Name: 전신 세균 감염 및 면역 방어 표현형에 초파리 melanogaster의 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: 배우세요 Drosophila melanogaster에서 세균 감염을 유도하고 면역 반응을 정량화하는 방법을. 나노 인젝터를 사용하여 감염을 전달하고, 사후 사망률과 세균 부하를 측정하며, 항균 펩타이드 유전자 발현을 분석하여 선천성 면역을 연구합니다.

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우리는 이러한 프로토콜을 검토하고 테스트하는 데 도움을 준 전체 Lazzaro 실험실, 특히 Susan Rottschaefer에게 감사드립니다. 이것은 그들의 축적된 전문 지식의 산물입니다. Lazzaro 실험실에서의 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 R01 AI083932 및 R01 AI064950 보조금으로 지원됩니다.

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</ol>

저자 중 누구도 경쟁하는 이해관계나 상충되는 이해관계를 가지고 있지 않습니다.

여기에 설명 된 절차는 초파리의 엄격하고 높은 품질의 감염을 산출한다. 도시 된 예는 주로 비던 레트 게리와 E 감염에 초점을 맞추고 대장균하지만 프로토콜 적응력이며 호스트 사육 및 관리 조건의 범위에서 다양한 세균 감염에 적용될 수있다. 최적의 실험 방법의 세부 사항은 감염에 사용되는 세균 숙주의 유전자형, 전반적인 실험 조건에 의존 할 것이다. 그것은 강력하게 새로운 실험 조건 더 야심 찬 프로젝트를 시작하기 전에 파일럿 테스트하는 것이 좋습니다. 좋은 출발점은 100 배의 범위에서 세 감염 량을 테스트하는 것이다. 플라이 100 균체 - 매우 독성이 강한 병원균은 종종 최상의 10 정도의 매우 낮은 감염성 투여 량으로 도입된다. 더 온건 한 병원균은 FL 당 약 1,000 박테리아의 높은 용량으로 주입 될 수있다y 및 비 병원균은 박테리아 플라이 10,000만큼 높은 용량으로 주입 될 수있다. 그것은 세로 시계열상에서 병원균 부하 호스트 사망률 면역계 활성을 추적하여 새로운 감염의 역학을 정의하는 것이 유익하다. 병원체로드 및 호스트 유전자 발현의 측정이 파괴 분석이기 때문에, 그것을 측정 할 때마다 포인트에 대한 실험의 초기에 뚜렷한 파리를 감염시킬 필요가있다. 바늘로 한 번 찌르기 또는 마이크로 모세관 기반 주입을 사용할지 여부를 결정할 때, 이것은 장점과 한계 각 접근법에 존재 주목하는 것이 중요하다. 모세관 주입 모두 적당한 팽압을 증가시키고 염 또는 현탁 또는 담체에 용해 된 다른 분자를 도입 플라이으로 액체의 부피를 도입한다. 모세관 주입은 필요한 장비의 주입 시설 또는 구매에 액세스 할 수 있어야합니다. 정화조 바늘로 한 번 찌르기가 더 특별 장비 및 소개가 필요하지 않습니다무시할 플라이에 용지와는 일반적으로 날아간 다수의 감염에 더 효율적이다. 그러나 바늘로 한 번 찌르기 감염은 모세관 주입 달성 할 수 감염 량을 통해 정밀하게 제어 할 수 없습니다. 본 프로토콜은 기계적 주입량을 조절 사출 장치에 집중하지만, 가압 된 공기의 이산 펄스에 기초하여 주입 시스템도있다. (20, 21)이 일반적으로 장치가 여기에 추천보다 비싸며 각 공기 펄스의 보정을 필요 순서대로 바늘 일관된 주입 볼륨을 확인합니다. 파리는 야생에서 박테리아와 체계적으로 감염 될 방법에 대한 상당한 논쟁하지만 약간의 데이터가 있습니다. 일부 연구자들은 초파리가 병원성 박테리아를 섭취 할 때 자연 감염의 대부분이 발생 박테리아 이후 전신 감염을 설정하기 위해 장을 탈출 할 수있는 멋 부리다. 그러나, FE 매우있다알려진 W 박테리아는 D의 장을 통과 할 수 있도록 melanogaster의,이 기능을 수행하는 사람들은 파리 (22, 23)에 매우 치명적이다. 또 다른 이론은 실패 포식 시도 나 ectoparasitic 진드기의 공격으로부터 탈출을 통해 cuticular 부상을 유지 정기적으로 운항하는 것입니다. 이 가설은 야생 D의 빈번한 수집에 의해 지원됩니다 치유 상처 (게시되지 않은 관찰)을 가리킨다 melanization 명소 베어링 melanogaster의. 진드기 초파리 24 세균 감염을 송신하는 것으로 나타났다 진드기 남긴 상처 이차적 꿀벌 25 세균에 의해 감염 될 수있다. 그러나 D의 중심 진드기 또는 기타 기회 감염의 자연 주파수 표피 침해 통해 melanogaster의는 알려져 있지 않다. 여기에 설명 된 프로토콜은 직접 상피 장벽 또는 행동 면역 글로불린을 무시 정량 주입을 통해 체액에 박테리아의 도입을 허용NITY. D.에 병원성 박테리아를 공급하기위한 방법 이 Vodovar melanogaster의 외. 22 Nehme 외. (23)에 기재되어있다. 많은 곤충 병원성 박테리아는 연구자들이 편안하게 그들과 함께 작업 할 수 있도록, 거의 또는 전혀 인간의 건강에 위험을 초래할. 또한, 소수의 세균 실험의 개입없이 접촉에 초파리를 감염 할 수있는 능력 때문에 오염 된 표면을 통해 실험을 통해 세균 감염의 &quot;전염병&quot;확산의 위험이 있거나 일반적으로 매우 낮은 파리를 탈출했다. 그럼에도 불구하고, 적절한 봉쇄 조치가 탈출 감염된 파리를 방지하기 위해 장소에서 어떤이 파리를 탈출 탈환을 위해 있는지 확인하는 것이 좋습니다. 실험실에서 사용되는 병원균의에 상응하는 생물학적 안전 수준이 장착되어야하며, 미생물학 표준 모범 사례를 채용해야한다. 실험 infecti여기에 설명 된 방법에 임의의 박테리아의 용량을 가진 초파리 melanogaster의 감염 수 있습니다. 감염이 확립되면, 세균 증식이나 간극의 동역학을 측정하는 호스트 사망률을 추적하고, 숙주 면역계의 유도를 분석하기 쉽다. 감염된 초파리 용이하게 형성되거나 또는 감염에 의해 형성되는 생리 기능의 테스트를 포함하는 다른 표현형 분석을 거치게 될 수있다. 설명 된 절차는 저렴 상대적으로 적은 특수 장비를 필요로하고, 쉽게 연구 및 교육 연구소의 폭에 걸쳐 다양한 프로젝트에 사용하기에 순종하고, 알게된다.

