Name: 관통 마이크로 전극 배열을 펼친 해마 준비에 신경 활동 전파 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: 배우세요 쥐 해마를 펼쳐 관통 마이크로 전극 배열에 배치하여 전체 구조에서 신경 활동을 동시에 기록하는 방법을. 이 기술은 해마 기능 연구에 새로운 통찰을 제공합니다.

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이 연구는 미국 국립보건원(National Institute of Neurological Disorders and Stroke) 보조금 1R01NS060757-01과 Dominique M. Durand에게 수여된 E.L. Lindseth 기부 의장의 지원을 받았습니다. OCT 이미징에 도움을 주신 Andrew M. Rollins 박사의 실험실에 감사드립니다.

참고 : 동물 실험 프로토콜을 검토하고 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. P20에 P10의 나이에 하나의 섹스 CD1 마우스는이 연구에 사용됩니다. 수술 및 실험 녹화 1. 솔루션 <ol><li> 염화나트륨 (124)의 KCl 3.75, KH 2 PO4 1.25, 황산 2의 NaHCO3 (26), 포도당 (10), 및 CaCl2를 2 : (MM)를 포함하는 일반 인공 뇌척수액 (ACSF) 버퍼를 준비합니다. 실험의 처음에 세척 시스템뿐만 아니라, 박리 후의 조직이 정상 복구 ACSF 사용. </li><li> 해마 해부하는 동안 사용 과달 자당 ACSF 준비 (MM) : 자당 (220)의 KCl 2.95,의 NaH 2 PO 4 1.3, 황산 2의 NaHCO3 (26), 포도당 (10), 및 염화칼슘 2 2. 그대로 해마 조직 준비 간질 활성을 유도하기 위해, 정상인 ACSF에 4- 아미노 피리딘 (4-AP)를 추가100 μM의 농도. </li></ol> 본래 해마 준비 2. 수술 <ol><li> 건조기 유리 항아리 (특정 재료 및 장비 1 위)의 하단에있는 챔버로 이소 플루 란 (1 ml)에 드롭하고 동물과 접촉하지 않도록 하단부의 표면을 커버하기 위해 정기적 종이 타월을 사용하여 액체. 그런 다음, 항아리에 CD1 마우스를 넣고 뚜껑을 닫습니다. 약 1 분 ~ 2 분 동안 닫힌 항아리에 동물을 유지합니다. 숨 주파수가 약 1 초 당을 때, 항아리에서 마우스를 제거합니다. </li><li> 수술 단계에 마우스를 올려 놓고 적절한 가위로 목을 베다. 즉시 참수 한 후, 약 30 초 동안 얼음처럼 차가운 (3-4 ° C에서)로 머리, 산소 자당 ACSF을 배치합니다. </li><li> 두개골의 상단에있는 피부를 제거하고 템포에 가까운 두 끝에서뿐만 아니라 머리의 중간 선을 따라 두개골을 잘라 미세 가위 (특정 재료 및 장비에 5 호)를 사용하여RAL 로브. 사용 포셉 (특정 재료 및 장비에 번호 6) 뇌를 노출하기 위해 머리의 양쪽으로 절단 된 두개골을 벗겨합니다. </li><li> 조심스럽게 두개골의 바닥에서 머리를 떼어 다음에 그것을 드롭 뇌와 두개골의 두정엽 사이의 간격에 마이크로 랩 주걱 (특정 재료 및 장비에 8 번)를 삽입 준비된 얼음처럼 차가운 (3 특정 재료 및 장비)에 젖은 종이 필터 (2 번으로 덮여 -4 ° C) 수술 단계. 얼음 냉각 블레이드와 소뇌를 제거하고 뇌의 중간 선을 절단하여 두 개의 반구를 분리합니다. 그런 다음, 95 %, O2 / 5 % CO 2와 버블 얼음처럼 차가운 자당 ACSF 가득 비커에 분리 된 2 개의 반구를 배치합니다. </li><li> 얼음처럼 차가운 필터 종이 무대에 반구과 장소의 절반을 가져 가라. 추가 솔루션을 빨아 뇌 주위가 일반 종이 타월이나 종이 필터를 놓습니다. 재료에 두 화재 연마 유리 피펫 도구 (제 10 호를 사용하여장비) 뇌의 중앙 부분의 나머지 부분에서 피질을 분리한다. </li><li> 해마는 대뇌 피질의 내부에서 노출과 얼음처럼 차가운 무대에 배치 된 후, 조직에 얼음처럼 차가운 자당 ACSF의 두 세 방울을 위치하게 한 후, 해마 주변에 여분의 용액을 제거. 해마의 두 끝에서 대뇌 피질로 연결을 잘라. 그런 다음, 불을 연마 유리 도구를 사용하여 뇌에서 해마를 해부 뇌의 나머지 부분을 제거합니다. </li><li> 그 alveus면이 위를 향하게하고 해마 고랑이 아래로 향하도록하여 전체 해마를 분리합니다. 신속하게 다시 조직에 얼음처럼 차가운 자당 ACSF의 두 세 방울을 떨어 뜨리고 종이 타월의 조각을 사용하여 조직의 주위에 여분의 용액을 제거. 고랑 (그림 1B, C)를 노출 전체 해마를 넘겨 화재 연마 유리 도구를 사용합니다. </li><li> 일반 광학 현미경, 특정 Materi에서 사용자 지정으로 만든 유리 바늘 (11 호를 삽입루게릭 병 및 고랑의 한쪽 끝으로 장비)과 고랑의 방향 (그림 1C)을 따라, 치아 subiculum 할 이랑 (DG) 또는 CA1 필드에서 광섬유 연결을 잘라. 필요한 경우 해마의 중격 및 시간 끝 트림 얼음처럼 차가운 칼날을 적용합니다. 