말린된 피 명소-준비 및 Immunoassays 및 분자 기술 사용에 대 한 처리

이 절차의 전반적인 목표는 면역 분석 및 분자 기술에 사용될 건조된 혈액 반점을 준비하고 처리하기 위한 표준화된 프로토콜을 제공하는 것입니다. 이것은 먼저 모세혈관 혈액을 채취하여 필터 카드에 옮기는 방식으로 이루어집니다. 두 번째 단계는 하룻밤 동안 혈흔을 건조시키고 필터 카드의 원에서 6mm 펀치를 얻는 것입니다.

다음으로, 펀치에서 건조된 혈액의 이안은 최소 4시간 동안 셰이커의 완충액에 담궈서 달성됩니다. 그런 다음 용혈 EIT는 원심분리에 의해 파편에서 제거됩니다. 마지막 단계는 상업적으로 이용 가능한 면역 분석 및 분자 기술을 통해 B형 간염, C형 간염 및 인간 면역결핍 바이러스 감염의 혈청학적 및 분자 마커에 대한 허가된 EIT를 분석하는 것입니다.

셀룰러로 만든 필터 카드에 수집된 플롯을 사용한다는 아이디어는 100년 전에 시작되었습니다. 그럼에도 불구하고 이 방법을 처음 사용하는 사람들은 최종 분석을 위해 건조된 혈액 반점의 준비 및 처리로 구성된 전체 사전 분석 단계가 건조 혈액 반점 검사의 거의 모든 응용 분야에 대해 표준화되지 않았기 때문에 오늘날에도 종종 어려움을 겪을 것입니다. 이러한 배경을 감안할 때, 우리는 면역 분석 및 분자 기술에 사용될 건조된 혈액 반점의 준비 및 처리를 위한 포괄적이고 표준화된 단계별 프로토콜을 제안합니다.

이 방법론을 시각적으로 시연하는 것은 모세혈관 혈액을 제거하는 것과 같은 몇 가지 단계로 중요한 것으로 보입니다. 맞습니다. 필터 카드로 옮기거나 군중으로부터 적절한 펀치를 준비하는 것은 배우기가 쉽지 않기 때문에 결과적으로 이 기술을 처음 사용하는 개인은 의심할 여지 없이 시각적 표현의 이점을 얻을 수 있습니다.

우리 실험실의 기술자가 Nico의 손가락에서 모세혈관 혈액을 채취하여 처리 절차를 시연합니다. 얻은 혈액 반점은 피부 천자에 대한 분자 생물학적 진단을 위해 우리 실험실에서 이미 수년 동안 일하고있는 기술자 ko에 의해 이루어질 것입니다. 먼저 일회용 라텍스 고무 장갑을 착용합니다.

피부에 구멍을 뚫기 전에 환자는 손을 따뜻하게 해야 합니다. 손가락은 상단 천자 부위를 향한 혈류를 풍부하게하기 위해 크게 마사지됩니다. 그런 다음 팔머 쪽의 피부, 글을 쓰지 않는 손의 세 번째 또는 네 번째 손가락의 원위 지골 끝을 적절한 소독제로 청소하고 일회용 안전 란셋으로 피부에 구멍을 뚫습니다.

손가락은 중력에 의해 손가락 끝에 혈액이 모일 수 있는 위치에 있어야 합니다. 첫 번째 혈액 한 방울은 과도한 조직액이 포함되어 있을 수 있으므로 거즈 패드로 닦아내십시오. 천자 부위의 혈류를 증가시키기 위해 손가락을 다시 마사지한 후, 손가락 끝으로 표면을 직접 건드리지 않고 다음 방울을 필터 카드의 원 중 하나로 옮깁니다.

모세혈관 혈액의 다음 큰 방울이 손가락 끝에 형성되도록 하고 다음 원에 모이십시오. 채취하는 동안 필요한 모든 원이 채워지거나 혈류가 멈출 때까지 이 절차를 계속합니다. 혈액이 모세관 힘에 의해서만 필터의 질감에 스며들도록 합니다.

혈류가 필터 카드의 필요한 모든 원을 채우기에 충분하지 않은 경우 손가락을 과도하게 짜거나 젖을 짜지 마십시오. 혈류가 멈추면 손가락 끝에 붕대를 감고, 검사에서 혈흔을 건조시키기 위해 더 많은 혈액이 필요한 경우 다른 손가락에 두 번째 피부 구멍을 뚫고, 생물학적 위험 안전 캐비닛의 깨끗한 종이 타월에 필터 카드를 놓고 가급적이면 실온에서 밤새 말리십시오. 외부 열원이 없는 상태에서 건조 과정이 완료되면 혈액 반점이 균일하게 짙은 갈색을 띠고 더 이상 저장을 위한 붉은 부분이 보이지 않습니다.