과일 초파리 비행은 실험 조작에 매우 의무가 있으며, 넓은을 개발했다 광범위한 과학계에 의해 백업됩니다 기능과 면역 방어. 초파리의 진화 저렴하고 뒤쪽으로 쉽게 공부를위한 최고의 모델 생물 중 하나입니다 연구 도구의 배열. 선천성 면역의 여러 측면은 수신자 같은 수용체와 NF-kB의 가족 전사 인자, JAK / STAT 신호 및 JNK 경로의 반응에 의해 매개 신호 전달을 포함, 곤충, 포유류 사이에 보존되어있다. 1,2 이들 유전자 및 경로 수의 기능 D에 조회 할 melanogaster의 돌연변이를 사용하여 또는 RNAi의 그 증감 경로 활동 knockdowns 3 -. 또한 6 초파리 진화 생활사 이론의 맥락에서 비롯한 감염 질환의 생리적 영향을 연구하기 위해 사용될 수있다 (7).- 9 모든 그러한 연구는, 그러나, 확실하게 정의 된 처리 조건 하에서 실험 파리 감염 능력에 의존한다. 여기에 설명 된 절차는 초파리에 강력하고 반복적 인 세균 감염을 제공하고 이후 감염의 심각도를 측정하고 호스트 면역 반응을 정량화하기위한 방법 론적 프레임 워크를 제공합니다. 초파리는 자연과 실험적으로 세균, 곰팡이, 바이러스, 선충과 포식 기생자 말벌을 포함 기생충과 병원균의 다양한에 감염 될 수있다. 현재의 프로토콜은 전신 세균 감염을 제공에 초점을 맞추고 있습니다. 많은 다른 세균 감염 파리 사용될 수 있으며, 실험자의 선택은 요구되는 정밀한 과학 질문에 기초한다. 예를 들어, 인간 임상 분리가 박테리아 병원성 메카니즘 (10)을 연구하기 위해 이용 될 수 있거나, 생태 학적으로 중요한 균주 preferre 수있다진화 연구를위한 D. 11 일부 박테리아는 D의 유능한 병원균은 melanogaster의, 감염에 증식 및 호스트 질병 또는 사망의 원인. 다른 박테리아를 효과적으로 호스트의 면역 시스템에 의해 관리하고 몇 일 이내에 삭제됩니다. 이 예제에서, 비던 레트 게리 호스트 사망을 야기하고 생존 호스트에 계속. 대장균이 숙주 면역계에 의해 클리어되지 않은 병원체로 사용될 수있는 증식 성 병원체로서 사용될 것이다. 감염은 직접 플라이의 체강 내에 세균의 도입에 의해 확립 될 것이다. 이러한 접근 방식에 관계없이 송신 고유 모드의 전신 감염의 조사를 허용 상피 장벽 보호 동작을 우회. 실험적으로 전신 감염을 설정하기위한 두 가지 주요 방법이 있습니다. 첫 번째에서 nanoinjector하고 뽑아 유리 모세관 바늘의 정확한 수를 주입하는 데 사용됩니다파리에 박테리아. 이 방법은 감염 투여 량의 넓은 동적 범위를 허용하고 매우 정량적으로 반복되는 장점을 갖는다. 두 번째 방법은 오수 바늘로 한 번 찌르기 감염을 제공하는 것입니다. 이러한 접근 방식은 빠른 인 및 특별한 장치를 필요로하지 않는 장점을 갖는다. 감염이 성립되면, 이는 전신 병원체 부하 호스트 사망률 및 유도 성 면역계 활성을 측정하는 것이 가능해진다. 물론, 추가로 임의의 개수의 표현형을 생각할 감염된 D. 측정 될 수있다 후 감염 번식력 (12), 학습 능력 (13), 신진 대사 상태 (14), 또는 상상 할 수 있습니다 거의 모든 다른 특성을 포함 melanogaster의,.