절단 고랑에 (특정 재료 및 장비에 번호 12) 사용자 정의 만든 금속 와이어 루프를 삽입하고 화재 광택 유리 도구에 의해 해마의 subiculum / CA1 끝을 잡고 조직에서 떨어져 DG 세워 (그림 1D) . </li><li> 위의 전개 과정에 따라, 조직에 얼음처럼 차가운 자당 ACSF의 또 다른 두 세 방울을 추가하고 조직의 주위에 여분의 용액을 제거. 그리고, 에지 (도 1E)에 빙냉 블레이드 펼친 해마 트림 및 약 (RT에서 정상 ACSF 채운 95 %, O2 / 5 % CO 2로 버블 회수 챔버로 주걱 의해 제제를 배치 25 ° C). 휴가펼친 해마 조직은 기록 챔버로 배치하기 전에 약 1 시간을 복구한다. </li><li> 다른 뇌 반구를 타고 2.5-2.9 단계를 진행하는 데 사용. 일반적으로, 하나의 해마를 전개하고 산소와 수화 조직을 유지하기 위해 지속적으로 얼음처럼 차가운 자당 ACSF을 드롭 모든 절차를 완료하는 데 약 1 ~ 2 분을. </li></ol> 3. 실험 시스템 설치 <ol><li> 핀 그리드 어레이 (PGA) 패키지에 맞춤 제작 PMEA 접착제 및 패키지 (도 3B)에 대한 핀의 패드로 단일 미세 전극으로부터 각 패드를 연결하는 마이크로 와이어 본딩을 사용한다. 그런 다음, 사용자 정의 - 만든 회로 기판 (13)의 소켓에 패키지를 삽입합니다. </li><li> 개별적으로 맞춤 제작 한 회로 기판 (13)에 100의 이득과 4 kHz와 앰프에 1 Hz에서에서 대역 통과 차단 주파수와의 필터에 각각의 미세 전극을 연결합니다. A / D 전환 수에 의해 회로 보드로부터의 아날로그 출력을 디지털화erting 시스템을 포함하고, 컴퓨터에 데이터를 수집 및 저장한다. </li><li> 용액의 흐름 (도 4A)에 대한 입구 및 출구 튜브 어레이와 주변 주문품 플라스틱 기록 챔버를 붙인다. 시스템에서 다른 솔루션을 유지하고, 결합하고 트라이 밸브에 의해 병의 출력 튜브를 제어하기 위해 적어도 두 병을 사용. 기록 챔버로 안내되는 용액 IV 드립 챔버와 배관 시스템 트라이 밸브의 출력을 연결한다. </li><li> 트라이 - 밸브 및 기록 챔버의 입구 사이에, 용액 기록 챔버로 안내되기 전에 제어 된 온도 (35 ° C)의 해결책을 가열하는 전기 히터를 추가한다. 진공관 접속 플라스크에 용액을 수집 진공관에 기록 챔버의 출구를 연결. 이 연구에서 어떤 실험에서 모든 솔루션을 재활용하지 마십시오. </li></ol> 4. PMEA에 펼친 해마를 배치하면 신경 활동을 기록합니다 </p&gt; <ol><li> 실험 장치를 준비하려면, 하나의 정상 ACSF 병, 4-AP ACSF 또 다른 병을 채 웁니다. 두 병, 거품, 95 % O, 각 실험의 처음 2 / 5 % CO 2. 실험 기간 동안 선택 될 솔루션을 제어하는​​ 트라이 밸브 커넥터를 사용합니다. 먼지통으로 용액을 펌핑 챔버의 출구에 진공 튜브를 연결한다. 상기 기록 챔버로 전달하기 전에 파이프 라인을 가열하고 조절 된 온도 레벨 (35 ° C)에서 용액을 유지한다. </li><li> 기록 챔버의 입구 및 출구가 폐쇄되는 경우, 상기 기록 챔버로 펼친 해마 옮기고 배치 주문품 유리 피펫 드롭퍼를 사용한다. 현미경, 조직이 솔루션에 떠있는 동안 정기적 작은 페인트 붓을 사용하여 전개 된 해마를 놓습니다. 그 alveus 측이 멀리 가리키는, CA3 영역을 아래로 향하게하고, CA1 필드가 연구자를 가리키는 펼친 해마를 놓습니다. </lI&gt; <li> 조심스럽게 건조 챔버 및 조직이 배열 될 때까지 하강하여 액면을 낮출 기록 챔버의 에지로부터 진공 피펫을 이용하여 챔버 내의 용액을 얻어 빨아. 그런 다음, 조심스럽게 배열에 펼쳐진 해마를 개최 조직의 상단에 사용자 정의 만든 조직 앵커 (그림 4) (특정 재료 및 장비의 제 14 호)를 배치합니다. IV 드립 챔버에서 초당 약 2 방울로 유량을 조정하는 입구 및 출구를 리필하고 서서히 열고 기록 챔버 내로 용액 몇 방울을 넣어. </li><li> 복구하기 위해 약 1 분 동안 정상으로 기록 ACSF 챔버 내의 조직을 인큐베이션 한 후 4-AP ACSF에 용해 액 공급 전환 적절히 유량을 조정한다. 약 5 내지 10 분 동안 용해 된 ACSF 4-AP의 조직을 인큐베이션 한 후 연구원 운동량이 나타나면 신호를 기록하는 소프트웨어를 시작할 수있다. </li></ol> 5. 제거실험 후 PMEA에서 조직 <ol><li> 미세 조작기에 의해 조직을 제어하고 앵커 서서히 기록 챔버로부터 조직을 들어 올려. 녹화 실의 흐름을 중지 입구와 출구를 모두 종료합니다. 기록 액 챔버는 가득이거나 기록 챔버는 가득 차지 않은 경우에 챔버를 채우기 위해 용액의 몇 방울을 추가한다. </li><li> 조직의 각 모서리를 들어 올리려면 작은 페인트 브러시를 사용합니다. 조직이 용액에 떠 있지 않으면, 조직은 여전히​​ 어레이에 앉아 신중 챔버 건조 진공관을 채용한다. 그런 다음 조심스럽게 점진적으로 챔버를 채우고 기록 챔버가 가득 차면 흐름을 중지 입구를 종료 입구를 엽니 다. 다시 조직의 각 모서리를 들어 올려 작은 페인트 브러시를 적용합니다. </li><li> 조직까지 단계를 반복 5.2 배열에서 분리하고, 용액에 떠있다. 조직이 용액에 떠있는 경우, 거리 티슈 빨아 진공 튜브를 사용한다. 열기 t그는 입구에 흘러 출구에서 진공을 엽니 다. 증류수로 시스템을 세척하고 건조. </li></ol>

