전신 세균 감염 및 면역 방어 표현형에

이 절차의 전반적인 목표는 강력하고 반복 가능한 박테리아 감염을 초파리, 멜라노가스터에 전달한 다음 감염의 중증도를 측정하고 숙주 면역 반응을 정량화하는 것입니다. 이것은 먼저 나노 주입기를 사용하여 박테리아 감염을 파리에 전달함으로써 이루어집니다. 시간이 지남에 따라 감염 후 폐사를 추적할 수 있으며, 감염된 파리를 균질화하고 존재하는 박테리아의 수를 측정하여 언제든지 전신 박테리아 부하를 결정할 수 있습니다.

숙주 면역 방어는 항균 펩타이드 유전자의 발현 수준을 측정하여 정량화할 수 있으며, 궁극적으로 박테리아 감염의 정량화 및 특성화를 통해 확인할 수 있습니다. 초파리에서는, melanogaster는 유전과 환경 요인이 파리의 면역 능력을 어떻게 변화하는지 시험하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이 방법은 숙주의 유전 및 환경 요인이 면역 능력에 미치는 영향 또는 감염에서 뚜렷한 박테리아가 어떻게 다른지와 같은 곤충 면역 분야의 주요 질문을 해결하는 데 사용할 수 있습니다.동역학, 우리는 이 방법을 사용하여 박테리아 감염에 대한 초파리 멜라노가스터의 면역 방어를 측정하고 있지만 다른 곤충에도 적용할 수 있으며 바이러스나 곰팡이와 같은 다른 유형의 병원체를 사용할 수 있습니다.

사람들이 이 방법을 처음 배울 때 경험하는 일반적인 문제는 파리에게 너무 많은 부상을 입힐 수 있으며, 이로 인해 대조군에서도 과도하게 높은 사망률을 초래할 수 있다는 것입니다. 이 방법의 시각적 시연은 파리에 대한 피해를 최소화하면서 감염을 수행하는 방법을 배우는 데 중요합니다. 우리의 숙주 종 oph melanogaster는 너무 작기 때문에 감염은 현미경으로 수행해야하며, 이는 기술의 초기 복잡성을 추가합니다.

그러나 우리는 이 기술을 소규모로 시연하면 파리에 대한 경험이 제한된 과학자들조차 접근할 수 있을 것이라고 믿습니다. 실험을 시작하려면 이전에 준비된 마스터 플레이트에서 단일 콜로니를 선택하고 멸균 배지 플라스크를 접종합니다. 박테리아를 섭씨 37도에서 밤새 고정상으로 성장시킵니다.

일단 배양물이 정지되는 단계를 도달하면, 온화하게 5, 000 시간에 3 분 동안 탁상용 분리기에 있는 배양물의 600 마이크로리터에서 세포를 펠릿으로 만듭니다. G를 버린 다음 Rena와 Resus를 버립니다. 1000마이크로리터의 멸균 인산염 완충 식염수 또는 PBS에 박테리아를 현탁시킵니다.

다음으로, 원하는 600나노미터 흡광도를 얻기 위해 재부유 세포를 멸균 PBS에 희석하고 이 현탁액을 사용하여 파리를 감염시킵니다. 빌린 규산염 유리 모세관을 당겨 유리 바늘을 준비하고 집게를 사용하여 바늘 끝을 부러뜨려 직경 50마이크로미터의 구멍을 만듭니다. 그런 다음 천장 O-링과 큰 딤플이 바깥쪽을 향하도록 하는 흰색 스페이서를 인젝터의 금속 플런저에 놓습니다.

30게이지 바늘이 있는 주사기를 사용하여 유리 바늘에 미네랄 오일을 채웁니다. 그런 다음 채워진 유리 바늘을 콜릿에 넣고 바늘의 뭉툭한 끝에서 1mm 떨어진 바닥에 더 큰 O-링을 놓습니다. 바늘을 금속 플런저에 밀어 넣고 고정될 때까지 콜릿을 부드럽게 조입니다.

인젝터에서 미네랄 오일을 제거하고 바늘에 소량의 오일을 남겨 인젝터와 박테리아 현탁액 사이의 장벽 역할을 합니다. 미네랄 오일, 박테리아 현탁액 내부 또는 두 액체 사이에 기포가 없는지 확인하십시오. 그런 다음 주입기를 주입을 위해 원하는 부피로 설정합니다.

모세관 바늘 끝을 멸균 PBS 튜브에 조심스럽게 삽입하고 주입기의 주입 버튼을 눌러 주입기 바늘을 채워 상처 제어 장치를 생성합니다. 마취된 파리에게 멸균 PBS를 복부 측면 표면의 전복부에 주입하고, 주입된 파리를 새 배지가 있는 새 바이알에 넣고, 파리가 마취에서 회복하기 전에 음식에 달라붙는 것을 방지하기 위해 바이알을 옆으로 눕힙니다. 다음으로, 주입기에서 남아 있는 멸균 매체를 꺼내고 동일한 바늘에 박테리아 현탁액을 다시 채웁니다.