<table><tbody><tr><td>인큐베이터</td><td>Powers Scientific, Inc</td><td>DROS52SD</td><td></td></tr><tr><td>Paintbrush</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 Flypads</td><td>FlyStuff</td><td>59-114</td><td></td></tr><tr><td>CO2</td><td>Airgas</td><td>CD FG50</td><td></td></tr><tr><td>초파리 사육 믹스&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6oz 정사각형 바닥 병, 폴리프로필렌</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-130</td><td></td></tr><tr><td>Nosterile Extra Large Cotton Balls</td><td>Fisher brand</td><td>22-456-882</td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>Olympus Corporation</td><td>SZ51</td><td></td></tr><tr><td>초파리 바이알 폴리스티렌</td><td>VWR international</td><td>89092-720</td><td></td></tr><tr><td>Nosterile 대형 면봉</td><td>Fisher brand</td><td>22-456-883</td><td></td></tr><tr><td>2 L 플라스크</td><td>VWR international</td><td>89000-370</td><td></td></tr><tr><td>투명 뚜껑이 있는 페트리 접시, 돌출된 능선; 100 x 15mm;</td><td>VWR international</td><td>25384-302</td><td></td></tr><tr><td>LB 한천, Miller</td><td>Difco</td><td>244520</td><td></td></tr><tr><td>Innoculing Loop</td><td>VWR international</td><td>80094-488</td><td></td></tr><tr><td>다양한 크기의 Rainin Clasic 피펫 0.1 &micro; l에서 2 &micro; L, 2 &마이크로; L에서 20 &마이크로; L, 20 &마이크로; L에서 200 &마이크로; L, 100 &마이크로; l에서 1,000 &micro; l</td><td>Rainin</td><td>PR-2 PR-20 PR-200 PR-1000</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 피펫 팁 (다양한 크기)</td><td>VWR international</td><td>30128-376 53503-810 16466-008</td><td></td></tr><tr><td>Luria Broth Base, Miller</td><td>Difco</td><td>241420</td><td></td></tr><tr><td>일회용 배양 튜브 붕규산 유리</td><td>VWR international</td><td>47729-576</td><td></td></tr><tr><td>S-500 Orbital 셰이커</td><td>VWR international</td><td>14005-830</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>VWR international</td><td>37001-300</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.4 10X</td><td>Invitrogen</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>SmartSpec 3000 분광 광도계</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2501</td><td></td></tr><tr><td>Semimicrovolume Cuvettes</td><td>Bio-Rad</td><td>223-9955</td><td></td></tr><tr><td>수직 모세관 풀러</td><td>Kopf 바늘 피펫 풀러</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3.5'' Nanojet II</td><td>Drummond Sientific Company</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II</td><td>Drummond Sientific Company</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>펜치</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 주사기</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>미네랄 오일, 화이트, 라이트</td><td>마크롱용 교체 유리 캡슐러리 Fine Chemicals</td><td>6358-10</td><td></td></tr><tr><td>Minutein 핀</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml&nbsp; 마이크로 원심분리기 튜브; 바다표범 의식</td><td>미국 사이언티픽 Inc.</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>전동 유봉; Talboys 실험실 교반기</td><td>Troemner</td><td>103</td><td></td></tr><tr><td>Talboys 고처리량 균질화기</td><td>OPS 진단</td><td>930145</td><td></td></tr><tr><td>5/32'' 연삭 공</td><td>OPS 진단</td><td>GBSS 156-5000-01</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie</td><td>Scientific indurstries inc.</td><td>G560</td><td></td></tr><tr><td>멀티채널 피펫터(10 & 패 - 300 &mu; l)</td> <td>Sartorius</td><td>730360</td><td></td></tr><tr><td>WASP2 Whitley Automated Spiral Plater</td><td>Microbiology International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ProtoCOL 자동 콜로니 카운터 / 플레이트 카운터 / 플레이트 리더&nbsp;</td><td>Microbiology International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Life Technologies</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>qPCR 튜브; 로우 프로파일 0.2 ml 8-튜브 스트립</td><td>Bio-Rad</td><td>TLS0801</td><td></td></tr><tr><td>qPCR 캡; 광학 평면 8-캡 스트립</td><td>Bio-Rad</td><td>TCS0803</td><td></td></tr><tr><td>RQ1 RNase-Free DNase</td><td>Promega</td><td>m610a</td><td></td></tr><tr><td>M-MLV 역전사 Promega</td><td></td><td>m170b</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Promega</td><td>U1240</td><td></td></tr><tr><td>Oligo-dT</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; SsoAdvanced SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5260</td><td></td></tr><tr><td>CFX Connect Real-Time PCR 검출 시스템</td><td>Bio-Rad</td><td>185-5200</td><td></td></tr><tr><td>RNasin 리보뉴클레아제 억제제</td><td>Promega</td><td>N2115</td><td></td></tr></tbody></table>