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해마의 종 방향 및 횡 방향 축이 관통하는 미세 전극 배열과 조합 보존 펼친 해마 제제의 개발은, 해마 7 해부학 신경 연결 또는 전파를 조사하는 강력한 도구를 제공한다. 이 전개 절차는 성인 쥐에서 해마를 공부에 적용됩니다. 이러한 준비와 최근의 연구는 4-AP에 의한 간질 활동이 펼쳐진 해마의 전체 영역에 걸쳐 대각선 파면 (그림 6) 7,8로 전파 할 수 있음을 보여 주었다. 이러한 연구들은 평평한 해마 신경망 신경 전파 (도 6)를 조사 할 때 그대로 펼친 해마 횡 또는 종 중 조각에 비해 상당한 이점을 제공한다는 것을 보여 주었다. 미세 관통 기존 마일 비해 상당한 장점을 제공한다평평한 표면 11,12,17 위에 위치 여러 연락처로 구성 croelectrode 배열 (MEA). 셀 층이 약 250-300 μm의 거리 표면 (그림 2)에...

신경 신호의 신경 전도 또는 전파를 이해하는 것은 뇌 1-3의 정상적인 기능 및 병리학 적 조건 모두에서 신경 통신의기구의 결정에 매우 중요하다. 해마는 메모리, 및 공간 추적 같은 몇몇 뇌 기능에 중요한 역할을 극적 행동뿐만 아니라 1,6- 영향 여러 병리학 적 변화에 관여하기 때문에 뇌에서 가장 광범위하게 연구 한 구조이다. 해마가 복잡한 조직을 나타내고 있지만, 그 구조의 다른 요소가 용이하게 식별되고 슬라이스 제조 4-6에 액세스 할 수있다. 해마의 횡단 방향으로, 신경 활동은 치아 이랑 (DG), CA3, CA1 andsubiculum 4,5-를 포함 트라이 시냅스 경로를 통해 전파하는 것으로 알려져있다. 이 시냅스 전달 축삭 전도의 대화를 위해 중요한 역할 것으로 여겨진다이 가로 회로 4,6에에. 그러나, 신경 신호의 전달 종횡 4,6 모두에서 발생한다. 이 해마가 완전히 전파 (4)의 특정 방향으로의 관찰을 제한 조각 제제를 사용하여 조사 할 수 없다는 것을 의미한다. 세로 슬라이스 종축을 따라 5 축삭 경로를 조사하기 위해 개발되었다. 연구자들은 주로 가로 및 세로 축에 각각 6 함께 행동 별 감마 세타 진동을 관찰했다. 이러한 동작은 개별적으로 연구되고있다, 아직 두 방향에 대한 동시 접근이 이러한 행동을 이해하는 것이 중요하다. 심지어 그대로 해마 제제의 발달로 인한 해마 (4)의 절첩 구조로 조직 전체에 걸쳐 전파를 모니터하는 것은 곤란하다. 펼쳐진 해마는 포장 뉴런에 대한 액세스를 제공합니다이차원 평면 셀 7,8 층의 형태 일 수있다. 치아 이랑 (DG) (도 1)을 전개함으로써, 해마, 종횡 연결 모두 CA3 및 CA1이 모두 함유 이차원 시트에 배치 된 피라미드 전지 층으로 그대로 유지되는 직사각형 구성으로 편평한 형상을 채용 신경 전달을 조사하기 위해 이용 될 수 신경 조직의 평평한 부분을 이탈 (도 2) 8. 신경 활동이어서 개별 유리 피펫, 미세 전극 배열, 자극 전극뿐만 아니라, 전압 감응 염료 (VSD) -3,7,8-으로 모니터링 할 수있다. 또한, 트랜스 제닉 마우스에서 유전자 부호화 전압 표시기 전파 패턴 (9)을 추적하는 데 사용될 수있다. 펼친 해마 네트워크의 평면 구성은 광 기록 방법뿐만 아니라 미세 전극 배열에 매우 적합하다. M시중에서 판매하는 배열의 OST는 평면 또는 로우 프로파일 전극을 제조하고 조직 슬라이스 배양 신경 세포 10-12 모두에서 신경 활동을 기록 할 수 있습니다. 뉴런의 소마가 조직으로 깊은 위치 보낸 신호가 그대로 조직으로부터 수득되는 경우에는, 신호 대 잡음비 (SNR)가 감소한다. 고 종횡비 미세 전극 배열은 SNR을 향상시키기 위해 필요하다. 이러한 취지, 관통 미세 전극 배열 (PMEA)은 실험실에서 개발되었으며, 펼친 해마 7,13으로 20 ㎛, 직경 200 ㎛, 높이 64 스파이크를 삽입하여 조직으로 조사 할 수있는 기능을 제공한다 . 미세 전극이 배열은 전압 감응 염료 촬상에 비해 더 높은 SNR을 가지고 있으며, SNR은 실험 7,13 동안 안정적으로 유지. 해마 펼친 준비 및 PMEA의 조합은 투자 할 수있는 새로운 방법을 제공한다2 차원 평면 위에 신경 전달을 igate. 이 기술을 사용하는 실험들은 이미 신경 활동 독립적 시냅스 또는 전기 시냅스 (7)의 전파 될 수있다 해마에서 신경 신호 전달 기전에 대한 의미있는 결과를 수득했다.

