관통 마이크로 전극 배열을 펼친 해마 준비에 신경 활동 전파

우리는 뉴런의 CA1-CA3 배열을 유지 체외 펼쳐진 해마를 개발했다. 관통 마이크로 전극 배열과 결합하여 신경 활동 모두 종 방향 및 횡 방향으로 모니터링 할 수있다. 전체 해마 전파를 동시에 기록 할 수 있으므로이 방법은 해마 슬라이스 제제에 비해 많은 장점을 제공한다.

이 절차의 전반적인 목표는 설치류 해마를 펼치고 편평한 조직 준비물을 관통하는 마이크로 전극 어레이에 배치하는 과정을 소개하는 것입니다. 녹음용. 이것은 먼저 쥐의 뇌 절반에서 해마를 분리함으로써 달성됩니다.

두 번째 단계는 맞춤형 도구로 해마의 곡선 구조를 펼치는 것입니다. 다음으로, 펼쳐진 해마를 기록 챔버로 옮기고 기록 어레이 상에 놓는다. 마지막 단계는 실험 후 어레이에서 펼쳐진 해마를 제거하는 것입니다.

궁극적으로 개별 정규화 매핑 방법은 투과 마이크로 전극 어레이에 의해 기록된 신경 활성 전파를 보여주기 위해 데이터 분석에 사용됩니다. 글쎄,이 기술의 주요 장점은 두 방향, 가로 방향 및 세로 방향으로 신경 활동을 기록 할 수 있다는 것입니다. 신경 활동의 실제 전파를 보려면 온전한 해마가 필요하고, 움푹 들어간 항아리를 펴고 기록실에 평평하게 눕히면 전파가 가로 방향과 세로 방향으로 모두 발생합니다.

그리고 나서 우리는 조직의 증식 속도를 알아낼 수 있었습니다. 우리는 두 방향에서 활동하고 있었고, 전파 메커니즘, 특히 비(非) 시냅스 메커니즘을 연구할 수 있었습니다. 우리는 그 간극연접(gap junctions)과 함께 시냅스 전달(synaptic transmission)과 함께 활동이 전파되는 것을 볼 수 있었고, 그 속도 때문에 우리는 그것이 확산이 아니라는 것을 알고 있습니다.

이제 우리는 이 전파의 실제 메커니즘을 알아내려고 노력하고 있습니다. 일반적으로 이 기술을 처음 접하는 개인은 해마를 펼치고 조직이나 어레이를 손상시키지 않고 이 관통하는 마이크로 전극 어레이에 편평한 조직 제제를 배치하는 까다로운 절차로 인해 어려움을 겪을 것입니다. 이 절차를 시작하려면 마우스 머리를 얼음처럼 차가운 산소 자당에 넣습니다.

CSF는 가는 가위를 사용하여 두개골의 피부를 제거합니다. 다음으로, 정중선을 따라 두개골을 자르고 측두엽 근처의 두 끝을 자릅니다. 그런 다음 자른 두개골을 머리 옆쪽으로 벗겨냅니다.

뇌를 드러내기 위해서는 주걱으로 두개골에서 뇌를 조심스럽게 제거한다. 그 후, 젖은 여과지로 덮인 얼음처럼 차가운 수술 단계에 뇌를 놓습니다. 얼음으로 식힌 칼날로 소뇌를 제거합니다.

그런 다음 뇌의 정중선을 절단하여 두 반구를 분리합니다. 그런 다음 분리된 두 개의 반구를 얼음처럼 차가운 자당으로 채워진 비커에 넣습니다. 뇌척수액은 산소 95%, 이산화탄소 5%로 거품을 일으켰다.

한쪽 반구를 여과지로 덮인 얼음처럼 차가운 단계로 옮깁니다. 여분의 용액을 흡수하기 위해 뇌 주위에 일반 종이 타월이나 여과지를 놓으십시오. 그런 다음 두 개의 화염 광택 유리 피펫을 사용하여 뇌의 중앙 부분에서 피질을 분리하여 해마를 노출시킵니다.

다음으로, 얼음처럼 차가운 수세 A CSF를 조직에 2-3방울 떨어뜨리고 여분의 용액을 제거합니다. 해마의 양쪽 끝에 있는 피질과의 연결을 끊습니다. 그런 다음 불로 광택이 나는 유리 도구로 뇌에서 해마를 해부합니다.

그런 다음 해마의 바깥쪽이 위를 향하고 해마열구가 아래를 향하도록 전체 해마를 분리하고 조직에 얼음처럼 차가운 CSF 2-3방울을 다시 바르고 그 주변의 여분의 용액을 제거합니다. 그런 다음 불에 닦인 유리 도구를 사용하여 해마 전체를 뒤집습니다. 열구를 노출시키려면 얼음처럼 차가운 칼날을 사용하여 해마의 중격과 측두부 끝을 다듬습니다.