전신 세균 감염 및 면역 방어 표현형에<em&gt; 초파리 melanogaster의</em

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

열매는 초파리 melanogaster의 면역 방어의 기능과 진화 연구를위한 최고의 모델 생물 중 하나입니다 비행. 선천성 면역의 여러 측면은 곤충 및 포유 동물 사이에서 보존되고, 초파리 용이 유전자 및 실험적으로 조작 할 수 있기 때문에, 이들은 면역계 기능과 질병의 생리적 영향을 연구하기위한 강력하다. 여기에 입증 절차는 상피 장벽과 방어의 수동적 인 형태를 무시하고 전신 감염에 초점을 허용, 직접 체강에 박테리아의 도입에 의해 파리의 감염을 수 있습니다. 절차는 호스트 사망, 전신 병원체 부하와 호스트 면역 체계의 유도 정도의 측정 속도에 대한 프로토콜을 포함한다. 감염이 절차는 저렴하고 튼튼하고 정량적으로 반복하고, 기능적 유전학, 진화 생활사 및 생리학 연구에 사용될 수있다.

이 섹션은 1 감염 투여 량은 주사에 사용되는 박테리아 현탁액의 광학 밀도 변화 것을 보여준다. 초파리의 세균 감염 후에 얻을 수있다 결과를 도시하고, 확실하게 균질화 및 도금에 의해 추정 될 수 전달 용량은 주사 후 곧바로 날아 . 도 2에 도시 된 바와 같이, 다른 병원체는 용량 의존적 (도 2B)가 될 수있는 호스트 사망률 (도 2A) 및 호스트 사망률 상이한 레벨을 일으킬 수있다. 중요한 것은,이 프로토콜은 감염의 다른 유형이 달성 될 수 있습니다 : 프로 비던 시아 레트 게리 20 일 이상 (그림 3A) 동안 지속 만성, 하위 치명적인 감염을 일으킬 수 있습니다. 그러나 Escerichia 대장균 같은 다른 박테리아는 대부분 육시간 후 감염 (그림 3B)에서 호스트 플라이에 의해 삭제됩니다. 면역 SYS의 유도TEM은 항균 펩티드 사체 (도 4A 및 B)의 RNA 분리 및 후속 QRT-PCR을 통해 추정 할 수있다. 유사하지만 덜 정량적, 항균 펩타이드 유전자 프로모터의 조절하에 GFP를 발현하는 면역 시스템 (도 4C)의 유도를 가시화하는 데 사용될 수 날아간다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52613/52613fig1.jpg" /> . 그림 1 : 감염성 투여 량을 결정 파리 광학 밀도 (0.0001-0.05)의 범위를 커버하는 세균 현탁액의 50 NL 주사 하였다. 파리 바로 균질화되었고 주입에 의해 도입 된 박테리아의 수를 결정하는 도금. 초기 박테리아 하중이 강하게 초기 OD 주입과 상관 (R 2 = 0.96) <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52613/52613fig2.jpg" /> <strong&gt; 그림 2 :. 생존 세균성 병원체에 주입 후는 5 ~ 7 일 이전 남성은 세균 정지 또는 멸균 된 매체의 50 NL 주사와 생존을 위해 관찰 하였다. (A) 야생형 날아간 세 종 중 하나로부터 약 5,000 박테리아 주사 하였다. 호스트 사망률의 비율은 감염에 사용되는 박테리아 종에 크게 의존한다. 50, 500, 5,000 및 플라이 박테리아 - (B) 야생형 초파리는 Enterococcous 칼리스 세 가지 투여 량으로 주사 하였다. 면역계 돌연변이 및 야생형 동종 제어 라인은 약 500 부르크 홀데 리아 cepacia 주사 하였다 높은 감염성 투여 량 (C)로 감염된 경우 파리는 더 빨리 죽지. 페어 로그 - 순위 비교 야생형 비행 돌연변이보다 훨씬 더 잘 감염 (χ 2 = 59.02, DF = 1, P &lt;0.0001) 남아 있음을 보여준다. 그림 3 :. 사출 파리 후 세균 하중은 약 (A) 5,000 피 주사 하였다 레트 게리 (B) 3400 E. 대장균. 세균 부하는 주사 후 즉시 후속 다양한 시점에서 측정되었다. 각 데이터 포인트는 하나의 플라이의 박테리아 하중을 나타낸다. E.을 대장균 신속하게 피하면서 도전 호스트에서 지워집니다 레트 게리는 호스트의 삶의 나머지를 위해 계속 ,. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52613/52613fig4.jpg" /> 그림 4 : 주사 후 면역 유전자 발현의 유도. (A)는 파리 P. 50 NL 주사했다 복부 또는 흉부 중 하나에 레트 게리 또는 멸균 PBS, 또는 CO 제외하고 조작되지 남았다 <sUB는&gt; 2 마취. 여섯 시간 감염 후에, 파리는 유전자 QRT-PCR을 사용하여 측정 하였다 Diptericin RNA의 분리 및 발현을 위해 수집 하였다. (A) 발현 수준은 Diptericin의 비로 rp49 사체에 전사를 그래프 화하고, N (CO 2 컨트롤 바는 각각의 상태로부터 비의 평균 및 표준 오차를 나타낸다 (1)의 발현 수준을 가지는 것으로 정의되도록 스케일링 = 4). (B) 발현 수준은 표준 유도되지 않은 상태로 사용 CO 2 aesthesia 제어 파리에서 평균 C T 값이 ΔΔCT 그래프로된다. 막대는 각 조건에서 ΔΔC T의 평균과 표준 오차를 나타낸다 (N = 4). 주입으로 인해 사이트의 전사 유도의 차이 없지만, 패널 및 B의 비교 ΔΔC T 방식은 잠재적으로 유도 수준을 과대 평가하는 방법을 보여준다. (C)는 프로모터 P. 50 NL 주사 하였다 Diptericin의 통제하에 GFP를 발현 날아간 레트 게리 (OD = 0.1) 후 7 일 후에 군데. GFP 패널은 Diptericin의 활성화 세균에 감염된 파리에서 발기인하지만 미디어 주입 컨트롤을 나타내는 감염된 파리의 복부 지방 본문에 GFP의 발현을 보여줍니다. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 유전자 </td><td> 앞으로 </td><td> 역 </td></tr><tr><td> rp49 (또한 rpL32라고도 함) </td><td> 5 &#39;AGGCCCAAGATCGTGAAGAA 3&#39; </td><td> 5 &#39;GACGCACTCTGTTGTCGATACC 3&#39; </td></tr><tr><td> Diptericin </td><td> 5 &#39;GCGGCGATGGTTTTGG 3&#39; </td><td> 5 &#39;CGCTGGTCCACACCTTCTG 3&#39; </td></tr><tr><td> Drosomycin </td><td> 5 &#39;CTGCCTGTCCGGAAGATACAA 3 &#39; </td><td> 5 &#39;TCCCTCCTCCTTGCACACA 3&#39; </td></tr><tr><td> Defensin </td><td> 5 &#39;GAGGATCATGTCCTGGTGCAT 3&#39; </td><td> 5 &#39;TCGCTTCTGGCGGCTATG 3&#39; </td></tr><tr><td> Attacin </td><td> 5 &#39;CGTTTGGATCTGACCAAGG 3&#39; </td><td> 5 &#39;AAAGTTCCGCCAGGTGTGAC 3&#39; </td></tr><tr><td> Metchnikowan </td><td> 5 &#39;AACTTAATCTTGGAGCGATTTTTCTG 3&#39; </td><td> 5 &#39;ACGGCCTCGTATCGAAAATG 3&#39; </td></tr></tbody></table> 표 1 : QRT-PCR 프라이머.

Drosophila melanogaster는 선천성 면역 체계와 감염 및 질병의 생리학적 결과를 연구하기 위한 뛰어난 모델 유기체입니다. 이 프로토콜은 강력하고 정량적으로 반복 가능한 박테리아 감염을 D. melanogaster에 전달하는 방법과 이후에 감염 중증도를 측정하고 숙주 면역 반응을 정량화하는 방법을 설명합니다.

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the premier model organisms for studying the function and evolution of immune defense. Many aspects of ...