절차를 반복하고 파리에게 박테리아 현탁액을 주입합니다. 또는 패혈성 핀 찌르기에 의해 감염이 전달될 수 있습니다. 감염 핀을 준비하려면 200마이크로리터 마이크로 피펫 팁의 끝을 녹이고 0.15mm 곤충 므누신 핀을 용융된 플라스틱에 삽입합니다.

플라스틱에서 뻗어 나온 0.5cm의 핀으로 핀이 제자리에 고정되도록 플라스틱이 굳어지도록 하고 이산화탄소로 파리를 마취하고 날개와 다리의 부착 부위를 피하면서 흉부의 흉골 흉막판에 있는 파리를 바늘로 찌릅니다. 부드러운 집게를 사용하여 미세한 핀에서 파리를 제거합니다. 각 파리를 찌르는 사이에 핀을 박테리아 현탁액에 담그십시오.

찔린 파리를 새 플라이 배지와 함께 새 바이알에 넣고 모든 파리가 마취에서 회복될 때까지 바이알을 옆으로 눕힙니다. 감염된 파리의 부분 집합을 얼음 위의 개별 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다. 각 튜브에 250마이크로리터의 PBS를 추가하고 유봉을 사용하여 파리를 균질화합니다.

다음으로 나선형 플래터를 사용하여 LB 폭기염에 균질산염을 플레이트화합니다. 또는 직렬 희석에 의해 균질산염을 도금합니다. 각 플라이 균질액을 96의 첫 번째 행으로 옮깁니다.

웰 플레이트를 만들고 멀티 채널 피펫을 사용하여 나머지 줄의 각 웰에 90마이크로리터의 PBS를 채웁니다. 플라이 균질산염이 포함된 첫 번째 줄에서 10마이크로리터를 취하고 균질액을 두 번째 줄에 분배합니다. 균질산염을 완전히 혼합하기 위해 최소 10회 위아래로 파이프를 연결하십시오.

그런 다음 10 마이크로 리터의 균질액을 가져 와서 다음 행으로 옮깁니다. 맨 아래 행부터 시작하여 나머지 행을 사용하여 이 절차를 반복합니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 각 웰에서 10마이크로리터를 취하여 LB 플레이트에 넣습니다.

샘플이 서로 접촉하지 않는 개별 스폿으로 분배되었는지 확인합니다. 각 행에서 모든 웰이 샘플링될 때까지 이 단계를 반복하여 LB 플레이트에 희석 내림차순으로 분주합니다. 어떤 도금 방법을 사용하든 군체가 작고 눈에 띄지 않도록 플레이트가 과도하게 자라지 않도록 주의하십시오.

인큐베이터에서 플레이트를 제거합니다. 실험용 박테리아가 눈에 보이는 군체를 성장시키면 초파리의 군체가 생기기 전에 약 24시간 후에 나선형 플레이트에서 장내 미생물총(microbiota)을 볼 수 있게 됩니다. 플레이트에 있는 콜로니의 수와 위치를 기반으로 균질산 밀리리터당 박테리아 부하를 추정할 수 있는 자동화된 콜로니 카운터를 사용하여 성장하는 콜로니를 계산합니다.

스폿 플레이트의 경우, 30-300개의 콜로니가 포함된 희석액에서 각 플라이의 콜로니를 수동으로 계산하고 원래 균질산염의 밀리리터당 박테리아 수를 계산합니다. 파리는 다양한 광학 밀도를 포함하는 50나노리터의 박테리아 현탁액을 주입했으며 즉시 균질화되고 도금된 감염 용량은 주입에 사용된 박테리아 현탁액의 광학 밀도에 따라 다릅니다. 초기 박테리아 부하는 주입된 초기 OD와 강한 상관관계가 있습니다.

이 프로토콜을 통해 다양한 유형의 감염을 관찰할 수 있습니다. 파리는 프로비덴시아 레이(Providencia rei)에 감염되었는데, 이 감염은 20일 이상 지속되는 만성 치사성 아감염을 일으킬 수 있습니다. 대장균에 감염된 파리는 6시간 이내에 감염이 완치됩니다. 감염 후.

면역 체계의 유도는 RNA 분리 및 항균 펩티드 전사체의 후속 Q rtpcr R을 통해 유사하게 추정할 수 있지만, 항균 펩타이드의 제어하에 GFP를 발현하는 양이 적은 파리입니다. 유전자 프로모터는 일단 마스터되면 면역 체계의 유도를 시각화하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술은 시간당 수백 마리의 파리를 감염시킬 수 있습니다.

감염된 후 파리에서 fity 학습 능력, 대사 상태 또는 상상할 수 있는 거의 모든 다른 특성을 포함하여 여러 표현형을 측정할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 초파리, 멜라노가스터에 강력하고 반복 가능한 박테리아 감염을 전달하는 방법과 이후에 감염 중증도를 측정하고 숙주 면역 반응을 정량화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 특정 박테리아가 인체 건강에 위험을 초래할 수 있다는 것을 잊지 마십시오.

적절한 생물 안전 절차를 따르고 감염된 파리가 탈출하지 못하도록 적절한 격리 조치가 마련되어 있는지 확인하십시오. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.