Name: 작은 분자 변조 차별화 및 후속 포도당 기아을 사용하여 인간 유도 만능 줄기 세포에서 고도로 정제 된 심근 세포의 유도 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: 학습하세요 인간 유도 만능 줄기 세포에서 작은 분자 변조와 포도당 기아를 이용해 고도로 정제된 심근 세포를 유도하는 방법을. 이 기술은 심혈관 질환 모델링과 약물 스크리닝에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 연구는 NIH/NHBI(U01 HL099776-5), NIH Director's New Innovator Award(DP2 OD004411-2), California Institute of Regenerative Medicine(RB3-05129), American Heart Association(14GRNT18630016) 및 Lucile Packard Foundation for Children 및 Stanford의 Child Health Research Institute(SMW)에서 수여하는 Endowed Faculty Scholar Award의 지원을 받았습니다. 또한 미국심장협회(American Heart Association)의 박사전 펠로우십 13PRE15770000 및 국립과학재단(National Science Foundation) 대학원 연구 펠로우십 프로그램 DGE-114747(AS)의 자금 지원에 감사드립니다.

주 :이 프로토콜에서 사용되는 모든 시약 벤더 정보가 표 1에 나열되어있다 및 재료 목록. 세포와 접촉하는 모든 솔루션과 장비는 멸균해야하며, 무균 기술 규격 제품을 사용한다. 달리 명시되지 않는 한 가습 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에서 모든 문화 배양을 수행합니다. 이 프로토콜에서, 모든 분화가되는 hiPSCs가 시딩 6- 웰 플레이트에서 수행된다. 분화 및 정제 후, 세포를 분해 할 수 있고, 다운 스트림 사용을 위해 플레이 팅. 1. 중간 준비 <ol><li> E8 매체의 경우, 각 미디어 구성 요소에 대한 스톡 용액 (NaHCO3을, L 아스코르브 산 -2- 포스페이트, 아 셀렌 산 나트륨, 트랜스페린, 인슐린, FGF2, TGFB1)을하고 -20 ℃에서 용액을 저장한다. DMEM / F12의 병에 원액을 적당량을 추가하고 소독 필터링합니다. 솔루션 CONCENTR주식 구성 요소 및 E8 매체에 대한 ATION 반응 설정은 표 1에서 찾을 수 있습니다. </li><li> 세포 외 매트릭스 솔루션의 경우, 4 ° CO / N에서 (일반적으로 10 ㎎ / ㎖에서 제공) 기저막 행렬을 해동. 인간 다 능성 줄기 세포가 알파 -6- 일 - 베타 - 인테그린 9를 사용하여이 물질에 잘 부착 할 수 있기 때문에 마트 리겔은 일반적으로 다 능성 줄기 세포 배양에 사용된다. 일단 차가운 얼음 피펫 팁 및 튜브를 사용하여 얼음에 2.25 MG (250 μL) 분취 량을 -80 ℃에서 분취 량을 저장, 해동. <ol><li> ECMS으로 판을 프리 코팅 할 때, 해동 및 얼음에 세포 외 기질 용액 (ECMS)을 나누어지는. (1)의 비율로 ECMS 빙냉 DMEM / F12 배지 믹스 : 얼음 200. 조기 ECMS 응고를 방지하기 위해 저온으로 유지하시오. </li></ol></li><li> 인슐린 매체없이 RPMI / B27를 들어, RPMI 미디어의 500 ml의에 B27 마이너스 인슐린 10 ㎖를 추가합니다. </li><li> 매체 (인슐린) RPMI / B27를 들어, insuli로 (B27 보충 10 ㎖를 추가N) 및 RPMI 매체에 500㎖의 펜 연쇄상 항생제 5 ㎖. </li><li> 낮은 포도당 매체의 경우, B27 보충 10ml의 포도당이없는 RPMI 미디어의 500 ml의에 펜 연쇄상 구균 항생제 5 ㎖를 추가합니다. </li><li> : 1 비율 동결 / 동결 보존 매체의 경우,도 9에서 디메틸 설폭 시드 (DMSO)와 함께 소 태아 혈청을 혼합한다. 