<table><tbody><tr><td>건조제 용기</td><td>LABRECYCLERS Inc.</td><td>5410</td><td>동물 마취를 위해 항아리 바닥에 일반 종이 타월을 놓습니다.&nbsp;</td></tr><tr><td>해마를 펼치기 위해 만든 칼날과 커스텀 수술 단계</td><td>N/A</td> N<td>/A</td><td>페트리 접시는 얼음 속에 거꾸로 (중앙에) 놓고 그 위에는 젖은 여과지를 놓습니다.&nbsp;</td></tr><tr><td>맞춤형 조직 회수 챔버</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>플라스틱 튜브는 바닥에 플라스틱 메쉬로 접착되고 aCSF에 95% O2/5% CO2로 거품이 일었습니다.</td></tr><tr><td>스트레이트 작동&nbsp; 가위</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>S17336B&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Medco Instruments No.:81995&nbsp;</td><td>이 가위는 사용됩니다&nbsp; &nbsp; 생쥐의 목을 베십시오.</td></tr><tr><td>인테그라 밀텍스 골드만-폭스&nbsp; 가위</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-460-517&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; MILTEX 주식회사&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; No.:5-SC-320</td><td>이 가위는 생쥐의 두개골을 자르는 데 사용됩니다.&nbsp;</td></tr><tr><td>Miltex 자궁절제술 집게</td><td>Claflin 의료 기기</td><td>CESS-722033-00001</td><td>이 집게는 절단된 두개골을 벗겨내어 뇌를 노출시키는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>마이크로 주걱</td><td>Cardinal Health</td><td></td><td>이 마이크로 주걱은 반구의 전체 뇌를 재코어링 챔버로 전송하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>Frey Scientific 스테인리스 스틸 세미 마이크로 주걱</td><td>Cardinal Health</td><td></td><td>이 세미 마이크로 주걱은 펼쳐진 해마를 회수실의 포도당 aCSF로 전달하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>작은 페인트 브러시</td><td>Lowe's</td><td>tem #:&nbsp; 105657&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 모델 #:&nbsp; 90219</td><td>일반 페인트 브러시 패키지에서 가장 작은 크기를 가진 것</td></tr><tr><td>: 화재 광택 유리 도움말 도구</td><td>N / A</td><td>N / A</td><td>이 도구는 화재 광택 처리되어 일반 파스퇴르 유리 피펫으로 만들어졌습니다.</td></tr><tr><td>맞춤형 유리 바늘</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>이 도구는 화재 광택 처리되어 일반 파스퇴르 유리 피펫으로 만들어졌습니다.</td></tr><tr><td>금속 와이어 루프가 있는 맞춤형 유리 도구</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>이 도구는 화재 광택 처리되었으며 모양이 변경된 금속 와이어 루프가 있는 일반 파스퇴르 유리 피펫으로 만들어졌습니다.</td></tr><tr><td>맞춤형 유리 용액 드로퍼</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>이 도구는 팁이 잘린 일반 파스퇴르 유리 피펫으로 만들어졌으며 절단 끝에 고무 헤드가 부착되어 있습니다.</td></tr><tr><td>맞춤형 조직 앵커</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>나일론 섬유 메쉬는 절연 구리선 링에 접착되었습니다. 조직 앵커는 마이크로 매니퓰레이터에 의해 유지되었습니다.&nbsp;</td></tr><tr><td>맞춤형 제작 미세전극 어레이</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>어레이에 대한 자세한 내용은 다음을 참조하십시오. Kibler, 외, 2011.&nbsp;</td></tr><tr><td>배열을 위한 맞춤형 필터 및 증폭기 회로</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>배열에 대한 자세한 내용은 다음을 참조하십시오. Kibler, 외, 2011.&nbsp;</td></tr><tr><td>데이터 수집 프로세서 3400a</td><td>Microstar Laboratories</td><td>N/A</td><td>A/D 컨버터가 있는 완벽한 데이터 수집 시스템입니다.</td></tr></tbody></table>