이 절차의 전반적인 목표는 강력하고 반복 가능한 박테리아 감염을 초파리, 멜라노가스터에 전달한 다음 감염의 중증도를 측정하고 숙주 면역 반응을 정량화하는 것입니다. 이것은 먼저 나노 주입기를 사용하여 박테리아 감염을 파리에 전달함으로써 이루어집니다. 시간이 지남에 따라 감염 후 폐사를 추적할 수 있으며, 감염된 파리를 균질화하고 존재하는 박테리아의 수를 측정하여 언제든지 전신 박테리아 부하를 결정할 수 있습니다.숙주 면역 방어는 항균 펩타이드 유전자의 발현 수준을 측정하여 정량화할 수 있으며, 궁극적으로 박테리아 감염의 정량화 및 특성화를 통해 확인할 수 있습니다. 초파리에서는, melanogaster는 유전과 환경 요인이 파리의 면역 능력을 어떻게 변화하는지 시험하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이 방법은 숙주의 유전 및 환경 요인이 면역 능력에 미치는 영향 또는 감염에서 뚜렷한 박테리아가 어떻게 다른지와 같은 곤충 면역 분야의 주요 질문을 해결하는 데 사용할 수 있습니다.동역학, 우리는 이 방법을 사용하여 박테리아 감염에 대한 초파리 멜라노가스터의 면역 방어를 측정하고 있지만 다른 곤충에도 적용할 수 있으며 바이러스나 곰팡이와 같은 다른 유형의 병원체를 사용할 수 있습니다.사람들이 이 방법을 처음 배울 때 경험하는 일반적인 문제는 파리에게 너무 많은 부상을 입힐 수 있으며, 이로 인해 대조군에서도 과도하게 높은 사망률을 초래할 수 있다는 것입니다. 이 방법의 시각적 시연은 파리에 대한 피해를 최소화하면서 감염을 수행하는 방법을 배우는 데 중요합니다. 우리의 숙주 종 oph melanogaster는 너무 작기 때문에 감염은 현미경으로 수행해야하며, 이는 기술의 초기 복잡성을 추가합니다.그러나 우리는 이 기술을 소규모로 시연하면 파리에 대한 경험이 제한된 과학자들조차 접근할 수 있을 것이라고 믿습니다. 실험을 시작하려면 이전에 준비된 마스터 플레이트에서 단일 콜로니를 선택하고 멸균 배지 플라스크를 접종합니다. 박테리아를 섭씨 37도에서 밤새 고정상으로 성장시킵니다.일단 배양물이 정지되는 단계를 도달하면, 온화하게 5, 000 시간에 3 분 동안 탁상용 분리기에 있는 배양물의 600 마이크로리터에서 세포를 펠릿으로 만듭니다. G를 버린 다음 Rena와 Resus를 버립니다. 1000마이크로리터의 멸균 인산염 완충 식염수 또는 PBS에 박테리아를 현탁시킵니다.다음으로, 원하는 600나노미터 흡광도를 얻기 위해 재부유 세포를 멸균 PBS에 희석하고 이 현탁액을 사용하여 파리를 감염시킵니다. 빌린 규산염 유리 모세관을 당겨 유리 바늘을 준비하고 집게를 사용하여 바늘 끝을 부러뜨려 직경 50마이크로미터의 구멍을 만듭니다. 그런 다음 천장 O-링과 큰 딤플이 바깥쪽을 향하도록 하는 흰색 스페이서를 인젝터의 금속 플런저에 놓습니다.30게이지 바늘이 있는 주사기를 사용하여 유리 바늘에 미네랄 오일을 채웁니다. 그런 다음 채워진 유리 바늘을 콜릿에 넣고 바늘의 뭉툭한 끝에서 1mm 떨어진 바닥에 더 큰 O-링을 놓습니다. 바늘을 금속 플런저에 밀어 넣고 고정될 때까지 콜릿을 부드럽게 조입니다.인젝터에서 미네랄 오일을 제거하고 바늘에 소량의 오일을 남겨 인젝터와 박테리아 현탁액 사이의 장벽 역할을 합니다. 미네랄 오일, 박테리아 현탁액 내부 또는 두 액체 사이에 기포가 없는지 확인하십시오. 그런 다음 주입기를 주입을 위해 원하는 부피로 설정합니다.모세관 바늘 끝을 멸균 PBS 튜브에 조심스럽게 삽입하고 주입기의 주입 버튼을 눌러 주입기 바늘을 채워 상처 제어 장치를 생성합니다. 마취된 파리에게 멸균 PBS를 복부 측면 표면의 전복부에 주입하고, 주입된 파리를 새 배지가 있는 새 바이알에 넣고, 파리가 마취에서 회복하기 전에 음식에 달라붙는 것을 방지하기 위해 바이알을 옆으로 눕힙니다. 다음으로, 주입기에서 남아 있는 멸균 매체를 꺼내고 동일한 바늘에 박테리아 현탁액을 다시 채웁니다.절차를 반복하고 파리에게 박테리아 현탁액을 주입합니다. 또는 패혈성 핀 찌르기에 의해 감염이 전달될 수 있습니다. 감염 핀을 준비하려면 200마이크로리터 마이크로 피펫 팁의 끝을 녹이고 0.15mm 곤충 므누신 핀을 용융된 플라스틱에 삽입합니다.