습기로부터 표본을 보호하기 위해 1-2개의 건조제 봉지가 들어 있는 단일 가스 불침투성 지퍼 백에 여과지 카드를 넣습니다. 이 가방을 가능한 한 빨리 섭씨 영하 20도 이하의 냉동실로 옮기십시오. 현장 조건에서 냉동고를 사용할 수 없는 경우 섭씨 영하 4도 또는 주변 온도에서도 최대 14일 동안 보관할 수 있습니다.

9 0 3 등급 필터 카드 전송의 각 혈액에 흠뻑 젖은 원에서 일회용 6 밀리미터 장치로 한 지점을 펀칭하고, 모든 펀치 건조 혈액 반점은 단일 환자에서 12 개의 우물 중 하나의 우물로. 웰 플레이트는 0.05%트윈 20 및 0.08%아지드나트륨을 함유한 인산염 완충 식염수로 웰을 채웁니다. 분자 분석을 수행하기 위해 이 단계를 반복하여 건조된 혈액 반점 EIT의 두 번째 시리즈를 얻습니다.

그런 다음 세포 배양 플레이트를 실험실 셰이커에 놓고 펀치로 건조된 혈액 반점을 최소 4시간 동안 또는 가급적이면 하룻밤 동안 부드럽게 용출시킵니다. 다음날, 반점에는 혈액이 거의 없어지고 용혈성 상층액이 형성됩니다. 이 EITs를 마이크로 분리기 튜브로 옮긴 다음 10, 500배 G에서 2분 동안 원심분리를 합니다.

Ellucian 원심분리 EIT 중에 형성된 파편에서 나온 상등액은 이제 의도한 분석에 사용할 준비가 되었습니다. EIT의 첫 번째 시리즈는 혈청학적 검사를 위해 컵으로 옮겨집니다. 두 번째 시리즈는 PCR 분석을 위해 마이크로 튜브로 옮겨집니다.

시중에서 판매되는 분석을 사용하여 B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스 및 HIV 감염 마커에 대한 EIT를 조사하고 해당 제조업체의 지침을 주의 깊게 따르십시오. 마지막으로, 완전 자동화된 분석기에 대한 혈청학적 검사 결과가 시스템 화면에 표시됩니다. 건조된 혈액 반점의 준비 및 처리를 위해 제안된 프로토콜의 효과는 먼저 B형 간염 바이러스 표면 항원 측정과 관련하여 1,762개의 결합 혈청 건조 혈액 반점 쌍을 분석하여 평가되었습니다.

밀리리터당 0.05 국제 단위의 컷오프 값으로 EIT의 56.2%가 Sarah에서 얻은 결과에 비해 반응성이 있었기 때문에 분석 프로토콜이 수정되었습니다. 이는 B형 간염 바이러스 표면 항원 검사에서 14.7%의 위양성률에 해당합니다. 데이터의 수신기 작동 특성 분석에 따르면 임계값을 밀리리터당 0.15 국제 단위로 증가시키면 B형 간염 바이러스 표면 항원의 존재에 대한 혈청 건조 혈점 쌍을 조사할 때 B형 간염 바이러스 표면 항원 양성과 B형 간염 바이러스 표면 항원 양성을 이상적으로 분리할 수 있습니다. 두 개의 불일치만 얻어졌습니다.

두 명의 위음성 사라는 항바이러스 치료를 받는 환자에게서 유래했습니다. 전혈 EIT의 real-time PCR에 의한 H-B-V-D-N-A의 정성적 측정은 93%의 민감도를 산출하여 혈청 H-B-V-D-N-A 농도가 낮은 7개의 샘플은 검출되지 않았습니다. 건조된 혈액 반점 EIT에서 4개의 위음성 항 HCV 결과만 결정되었습니다.

각각의 C는 감염이 오래 전에 해결된 환자들에게서 채취되었을 가능성이 매우 높다. 건조된 혈액 반점 EIT에서 H-C-V-R-N-A 측정을 위한 100%의 분석 민감도는 H-C-V-R-N-A 증폭에 사용된 등온 전사 매개 증폭 접근법의 우수한 민감도를 나타냅니다. 완전 자동화된 시스템으로 건조된 혈액 반점 EIT에서 항 HIV 항체를 검출하면 분석 민감도가 100%가 됩니다.이 비디오는 비교적 높은 용리 부피가 사용되고 혈청 또는 혈장 검사를 위해 확립된 에세이 프로토콜의 수정이 다음과 같은 경우에도 모든 좁은 혈액 반점에서 B형 간염, C형 간염 및 HIV 감염의 혈청학적 및 분자 마커를 안정적으로 검출할 수 있음을 보여줍니다. 크게 변경되지 않았습니다.

그러나 전달된 결과는 또한 건조 혈액 반점 기술의 고유한 한계를 확인했습니다. 경우에 따라서는 그렇습니다. 또한 독일의 베를린과 에센 시에서 약물 및 만성 감염성 질환에 대한 연구의 파일럿 단계에서 534명의 활성 약물 사용자를 대상으로 현장 조건에서 테스트되었습니다.

얻은 결과는 독일의 6개 대도시에서 약물 연구의 주요 단계에 대한 테스트 알고리즘의 약간의 수정으로 이어졌습니다.