차 종양과 폐 전이을 연구하기 위해 MEF 세포 격리

이 실험 절차의 전반적인 목표는 마우스의 유방암 종양 발생을 연구하는 것입니다. 먼저, 마우스 유방 종양으로부터 일차 세포를 준비하는 과정이 시연됩니다. 이어서, 폐 전이를 시각화하기 위해 마우스 폐를 적출하는 방법이 제시됩니다.

마지막으로, 마우스 유선종양바이러스 폴리오마 middle T 항원(mouse mammary tumor virus polyoma middle T antigen) 형질전환 마우스가 유방암 종양 발생 연구에 사용될 수 있음을 보여주기 위해, 마우스 배아로부터 마우스 배아 섬유아세포를 준비하는 과정이 제시됩니다. 이 방법은 유방암에 대한 통찰을 제공할 뿐만 아니라 다른 고형암 연구에도 적용될 수 있습니다. 종양 제거 단계에서 다른 조직 없이 종양만을 분리하는 것이 중요하므로, 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다. 우선 가위를 사용하여 마우스 유선종양바이러스 폴리오마 middle T 항원 형질전환 마우스의 요도구부터 목까지 피부를 절개하는 것으로 시작하십시오.

그 다음 피부를 고정하고 유선 유방 종양을 분리합니다. 종양을 제자리에서 차가운 PBS로 세척하고, 멸균된 10 centimeter 조직 배양 플레이트에 넣습니다. 이어서 플레이트를 멸균된 층류 후드로 옮기고, 멸균된 면도날과 가위를 사용하여 종양을 1 cubic millimeter 크기의 조각으로 다집니다.

콜라게나제와 함께 조각들을 로커(rocker) 위에서 37 °C로 배양합니다. 2시간 후, 생성된 종양 조직 현탁액을 원심 분리합니다. 펠렛을 PBS Resus로 3회 더 세척한 뒤, 마지막 세척 후 펠렛을 2 mL의 tripsin EDTA에 현탁하여 37 °C에서 5분 동안 교반하며 반응시킵니다.

그 다음 세포를 세 번 더 세척하고 일반 성장 배지에 다시 현탁합니다. 마지막으로, 원하는 세포 수가 확보될 때까지 향후 3일 동안 매일 배지를 교체하며 10 centimeter 조직 배양 접시에서 세포를 배양합니다. 폐를 적출하기 전에 간과 횡격막을 제거하고 갈비뼈를 분리합니다.

그다음 경정맥과 가까운 기관의 상부를 절개하고, 카테터를 사용하여 기관을 통해 적절한 약제를 주입하여 폐를 채운 뒤 폐를 적출한다. Z fix를 사용하는 경우 조직을 파라핀에 매립한다. 인도 잉크(India ink)를 사용하는 경우에는 조직을 inec 용액에 5분 동안 담근다. 이때 정상 폐 조직은 검은색으로 나타나는 반면 종양 결절은 흰색으로 나타난다. 이차 부위에서 관찰되는 직경 0.5 mm 이상의 모든 종양 결절을 전이로 분류하여 마우스 배아 섬유아세포를 생성한다.

먼저, 시연된 것과 같이 배아에 영향을 주지 않도록 주의하며 임신한 마우스의 요도구부터 목까지 피부를 절개합니다. 다음으로, 자궁각을 제거하고 멸균된 PBS로 헹굽니다. 그런 다음 배아를 태반으로부터 하나씩 조심스럽게 분리합니다.

각 배아를 얼음처럼 차가운 PBS가 담긴 10 centimeter 배양 접시에 넣습니다. 머리, 간, 장을 제거한 후, PBS가 담긴 12 well 조직 배양 플레이트의 한 웰에서 배아의 나머지 부분을 헹구고 몸체를 1 cubic millimeter 크기의 조각으로 자릅니다. 이를 5 milliliters의 tripsin EDTA가 담긴 다른 웰로 옮기고 조직을 37 degrees Celsius에서 배양합니다.

5분 후, 소화를 중단시키기 위해 FBS 1 mL를 첨가합니다. 그다음 결과물인 세포 현탁액을 원심 분리하고 펠릿을 재현탁합니다. 따뜻한 DMEM 1 mL에 현탁한 후, 최종적으로 항생제가 보충된 DMEM 10 mL가 담긴 10 cm 배양 접시에 세포를 옮기고 원하는 세포 수가 확보될 때까지 배양합니다.

동물을 희생시키는 종양 진행 단계는 특정 연구 및 I-A-C-U-C 가이드라인에 따라 달라집니다. 예를 들어, 마우스 유선 종양 바이러스 폴리오마 middle T 항원을 가진 100일 된 FVB 마우스의 경우, 방금 시연한 것과 같이 마우스 유방에서 종양을 분리한 후 3개월 후에 희생시켰습니다. 이를 통해 일차 종양 세포를 얻었습니다.

많은 유전자가 폐로의 유방암 전이를 매개하므로, 전이 과정을 연구하기 위해 방금 시연한 것과 동일하게 폐 또한 적출하였습니다. 그 후 Z fix로 폐를 팽창시키고 인디아 잉크로 염색하여 종양 결절을 시각화하였습니다. 여기에는 FVB 계통의 생쥐 배아에서 분리한 생쥐 배아 섬유아세포가 나타나 있습니다.

이 영상을 시청한 후, 일차 마우스 종양 세포와 마우스 배아 섬유아세포를 분리하고 마우스 폐를 적출하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. ISO fluorine을 사용하는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 화학 흄 후드 내에서 작업하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.