동결 매체는 4 ° C에서 1 개월까지 저장할 수 있습니다. 참고 : 모든 매체가 여과하고 저장 4 ° C에서와 달리 명시되지 않는 한 이주 내에서 사용되어야한다. 달리 명시하지 않는 한 아래에 사용 된 모든 시약 / 솔루션 볼륨은 6 잘 판에서 단일 잘위한 것입니다. </li></ol> 2. ECMS로 6 웰 플레이트 중고 코팅 <ol><li> 다음 6 웰 플레이트 각 웰에 갓 ECMS 2 ㎖를 적용, 200 : 1의 비율로 빙냉 DMEM / F12의 미디어 (예, 마트 리겔) 기저막 매트릭스를 혼합하여 ECMS합니다. 잘 6 웰 플레이트의 각은 약 90 mg의 ECMS를 받게됩니다. </li><li> ECM을 품어S는 37 ° C에서 1 시간 동안 코팅 된 플레이트. 각 웰에서, 흡인하는 DMEM / F12 솔루션 세포를 도금 직전. 플레이트를 세포를 수신 할 준비가 될 것이다. </li></ol> 3. 해동 냉동 hiPSCs 참고 : 최적의 배양 및 동결 / 해동주기 다음 hiPSC-의 CM에 hiPSCs의 다운 스트림 분화 등의 원인이 밀접하게이 절차를 수행합니다. <ol><li> 6- 웰 플레이트의 각 웰에 대해 하나의 hiPSCs 바이알을 해동. 각각의 병에 대한 ROCK 저해제 (10 μM) 감기 E8 매체의 9 ml로 15 ML 원뿔 튜브를 준비합니다. ROCK 저해제는 냉동 보존 (10)를 다음과 hiPSCs의 생존을 향상시킵니다. 약 5mm 직경의 얼음 결정이 남아 때까지 세포를 해동 37 ° C의 물을 욕조에 튜브를 유지합니다. </li><li> 70 % 에탄올과 튜브의 외부를 스프레이. 멸균 층류 후드로 이동하기 전에 휴지와 병을 닦습니다. </li><li> 준비된 원뿔 튜브에 세포를 전송합니다. t을 씻어그는 E8 배지 500 μL 회 유리 병 같은 원추형 튜브에 세포를 해동 함유하는 배지를 옮긴다. 200 x g에서 4 분간 실온에서 원심 분리기. </li><li> 원심 분리 후 상층 액을 기음 부드럽게 ROCK 저해제 (10 μM)와 E8 매체의 2 ml의 세포 펠렛을 resuspend. 6 웰 플레이트 ECMS로 사전 코팅 잘 하나에 재현 탁 세포를 전송합니다. </li><li> 배양 24 시간 후 ROCK 저해제없이 E8 매체와 매체를 교체합니다. 세포는이 시간 준수해야합니다. </li></ol> hiPSCs 4.과 Passaging <ol><li> 일반적으로 6 웰 플레이트에서 75 % -80 %의 포화 상태에 도달 한 후 통과 hiPSCs. 문화 매체를 대기음. 신속하게 멸균 1 ㎖, RT PBS로 우물을 씻어. 대기음 PBS. <ol><li> 500 0.5 mM의 EDTA ㎕의 또는 1X 세포 분리 솔루션 (예를 들어, Accutase)를 첨가하고, 실온에서 1-7 분 동안 품어. EDTA 배양을위한 적절한 시간은 hiPSC 라인에 따라 달라집니다. 눈에 보이는 컬링 O를 볼 것을 예상가장자리 주위 식민지의 R 비후이 그 EDTA 또는 세포 분리 솔루션을 나타냅니다으로 제거 할 준비가되어 있습니다. </li></ol></li><li> EDTA 또는 셀 분리 솔루션을 기음. 10 μM의 ROCK 저해제로 보충 E8 매체의 1 ML을 추가합니다. 반복적으로 피펫 팅과 아래 P1000 피펫으로 식민지를 분사하여 잘에 hiPSC 식민지를 대체. 식민지 완료 후 5 ~ 10 세포 덩어리로 분리해야합니다. </li><li> 15 ML 원뿔 관에 ROCK 억제제 E8 매체의 1에 현탁 된 식민지를 전송합니다. </li><li> E8 매체에서 작은 덩어​​리로 큰 세포 덩어리를 방해. 세포를 희석하여 세포 현탁액 억제제 E8 매체의 적절한 볼륨. 희석 추가 매체 볼륨이 세포 밀도에 따라 우물의 수는 시드 할. 이상적으로, hiPSCs의 단일, 80 %의 합류가 잘 1:12 희석해야한다. <ol><li> CE의 기존 1 ml의 ROCK 저해제와 11 ml의 E8 매체를 추가전술 한 15ml의 원뿔형 튜브 LL 용액 1:12 희석액을 얻었다. </li></ol></li><li> 또한 (각 조각에 50-200 세포가 최선의 주위에) 작은 세포 조각에 세포 덩어리를 씹다. 