플라스틱에서 뻗어 나온 0.5cm의 핀으로 핀이 제자리에 고정되도록 플라스틱이 굳어지도록 하고 이산화탄소로 파리를 마취하고 날개와 다리의 부착 부위를 피하면서 흉부의 흉골 흉막판에 있는 파리를 바늘로 찌릅니다. 부드러운 집게를 사용하여 미세한 핀에서 파리를 제거합니다. 각 파리를 찌르는 사이에 핀을 박테리아 현탁액에 담그십시오.찔린 파리를 새 플라이 배지와 함께 새 바이알에 넣고 모든 파리가 마취에서 회복될 때까지 바이알을 옆으로 눕힙니다. 감염된 파리의 부분 집합을 얼음 위의 개별 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다. 각 튜브에 250마이크로리터의 PBS를 추가하고 유봉을 사용하여 파리를 균질화합니다.다음으로 나선형 플래터를 사용하여 LB 폭기염에 균질산염을 플레이트화합니다. 또는 직렬 희석에 의해 균질산염을 도금합니다. 각 플라이 균질액을 96의 첫 번째 행으로 옮깁니다.웰 플레이트를 만들고 멀티 채널 피펫을 사용하여 나머지 줄의 각 웰에 90마이크로리터의 PBS를 채웁니다. 플라이 균질산염이 포함된 첫 번째 줄에서 10마이크로리터를 취하고 균질액을 두 번째 줄에 분배합니다. 균질산염을 완전히 혼합하기 위해 최소 10회 위아래로 파이프를 연결하십시오.그런 다음 10 마이크로 리터의 균질액을 가져 와서 다음 행으로 옮깁니다. 맨 아래 행부터 시작하여 나머지 행을 사용하여 이 절차를 반복합니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 각 웰에서 10마이크로리터를 취하여 LB 플레이트에 넣습니다.샘플이 서로 접촉하지 않는 개별 스폿으로 분배되었는지 확인합니다. 각 행에서 모든 웰이 샘플링될 때까지 이 단계를 반복하여 LB 플레이트에 희석 내림차순으로 분주합니다. 어떤 도금 방법을 사용하든 군체가 작고 눈에 띄지 않도록 플레이트가 과도하게 자라지 않도록 주의하십시오.인큐베이터에서 플레이트를 제거합니다. 실험용 박테리아가 눈에 보이는 군체를 성장시키면 초파리의 군체가 생기기 전에 약 24시간 후에 나선형 플레이트에서 장내 미생물총(microbiota)을 볼 수 있게 됩니다. 플레이트에 있는 콜로니의 수와 위치를 기반으로 균질산 밀리리터당 박테리아 부하를 추정할 수 있는 자동화된 콜로니 카운터를 사용하여 성장하는 콜로니를 계산합니다.스폿 플레이트의 경우, 30-300개의 콜로니가 포함된 희석액에서 각 플라이의 콜로니를 수동으로 계산하고 원래 균질산염의 밀리리터당 박테리아 수를 계산합니다. 파리는 다양한 광학 밀도를 포함하는 50나노리터의 박테리아 현탁액을 주입했으며 즉시 균질화되고 도금된 감염 용량은 주입에 사용된 박테리아 현탁액의 광학 밀도에 따라 다릅니다. 초기 박테리아 부하는 주입된 초기 OD와 강한 상관관계가 있습니다.이 프로토콜을 통해 다양한 유형의 감염을 관찰할 수 있습니다. 파리는 프로비덴시아 레이(Providencia rei)에 감염되었는데, 이 감염은 20일 이상 지속되는 만성 치사성 아감염을 일으킬 수 있습니다. 대장균에 감염된 파리는 6시간 이내에 감염이 완치됩니다. 감염 후.면역 체계의 유도는 RNA 분리 및 항균 펩티드 전사체의 후속 Q rtpcr R을 통해 유사하게 추정할 수 있지만, 항균 펩타이드의 제어하에 GFP를 발현하는 양이 적은 파리입니다. 유전자 프로모터는 일단 마스터되면 면역 체계의 유도를 시각화하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술은 시간당 수백 마리의 파리를 감염시킬 수 있습니다.감염된 후 파리에서 fity 학습 능력, 대사 상태 또는 상상할 수 있는 거의 모든 다른 특성을 포함하여 여러 표현형을 측정할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 초파리, 멜라노가스터에 강력하고 반복 가능한 박테리아 감염을 전달하는 방법과 이후에 감염 중증도를 측정하고 숙주 면역 반응을 정량화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 특정 박테리아가 인체 건강에 위험을 초래할 수 있다는 것을 잊지 마십시오.적절한 생물 안전 절차를 따르고 감염된 파리가 탈출하지 못하도록 적절한 격리 조치가 마련되어 있는지 확인하십시오. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

