전의 기저 상태를 나타내며, 반응 크기는 정지 칼슘 수준과 피크 진폭 사이, 그리고 반응 시작과 종료의 역학 사이의 면적인 ra로 정의됩니다. 이 절차는 추가로 확장될 수 있습니다.

예를 들어, 적응 과정을 조사하거나 광전환의 다양한 단계들을 상세히 연구하기 위해, 다양한 약리학적 조건 및 강력한 자극 조건 하에서 광수용기의 칼슘 신호가 주요하게 나타날 수 있습니다. 본 기술을 통해 정상적인 생리학적 조건에서 원추광수용기의 칼슘 동역학을 조사할 수 있습니다. 이는 특히 망막색소변성증(retinitis pigmentosa)이나 원추-막대세포이영양증(achromatopsia)과 같은 인간의 실명 질환에서 나타나는 일차 및 이차 원추광수용기 퇴행을 이해하는 데 매우 중요합니다.