관통 마이크로 전극 배열을 펼친 해마 준비에 신경 활동 전파

Neural Activity Propagation in an Unfolded Hippocampal Preparation with a Penetrating Micro-electrode Array

이 프로토콜은 해마 신경 활동에 매핑하는 마이크로 머신 어레이와 결합 체외 플랫 해마 준비 새로운 제조 방법을 설명한다. 가로 해마 슬라이스 준비는 해마의 전기 생리학을 연구하는 가장 일반적인 조직의 준비입니다. 길이 해마 슬라이스는 해마 연결 길이를 조사하기 위하여 개발되었다. 그 두께가 충분한 산소 확산을 허용하기 때문에 본래 마우스 해마는 시험관 내에서 유지 될 수있다. 조직의 일부가 누락되거나 접혀 하나이기 때문에, 이러한 세 가지 제제는 신경 전달에 대한 직접 액세스를 제공하지 않는다. 펼쳐진 그대로 해마는 가로와 체외에서 해마의 신호 전파의 전체 범위를 분석 할 수있는 조직에 직접 액세스를위한 평면 구성의 종 방향 연결을 모두 제공합니다. 효과적으로 t에서 신경 활동을 모니터하기 위해서그 세포층, 정의를 제조 하였다 마이크로 전극 어레이 (PMEA)을 만들어 관통 펼친 해마인가. 높이 200 μm의 64 전극 PMEA 깊은 마우스 해마 내부의 신경 활동을 기록 할 수있다. 펼친 해마 준비 및 PMEA의 독특한 조합 잡음비 높은 신호 해마의 이차원 CA1-CA3 영역의 속도 및 신경 활동의 전파 방향을 연구하는 새로운 시험관 도구를 제공한다.

여기서 도면에 도시 된 데이터는 4-AP (100 μM) RT에서 기록 챔버 내의 조직 배양 동안 첨가 ACSF (25 ° C)로 펼친 해마 제제에 기록 하였다. 일반적으로 활동은 5 분 이내에 시작되지만 나이가 동물에서 일부 해마 조직에서 시간이 더 오래 걸릴 수 있습니다. 이전에보고 된 14,15 PMEA 관찰 4-AP 유도 된 신경 소성 동일하다. 전극이 200 ㎛의 높이를 가지기 때문에, 전극 팁은 단지 밖으로 전지 층 (도 3c) 전지 층은 보통 250 해마 alveus 상술 내지 300㎛이기 때문에 (도 2), 녹화 (57 아래에 위치되고 다른 채널에서 샘플 실험)에서 64 주로 긍정적 인 편향이있다. 그러나, 이러한 양의 녹화뿐만 아니라 일부 (도 5b), 기록 전극의 끝은 셀 층에 충분히 가까이있는 경우에는 작은 음의 굴절을 표시 할 수있다.전극의 끝이 세포 층의 수준에서 오른쪽에 있으면 기록은 긍정적 ...

우리는 뉴런의 CA1-CA3 배열을 유지 체외 펼쳐진 해마를 개발했다. 관통 마이크로 전극 배열과 결합하여 신경 활동 모두 종 방향 및 횡 방향으로 모니터링 할 수있다. 전체 해마 전파를 동시에 기록 할 수 있으므로이 방법은 해마 슬라이스 제제에 비해 많은 장점을 제공한다.

This protocol describes a method for preparing a new in vitro flat hippocampus preparation combined with a micro-machined array to map neural activity in ...