Parasitoid (기생) 말벌을 포함한 여러 곤충들의 천적의 주요 클래스를...

의 기생충 말벌에 대한 소개<em&gt; Drosophila</em&gt; 그리고 Antiparasite 면역 반응

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이 비디오는 박테리아 현탁액을 파리 체강에 나노 주입하여 박테리아 증식 및 감염을 초래하는 방법을 보여줍니다. 파리의 면역 반응은 일부 박테리아를 제거하는 반면, 다른 박테리아는 면역 제거를 벗어나 숙주 내에서 생존하여 감염을 일으킵니다.

나노 인젝터를 사용하여 박테리아 현탁액으로 파리를 감염시키는 것

이 비디오는 병원성 박테리아를 체강에 직접 도입하여 초파리를 감염시키는 기술을 보여줍니다. 이 방법은 상피 장벽 및 기타 수동적 방어 메커니즘을 우회하여 전신 감염을 유도할 수 있습니다. 감염 시, 파리의 폐사율을 모니터링하고 다운스트림 분석을 수행하여 결과로 발생하는 면역 반응을 평가합니다.

파리에 전신 세균 감염을 도입하는 패혈성 바늘찌 기술

이 비디오에서는 Drosophila melanogaster의 흉부에 E. coli를 주입한 후 E. coli 박테리아 부하를 측정하는 기술을 보여줍니다.

Measuring E. coli Bacterial Load in Drosophila melanogaster following E. coli Infection(대장균 감염 후 Drosophila melanogaster의 대장균 박테리아 부하)

무균 및 무균 조건에서 초파리 melanogaster의를 양육하는 방법이 제공된다. 플라이 배아는, 차아 염소산 나트륨에 dechorionated 멸균 다이어트에 무균 적으로 전송하고, 밀폐 용기에 양육된다. 박테리아와식이 요법과 배아를 접종은 무균 협회에 이르게하고, 세균의 존재는 전신 초파리 균질 도금에 의해 확인된다.

과일 비행을 양육<em&gt; 노랑 초파리</em&gt; 무균 및 무균 조건에서

이 메서드는 3 차원 (3D) 모델 곤충 세포로 병원 체 침입을 시각화 하는 방법을 보여 줍니다. 초파리 애벌레에서 hemocytes 바이러스 성 또는 세균성 병원 체, ex vivo 또는 vivo에서감염 되었습니다. 감염 된 hemocytes 다음 고정 되었고 confocal 현미경 및 후속 3D 셀룰러 재건 이미징 스테인드.

미생물 감염 및 분석에 대 한 초파리 melanogaster 애벌레에서 Hemocytes의 추출

이 프로토콜에는 구두 노출 및 감염 세균성 병원 체, 과일 파리 초파리 melanogaster 하 고 전염 성 박테리아 헛간 창 자 감염을 다음의 수를 측정 하는 방법을 설명 합니다. 우리는 더 비행 생존 다음 구강 세균 감염에 면역 돌연변이의 효과 설명 합니다.

세균성 감염 및 Shedding 초파리 melanogaster 에

이 프로토콜에서는 성인 초파리 melanogaster 식 인식 및 미생물 감염의 계량에서 vivo에서 먹어서 분석 결과를 설명 합니다.

과일 파리, 초파리 melanogaster에 비보 먹어서 분석 결과 사용 하 여의 세포 면역 반응 평가

이 프로토콜은 소아 세포토균에 젊고 숙성된 Drosophila 멜라노가스터 혈구세포의 능력을 평가하고 정량화하는 데 사용되는 phagocytosis의 생체 내 분석방법을설명합니다.

인 비보 식세포 분석기를 사용하여 성인 Drosophila 멜라노가스터 혈구의 연령별 식세포 능력 평가

초파리 멜라노가스터 성인 파리는 숙주 항미생물 선천적 면역 반응 및 미생물 감염 전략의 기초가 되는 분자 메커니즘을 조사하기 위한 모델 유기체로서 광범위하게 활용되고 있다. D. melanogaster 유충 단계를 추가 또는 대안 모델 시스템으로서 촉진하기 위해, 애벌레 주입 기술이 기술된다.

초파리 멜라노가스터 유충 주입 프로토콜

배우세요 Drosophila melanogaster에서 세균 감염을 유도하고 면역 반응을 정량화하는 방법을. 나노 인젝터를 사용하여 감염을 전달하고, 사후 사망률과 세균 부하를 측정하며, 항균 펩타이드 유전자 발현을 분석하여 선천성 면역을 연구합니다.

전신 세균 감염 및 면역 방어 표현형에

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