법의학 '터치 DNA'증거에서 간체 미세 조작술에 의해 복구 된 단일 인간 Bioparticles의 향상된 유전자 분석

이 절차의 전반적인 목표는 법의학 터치 DNA 증거에서 추정 바이오 입자라고 하는 개별 또는 응집된 세포를 회수하고 기증자의 DNA 프로필을 얻는 것입니다. 폭력 범죄를 저지르는 동안, 가해자가 피해자의 손목을 잡을 때와 같이 소수의 세포가 개인에서 다른 개인으로 옮겨집니다. 적은 수의 세포를 먼저 회수하기 위해서는 현미경 슬라이드에 부착된 저접착 젤 필름을 사용하여 접촉 영역을 샘플링합니다.

두 번째 단계는 현미경으로 더 쉽게 볼 수 있도록 전달된 바이오 입자를 염색하는 것입니다. 다음으로, 마이크로 조작을 사용하여 겔 필름에서 바이오 입자를 분리합니다. 텅스텐 바늘 끝에 있는 수용성 접착제를 모아 젤 필름 표면에서 관심 있는 바이오 입자를 제거하는 데 사용합니다.

마지막 단계는 개별적으로 수집된 바이오 입자를 A PCR 수집 하단의 PCR 증폭 혼합물로 조심스럽게 옮기는 것이며, 궁극적으로 향상된 DNA 유형 분석 방법을 사용하여 미량 DNA 증거 공여자의 DNA 프로필을 얻는 것입니다. 좋아요, 제 연구실에서는 한 개인과 다른 개인 사이, 또는 개인과 물체 사이의 사람에 대한 폭력 범죄를 저지르는 동안 전달되는 소수의 세포에 대한 유전자 분석에 초점을 맞춥니다. 전통적인 방법은 종종 이러한 적은 수의 세포에서 DNA 프로파일을 복구하지 못합니다.

여기에서 우리는 모든 법의학 실험실에 통합될 수 있는 개별 세포 또는 세포 응집체와 같은 소수의 세포의 물리적 회수 및 유전자 분석을 위한 단순화된 방법을 개발했습니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 대학원생인 Katie Fairish입니다. 이 절차를 시작하려면 바이오 입자를 수집하는 데 사용할 젤 필름을 준비합니다.

겔 필름을 고체 지지대로 사용되는 유리 현미경 슬라이드에 적합한 원하는 크기로 자릅니다. 예를 들어, 3인치 x 1인치 유리 슬라이드의 경우 2인치 x 0.75인치의 젤 필름 크기를 사용합니다. 젤 필름에서 흰색 뒷면을 제거하고 젤 필름을 현미경 슬라이드에 부착하고 단단히 눌러 완전히 부착되도록 합니다.

젤 필름을 오염시키지 않고 젤 필름 조각을 따라 압력이 가해질 수 있도록 제거해서는 안 되는 투명한 상단 보호층이 있으며, 보호층이 부착된 표면이 준비된 젤 필름 슬라이드는 필요할 때까지 실온에서 보관할 수 있습니다. 젤 필름을 사용할 준비가 되면 멸균 핀셋을 사용하여 투명한 상단 보호층을 제거합니다. 젤 필름 표면을 원하는 만진 물체 또는 표면과 직접 접촉하도록 놓습니다.

예를 들어, 손목에서 사람의 피부. 바이오 입자가 겔 필름으로 효율적으로 전달될 수 있도록 소량의 압력을 가합니다. 유리 슬라이드가 동일한 물체에서 여러 샘플링을 깨뜨릴 수 있으므로 너무 많은 압력을 가하지 마십시오 또는 동일한 젤 필름 조각에 표면을 수집할 수 있습니다 같은 방식으로 셔츠 칼라와 같은 물체 및 의류 품목에서 바이오 입자를 수집할 수 있습니다.

바이오 입자가 겔 필름으로 전달되는 것을 확인하려면 트랜스 또는 에피 조명을 사용하여 실체 현미경의 슬라이드를 검사합니다. 약 20배의 배율은 겔 필름의 더 넓은 영역을 보는 데 가장 적합하며, 약 200배의 배율은 개별 생체 입자를 보는 데 가장 적합합니다. 젤 필름 샘플 슬라이드를 뚜껑이 있는 슬라이드 상자에 넣어 실온에서 보관하십시오.

염색 및/또는 바이오 입자 수집이 준비될 때까지 시각화를 돕기 위해 바이오 입자를 염색할 수 있습니다. 이를 위해 먼저 앞서 그림과 같이 준비된 젤 필름 샘플 슬라이드를 싱크대 위의 슬라이드 염색 랙에 놓습니다. 일회용 전사 피펫을 사용하여 전체 젤 필름 표면을 트리안 블루 염색으로 덮고 실온에서 1-2분 동안 배양합니다.

필요한 경우 얼룩이 싱크대로 배출될 수 있도록 슬라이드를 기울여 과도한 얼룩을 제거합니다. 슬라이드는 일회용 이송 피펫을 사용하여 멸균수를 부드럽게 주입하여 헹굴 수 있습니다. 슬라이드가 방영되고 건조된 후 실체 현미경을 사용하여 슬라이드를 보고 적절한 염색을 확인합니다.

스테인드 슬라이드는 뚜껑이 있는 슬라이드 상자에 실온에서 보관할 수 있습니다. 적절한 수의 0.2ml PCR 튜브를 랙에 넣고 튜브에 적절하게 레이블을 지정하여 이 절차를 시작합니다. 원하는 샘플 수에 대해 적절한 부피의 STR 증폭 혼합물을 준비합니다.