이 절차의 전반적인 목표는 설치류 해마를 펼치고 편평한 조직 준비물을 관통하는 마이크로 전극 어레이에 배치하는 과정을 소개하는 것입니다. 녹음용. 이것은 먼저 쥐의 뇌 절반에서 해마를 분리함으로써 달성됩니다.두 번째 단계는 맞춤형 도구로 해마의 곡선 구조를 펼치는 것입니다. 다음으로, 펼쳐진 해마를 기록 챔버로 옮기고 기록 어레이 상에 놓는다. 마지막 단계는 실험 후 어레이에서 펼쳐진 해마를 제거하는 것입니다.궁극적으로 개별 정규화 매핑 방법은 투과 마이크로 전극 어레이에 의해 기록된 신경 활성 전파를 보여주기 위해 데이터 분석에 사용됩니다. 글쎄,이 기술의 주요 장점은 두 방향, 가로 방향 및 세로 방향으로 신경 활동을 기록 할 수 있다는 것입니다. 신경 활동의 실제 전파를 보려면 온전한 해마가 필요하고, 움푹 들어간 항아리를 펴고 기록실에 평평하게 눕히면 전파가 가로 방향과 세로 방향으로 모두 발생합니다.그리고 나서 우리는 조직의 증식 속도를 알아낼 수 있었습니다. 우리는 두 방향에서 활동하고 있었고, 전파 메커니즘, 특히 비(非) 시냅스 메커니즘을 연구할 수 있었습니다. 우리는 그 간극연접(gap junctions)과 함께 시냅스 전달(synaptic transmission)과 함께 활동이 전파되는 것을 볼 수 있었고, 그 속도 때문에 우리는 그것이 확산이 아니라는 것을 알고 있습니다.이제 우리는 이 전파의 실제 메커니즘을 알아내려고 노력하고 있습니다. 일반적으로 이 기술을 처음 접하는 개인은 해마를 펼치고 조직이나 어레이를 손상시키지 않고 이 관통하는 마이크로 전극 어레이에 편평한 조직 제제를 배치하는 까다로운 절차로 인해 어려움을 겪을 것입니다. 이 절차를 시작하려면 마우스 머리를 얼음처럼 차가운 산소 자당에 넣습니다.CSF는 가는 가위를 사용하여 두개골의 피부를 제거합니다. 다음으로, 정중선을 따라 두개골을 자르고 측두엽 근처의 두 끝을 자릅니다. 그런 다음 자른 두개골을 머리 옆쪽으로 벗겨냅니다.뇌를 드러내기 위해서는 주걱으로 두개골에서 뇌를 조심스럽게 제거한다. 그 후, 젖은 여과지로 덮인 얼음처럼 차가운 수술 단계에 뇌를 놓습니다. 얼음으로 식힌 칼날로 소뇌를 제거합니다.그런 다음 뇌의 정중선을 절단하여 두 반구를 분리합니다. 그런 다음 분리된 두 개의 반구를 얼음처럼 차가운 자당으로 채워진 비커에 넣습니다. 뇌척수액은 산소 95%, 이산화탄소 5%로 거품을 일으켰다.한쪽 반구를 여과지로 덮인 얼음처럼 차가운 단계로 옮깁니다. 여분의 용액을 흡수하기 위해 뇌 주위에 일반 종이 타월이나 여과지를 놓으십시오. 그런 다음 두 개의 화염 광택 유리 피펫을 사용하여 뇌의 중앙 부분에서 피질을 분리하여 해마를 노출시킵니다.다음으로, 얼음처럼 차가운 수세 A CSF를 조직에 2-3방울 떨어뜨리고 여분의 용액을 제거합니다. 해마의 양쪽 끝에 있는 피질과의 연결을 끊습니다. 그런 다음 불로 광택이 나는 유리 도구로 뇌에서 해마를 해부합니다.그런 다음 해마의 바깥쪽이 위를 향하고 해마열구가 아래를 향하도록 전체 해마를 분리하고 조직에 얼음처럼 차가운 CSF 2-3방울을 다시 바르고 그 주변의 여분의 용액을 제거합니다. 그런 다음 불에 닦인 유리 도구를 사용하여 해마 전체를 뒤집습니다. 열구를 노출시키려면 얼음처럼 차가운 칼날을 사용하여 해마의 중격과 측두부 끝을 다듬습니다.필요한 경우 맞춤형 유리 바늘을 열구에 삽입하고 광섬유 트랙을 DG에서 ca 3으로 자릅니다. 그런 다음 금속 와이어 루프를 사용하여 DG를 당기고 해마를 펼칩니다. 전체 수술 과정은 일반적으로 약 2분 동안 지속됩니다.얼음처럼 차가운 자당 A CSF를 조직에 2-3방울 더 바르고 그 주위의 여분의 용액을 제거합니다. 그런 다음 얼음처럼 차가운 칼날로 펼쳐진 해마의 가장자리를 다듬습니다. 