필요한 경우 맞춤형 유리 바늘을 열구에 삽입하고 광섬유 트랙을 DG에서 ca 3으로 자릅니다. 그런 다음 금속 와이어 루프를 사용하여 DG를 당기고 해마를 펼칩니다. 전체 수술 과정은 일반적으로 약 2분 동안 지속됩니다.

얼음처럼 차가운 자당 A CSF를 조직에 2-3방울 더 바르고 그 주위의 여분의 용액을 제거합니다. 그런 다음 얼음처럼 차가운 칼날로 펼쳐진 해마의 가장자리를 다듬습니다. 제제를 정상 A CSF로 채우고 95% 산소, 5% 이산화탄소로 거품을 일으킨 회수실로 1시간 동안 실온에서 기포한 후 기록 챔버로 옮깁니다.

이 절차에서 한 병에는 일반 A CSF를 채우고 다른 병에는 4개의 AP A CSF 버블을 채웁니다. 실험 시작부터 95% 산소, 5% 이산화탄소가 포함된 솔루션. 트라이밸브 커넥터를 사용하여 실험 중에 선택할 솔루션을 제어합니다.

그런 다음 진공관을 챔버의 출구에 연결합니다. 용액을 분진통으로 제거하려면 용액을 기록 챔버로 전달하기 전에 파이프라인을 가열하고 섭씨 35도의 제어 온도로 유지하십시오. 기록 챔버의 입구와 출구를 닫은 후 맞춤형 유리 피펫 스포이드를 사용하여 펼쳐진 해마를 기록 챔버로 옮깁니다.

현미경 위치에서 펼쳐진 해마는 알비아 면이 아래를 향하고 ca, 3개의 영역이 반대쪽을 향하고 caa 1개의 필드가 연구원을 향하도록 하여 챔버가 건조되고 조직이 어레이에 놓일 때까지 기록 챔버 가장자리에서 진공 피펫을 사용하여 챔버 내의 용액을 조심스럽게 흡인합니다. 그런 다음 조직 위에 맞춤형 조직 앵커를 조심스럽게 배치하여 펼쳐진 해마를 어레이에 고정합니다. 용액 몇 방울로 녹음 챔버를 다시 채웁니다.

입구와 출구를 점차적으로 열어 IV 트립 챔버에서 초당 약 2방울로 유량을 조정합니다. 약 1분 동안 정상 A CSF로 기록실의 조직을 배양합니다. 그런 다음 솔루션을 전환하십시오.

4개의 AP 용존 A CSF에 적용하고 유량을 적절하게 조정합니다. 기록하기 전에 약 5-10분 동안 A CSF가 용해된 4개의 조직에서 배양합니다. PMEA에서 조직을 제거하려면 마이크로 매니퓰레이터로 조직 앵커를 제어하고 기록 챔버에서 앵커를 서서히 들어 올립니다.

흐름을 중지하려면 입구와 출구를 모두 차단하십시오. 녹음실에서 작은 붓을 사용하여 티슈의 모서리를 들어 올립니다. 조직이 용액에 떠 있지 않으면 진공 튜브를 사용하여 조직이 어레이에 남아 있는 상태에서 챔버를 조심스럽게 건조시킵니다.

그런 다음 입구를 조심스럽게 열어 챔버를 점차적으로 채우고 입구를 닫아 흐름을 멈춥니다. 녹음실이 가득 차면 작은 붓을 사용하여 티슈의 모서리를 들어 올립니다. 다시. 조직이 용액에 떠 있으면 진공관을 사용하여 조직을 빨아들입니다.

입구에서 흐름을 열고 출구에서 진공을 엽니다. 증류수로 시스템을 세척하고 건조시키십시오. 이것은 34.9 데시벨의 신호 대 잡음비로 기저 수지상 영역에 위치한 마이크로 전극 중 하나에서 기록된 100 Micromolar 4 AP A CSF에 의해 유도된 자발적 활성의 예입니다.

그리고 다음은 빨간색 사각형의 확대 된 활동입니다. 이것은 27.2 데시벨의 신호 대 잡음비로 표시된 소마타에 더 가까운 다른 마이크로 전극의 원시 데이터입니다. 다음은 체세포층 내에 위치한 전극으로부터 얻어진 기록의 또 다른 예입니다.

이 예에서 신호 대 잡음비는 18.53데시벨이며, 다음은 마이크로 전극에서 기록된 기준선 잡음입니다. 기준선은 일반적으로 150에서 200 마이크로 볼트의 피크 대 피크 값을 가지며 단일 전극의 임피던스는 약 1-2 메가 옴입니다. 이 비디오는 어레이로 기록된 후 개별 정규화 방법을 사용하여 처리된 신경 전파를 보여줍니다.

데이터 분석에서 전체 조직에 걸친 전체 전파는 이 절차에 따라 약 100밀리초 동안 지속됩니다. 신경 병소의 움직임과 같은 추가 질문에 답하기 위해 펼쳐진 상태의 신경 영상, 유리체 내 해마와 같은 다른 방법도 수행할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 해마를 제자리에서 펼치는 방법, 편평한 조직 준비를 마이크로 강의 어레이에 전개하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.