Vortex와 마스터는 잘 혼합되어 미니 원심분리기 PI 경로에서 간단히 원심분리합니다.3.5마이크로리터의 증폭. 각 0.2 밀리리터 튜브에 섞으십시오 각 튜브 캡을 느슨하게 닫습니다.

양면 접착 테이프 조각을 유리 블록에 직접 놓습니다. 이것은 샘플 수집 중에 0.2 밀리리터 튜브를 제자리에 고정하는 데 사용됩니다. 깨끗한 유리 현미경 슬라이드에 양면 접착 테이프를 하나 더 붙입니다.

그런 다음 양면 접착 테이프 위에 수용성 웨이브 숄더 테이프 조각을 놓습니다. 테이프 길이를 따라 압력을 가하여 테이프를 제자리에 고정합니다. 그런 다음 보호용 상단 흰색 층을 제거할 수 있습니다.

다음으로 첫 번째 0.2밀리리터 튜브를 유리 블록의 양면 접착 테이프에 놓습니다. 샘플이 수집될 때까지 이 튜브를 따로 보관하십시오. 수용성 파동 군인 테이프 슬라이드를 현미경 아래에 놓고 view낮은 배율로.

텅 스탠드 바늘 끝을 사용하여 테이프 표면을 부드럽게 긁어 바늘 끝에 소량의 접착제 또는 볼을 모으십시오. 접착제 볼의 크기는 조심스럽게 수집해야 하는 바이오 입자의 수에 따라 달라집니다. 혀를 제거하십시오.

바늘 끝을 방해하지 않고 현미경 아래에서 접착제가 있는 바늘을 세웁니다. 필요한 경우 바늘을 랙에 넣습니다. 절차의 가장 중요한 측면은 바이오 입자의 수집 및 이동입니다.

성공을 보장하려면 분석가가 기술에 능숙해질 때까지 기술을 연습해야 합니다. 미리 준비된 겔 필름 샘플을 현미경 스테이지에 놓고 유리 블록을 사용하여 슬라이드를 지지합니다. 바이오 입자를 쉽게 볼 수 있을 때까지 초점과 배율을 조정합니다.

수집될 바이오 입자를 식별합니다. 접착 볼로 텅스텐 바늘을 회수하고 관심 바이오 입자가 있는 겔 필름 표면 위에 바늘을 놓습니다. 바늘 끝을 아래로 눌러 생체 입자와 접촉하도록 합니다.

바늘을 들어 올려 생체 입자가 수집되었는지 확인합니다. 원하는 수의 바이오 입자가 수집될 때까지 이 과정을 반복합니다. 준비된 0.2ml PCR 튜브를 현미경 스테이지에 놓습니다.

증폭 혼합물이 들어 있는 튜브의 바닥에 초점이 맞도록 배율을 조정합니다. 동안 view현미경을 통해 바늘 끝이 증폭 믹스에 들어갈 때까지 텅스텐 바늘을 0.2 밀리리터 PCR 튜브에 조심스럽게 삽입합니다. 접착제가 용해되고 용액으로의 바이오 입자 방출이 관찰될 때까지 증폭 혼합물에 바늘을 잡습니다.

바늘을 제거합니다. 0.2ml 튜브를 똑바로 세우고 느슨하게 캡을 닫습니다. 미리 적신 알코올 천으로 텅스텐 바늘을 청소하고 추가 샘플에 대해 이 수집 절차를 반복합니다.

수집된 바이오 입자의 상염색체 STR 프로파일링을 위한 향상된 증폭 프로토콜을 시작하려면 증폭 혼합물이 포함된 각 0.2ml 튜브에 1.5마이크로리터의 용해 완충액을 추가하고 바이오 입자가 튜브의 뚜껑을 단단히 닫습니다. 열 순환기에 샘플을 넣고 프로토콜 텍스트 증폭이 완료되면 s를 사용하여 샘플을 증폭합니다. 증폭 산물을 모세관 전기영동으로 검출할 준비가 될 때까지 섭씨 4도에서 보관하십시오.

셔츠 칼라 샘플에 있는 개별 바이오 입자의 대표 이미지는 표시되지 않습니다. 수집된 바이오 입자는 원으로 표시됩니다. 빨간색 원은 프로필이 복구되었음을 나타냅니다.

대립유전자 회수율이 포함됩니다. 검은색 원은 프로필이 복구되지 않았음을 나타냅니다. 마찬가지로, 이러한 이미지는 셔츠 칼라에 응집된 바이오 입자의 이미지이며, 여기에 표시된 샘플은 셔츠 칼라의 개별 바이오 입자 샘플 중 하나에서 얻은 STR 프로파일입니다.

그 정확도는 참조 프로파일과 비교하여 결정되었습니다. 대립유전자 번호는 각 유전자 자리의 각 피크 아래에 지정됩니다. x축은 프래그먼트 크기를 나타내고 Y축은 신호 강도를 나타냅니다.

이 프로파일은 합리적으로 균형 잡힌 유전자 간 피크 높이와 대립형질 드롭아웃이 없는 고품질입니다. 다음 프로파일은 셔츠 칼라의 응집된 바이오 입자 샘플 중 하나에서 얻은 전체 STR 프로파일입니다. 마지막으로, 이 그림은 3%의 대립유전자 회수율을 가진 단일 바이오 입자의 실패한 DNA 프로파일링의 예를 보여줍니다.

이 방법은 신체적 폭행 사건에서 가해자로부터 단일 소스 DNA 프로필을 복구하는 것을 촉진해야 합니다. 이 방법이 혼합 DNA 프로필의 해석 및 디콘볼루션과 관련된 일부 문제를 제거한다는 사실은 우리의 관심을 끌