제제를 정상 A CSF로 채우고 95% 산소, 5% 이산화탄소로 거품을 일으킨 회수실로 1시간 동안 실온에서 기포한 후 기록 챔버로 옮깁니다.이 절차에서 한 병에는 일반 A CSF를 채우고 다른 병에는 4개의 AP A CSF 버블을 채웁니다. 실험 시작부터 95% 산소, 5% 이산화탄소가 포함된 솔루션. 트라이밸브 커넥터를 사용하여 실험 중에 선택할 솔루션을 제어합니다.그런 다음 진공관을 챔버의 출구에 연결합니다. 용액을 분진통으로 제거하려면 용액을 기록 챔버로 전달하기 전에 파이프라인을 가열하고 섭씨 35도의 제어 온도로 유지하십시오. 기록 챔버의 입구와 출구를 닫은 후 맞춤형 유리 피펫 스포이드를 사용하여 펼쳐진 해마를 기록 챔버로 옮깁니다.현미경 위치에서 펼쳐진 해마는 알비아 면이 아래를 향하고 ca, 3개의 영역이 반대쪽을 향하고 caa 1개의 필드가 연구원을 향하도록 하여 챔버가 건조되고 조직이 어레이에 놓일 때까지 기록 챔버 가장자리에서 진공 피펫을 사용하여 챔버 내의 용액을 조심스럽게 흡인합니다. 그런 다음 조직 위에 맞춤형 조직 앵커를 조심스럽게 배치하여 펼쳐진 해마를 어레이에 고정합니다. 용액 몇 방울로 녹음 챔버를 다시 채웁니다.입구와 출구를 점차적으로 열어 IV 트립 챔버에서 초당 약 2방울로 유량을 조정합니다. 약 1분 동안 정상 A CSF로 기록실의 조직을 배양합니다. 그런 다음 솔루션을 전환하십시오.4개의 AP 용존 A CSF에 적용하고 유량을 적절하게 조정합니다. 기록하기 전에 약 5-10분 동안 A CSF가 용해된 4개의 조직에서 배양합니다. PMEA에서 조직을 제거하려면 마이크로 매니퓰레이터로 조직 앵커를 제어하고 기록 챔버에서 앵커를 서서히 들어 올립니다.흐름을 중지하려면 입구와 출구를 모두 차단하십시오. 녹음실에서 작은 붓을 사용하여 티슈의 모서리를 들어 올립니다. 조직이 용액에 떠 있지 않으면 진공 튜브를 사용하여 조직이 어레이에 남아 있는 상태에서 챔버를 조심스럽게 건조시킵니다.그런 다음 입구를 조심스럽게 열어 챔버를 점차적으로 채우고 입구를 닫아 흐름을 멈춥니다. 녹음실이 가득 차면 작은 붓을 사용하여 티슈의 모서리를 들어 올립니다. 다시. 조직이 용액에 떠 있으면 진공관을 사용하여 조직을 빨아들입니다.입구에서 흐름을 열고 출구에서 진공을 엽니다. 증류수로 시스템을 세척하고 건조시키십시오. 이것은 34.9 데시벨의 신호 대 잡음비로 기저 수지상 영역에 위치한 마이크로 전극 중 하나에서 기록된 100 Micromolar 4 AP A CSF에 의해 유도된 자발적 활성의 예입니다.그리고 다음은 빨간색 사각형의 확대 된 활동입니다. 이것은 27.2 데시벨의 신호 대 잡음비로 표시된 소마타에 더 가까운 다른 마이크로 전극의 원시 데이터입니다. 다음은 체세포층 내에 위치한 전극으로부터 얻어진 기록의 또 다른 예입니다.이 예에서 신호 대 잡음비는 18.53데시벨이며, 다음은 마이크로 전극에서 기록된 기준선 잡음입니다. 기준선은 일반적으로 150에서 200 마이크로 볼트의 피크 대 피크 값을 가지며 단일 전극의 임피던스는 약 1-2 메가 옴입니다. 이 비디오는 어레이로 기록된 후 개별 정규화 방법을 사용하여 처리된 신경 전파를 보여줍니다.데이터 분석에서 전체 조직에 걸친 전체 전파는 이 절차에 따라 약 100밀리초 동안 지속됩니다. 신경 병소의 움직임과 같은 추가 질문에 답하기 위해 펼쳐진 상태의 신경 영상, 유리체 내 해마와 같은 다른 방법도 수행할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 해마를 제자리에서 펼치는 방법, 편평한 조직 준비를 마이크로 강의 어레이에 전개하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

절연 hippocampi에서 급성 뇌 조각뿐만 아니라 astrocytes와의 뉴런의 동시 electrophysiological 레코딩의...

급성 Hippocampal 슬라이스에 Synaptically-evoked Astroglial와 Neuronal 응답의 듀얼 Electrophysiological 레코딩

이 비디오는 펼쳐진 해마에서 신경 신호를 캡처하기 위해 PMEA(Penetrating Microelectrode Array)가 있는 기록 챔버를 설정하는 절차를 보여줍니다. 이 방법을 사용하면 체외에서 펼쳐진 해마 내에서 신경 활동의 전파 속도와 방향을 연구할 수 있습니다.

투과 미세전극 어레이를 사용하여 펼쳐진 해마 조직의 신경 활동을 기록합니다.

이 프로토콜은 미세 전극 어레이(MEA)를 사용하여 발작 유도 약물에 노출된 뇌 절편의 전기 활동을 기록하는 것을 포함합니다. 이 절차에는 MEA 기록 챔버에 뇌 절편을 배치하고, 인공 발작을 유도하기 위해 전기 자극을 가하고, 결과 신호를 분석하는 것이 포함됩니다.

Monitoring Seizure-Induced Neural Electrical Activity in Brain Slices Using Microelectrode Arrays(미세 전극 어레이를 사용한 뇌 절편에서 발작 유도 신경 전기 활동 모니터링)

이 비디오는 시냅스 활동을 기록하기 위해 침수실에서 뇌 절편을 설정하는 절차를 보여줍니다. 이 과정에는 렌즈 종이에 슬라이스를 고정하고, 신경 세포의 생존력을 보장하기 위해 인공 뇌척수액(aCSF)의 지속적인 흐름을 유지하고, 관심 있는 특정 뇌 영역과 관련된 자극 및 기록 전극을 정확하게 배치하는 것이 포함됩니다. 이 설정을 통해 기준선 시냅스 활동과 전기 자극의 영향을 정밀하게 모니터링할 수 있습니다.

Recording Neuronal Field Excitatory Postsynaptic Potentials in Acute Hippocampal Slices(급성 해마 절편에서 신경 필드 흥분성 시냅스 후 전위)

이 비디오는 마우스 모델의 해마에 와이어 전극 어레이와 광섬유를 정위 이식하는 방법을 보여줍니다.

전극 배열과 광섬유를 마우스 해마에 이식

하나의 단위 전기 생리학 녹음에 사용하기 위해 microwires의 조직 배열을 주입하는 기술 문제를 안겨준다. 이 기술과 필요한 장비를 수행하는 방법이 설명되어 있습니다. 또한, 높은 공간 선택과 별개의 신경 하위 영역에서 기록하는 조직 마이크로 와이어 어레이의 유익한 사용을 설명합니다.

동물 행동하자, 깨어있는 단일 단위 레코딩을위한 Microwires의 조직 된 배열을 주입하기위한 절차

이 비디오 기사는 설치류의 급성 해마 절편을 사용하여 CA1 피라미드 뉴런에서 시냅스 태깅, 캡처 및 교차 태깅과 같은 장기 가소성과 연관 과정을 연구하기 위한 실험 절차를 설명합니다.

설치류에서 급성 해마 조각을 사용하여 시냅스 태그 / 캡처 및 크로스 캡처 조사

우리는 microelectrode 배열을 사용 하는 설치류 뇌 조각에 4 aminopyridine 이용한 epileptiform 활동의 기록 및 전기 변조를 수행 하는 방법을 보여 줍니다. 사용자 지정 녹음 실 조직 생존 연장된 실험 세션에 걸쳐 유지합니다. 전극 매핑 라이브 고 자극 쌍의 선택 사용자 지정 그래픽 사용자 인터페이스에 의해 수행 됩니다.

녹음 및 Microelectrode 배열에 결합 하는 설치류 뇌 조각에 Epileptiform 활동의 변조

이 프로토콜 로컬 필드 전위 선형 실리콘 프로브 멀티 생크와의 녹음을 설명 합니다. 현재 소스 밀도 분석을 사용 하 여 신호 변환 마우스 해 마에 지역 전기 활동의 개조를 허용 한다. 이 기술을 공간적으로 제한 된 뇌 진동 자유롭게 마우스를 이동에 공부 될 수 있다.

행동 하는 쥐의 해 마에서 진동 제한 공간 기록

이 프로토콜 신경 문화에 활동 전위 전송 공부에 대 한 미세 장치 microelectrode 배열 시험관에서 결합 하는 방법을 설명 하는 것을 목표로. 데이터 분석, 즉 탐지 및 전파 하는 활동 전위의 특성은 수행을 사용 하 여 새로운 고급, 아직 사용자 친화적이 고 자유롭게 사용할 수, 계산 도구.

Microelectrode 배열 마이크로 신경 통신 및 Axonal 신호 전파 공부에 대 한 인터페이스

이 프로토콜은 자발적인 날카로운 파도 잔물결 활동을 나타내는 마우스에서 수평 해마 내톨리날 피질 (HEC) 슬라이스의 준비를 설명합니다. 슬라이스는 단순화 된 인터페이스 보유 챔버에서 배양되고 기록은 조직의 산소화와 네트워크 수준의 활동의 자발적출현을 촉진하기 위해 빠르게 흐르는 인공 뇌척수액과 침수 된 조건에서 수행됩니다.

급성 마우스 뇌 슬라이스 자발적인 해 마 네트워크 활동을 조사

배우세요 쥐 해마를 펼쳐 관통 마이크로 전극 배열에 배치하여 전체 구조에서 신경 활동을 동시에 기록하는 방법을. 이 기술은 해마 기능 연구에 새로운 통찰을 제공합니다.

관통 마이크로 전극 배열을 펼친 해마 준비에 신경 활동 전파

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