이 세포 생존을 감소시키기 때문에 피 오버 분쇄하여. </li><li> 기음 미리 코팅 된 플레이트에서 ECMS 각 우물에 재현 탁 세포 2 ㎖를 추가합니다. 6 웰 플레이트의 웰 당 약 10 만 세포가 이상적입니다. 웰의 중앙에 세포의 클러스터링을 피하기 위해 잘 해결 고르게 분배하는 세포를 목표로한다. </li><li> 배양 24 시간 후, ROCK 저해제없이 E8 매체와 매체를 교체합니다. 세포가 80 % 합류가 될 때까지 배양 배지마다 24 시간을 변경합니다. 이어서, 세포를 다시 통과 할 준비가되었다. 그것은 일반적으로 80 % 포화 상태에 도달하는 통로 사이 3-6일 걸립니다. </li></ol> 5. 어는 hiPSCs 참고 : 최적의 배양과 엉덩이의 다운 스트림 분화 등의 원인이 밀접하게 다음 절차를 수행hiPSC-CM이에 SCS는 동결 / 해동 사이클을 다음과 같습니다. <ol><li> 세포주 이름, 셀 타입, 통로 번호 및 날짜와 함께 동결 극저온 튜브 레이블. 일반적인 지침으로, 6 웰 플레이트의 각 웰에 대해 하나의 유리 병을 사용합니다. ROCK 저해제 (10 μM)와 E8 매체의 9 ml로 가득 15 ML 원뿔 튜브를 준비합니다. 90 % FBS 10 % DMSO와 매체를 동결 준비 및 사용할 준비가 될 때까지 4 ° C에서 매체를 유지합니다. </li><li> , 문화 미디어를 대기음 500 0.5 mM의 EDTA ㎕의 또는 1X 세포 분리 솔루션을 추가하고 실온에서 2-7 분 동안 품어. EDTA 또는 세포 분리 용액 노출 기간은 세포주로 세포주 다르다. </li><li> 기음 EDTA 또는 세포 분리 솔루션입니다. E8 매체의 1 ML을 추가합니다. </li><li> 피펫 팅과 아래 P1000 피펫으로 식민지를 분사하여 잘 hiPSC 식민지를 대체. 식민지는 100보다 작은 세포 덩어리로 분리 할 수​​ 없습니다. E8을 함유하는 원뿔형 튜브에 제조 된 현탁 세포 이동. R 원심 분리기T 200 x g에서 4 분. </li><li> 뜨는을 기음과 펠렛에 차가운 동결 매체의 500 μl를 추가합니다. 1-2 회 피펫 팅하여 펠릿을 재현 탁. 세포 생존은 큰 덩어리에서 세포를 유지하여 개선된다. </li><li> 레이블이 극저온 튜브에 재현 탁 세포를 전송합니다. 신속 점진적 냉각을 위해 수 냉동 컨테이너 포함 이소프로판올로 튜브를 이동합니다. 후 장기간 저장을 위해 액체 질소로 셀을 전송, 24 시간 동안 -80 ° C에서 셀 용기를 보관. </li></ol> 인간의 IPSC 6. 심장 차별화 참고 : 추가 할 때 모든 미디어가 RT 적어도해야한다. <ol><li> EDTA 또는 1 배 세포 분리 솔루션을 분리 한 후, 약 10 만 차별화를위한 ECMS 코팅 6 웰 배양 접시에 인간의 iPSCs (세포 계대 절차와 동일한 절차를) 씨입니다. 세포가 85 % 컨 플루 언시에 도달 할 때, (6) 인슐린 매체없이 RPMI / B27으로 변화 매체μM GSK3 베타 억제제 CHIR99021 (치르)과 48 시간 동안 유지한다. </li><li> 48 시간 후, 인슐린 매체없이 RPMI / B27로 치르 함유 배지를 교체하고 (3 일까지) 24 시간 동안 혼자 남겨. </li><li> 3 일에서 5 μM의 Wnt 억제제 IWR1과 인슐린없이 RPMI / B27에 미디어를 변경하고 (5 일까지) 48 시간 동안 유지한다. 주 : 이전 연구 11에 기재된 바와 같이이 Wnt 억제는 또한, 다른 저분자 화합물을 사용하여 시도 될 수있다. IWR1 인해 그것이 11의 Wnt 신호 전달 억제에 효과적인 것으로 밝혀졌다 증가하는 범위로 다른 소분자 저해제의 Wnt상에서 선택 하였다. </li><li> 5 일에서 인슐린 매체없이 다시 RPMI / B27에 매체를 변경하고 (7 일까지) 48 시간 동안 둡니다. </li><li> 7 일에, (인슐린) RPMI / B27 매체와 매체를 교체하고 같은 매체 매 3 일 이후 매체를 교체합니다. 심근 세포의 자발적인 박동는 첫 날에 약 8 일에서 볼 수 있어야합니다10. </li></ol> 포도당 기아을 통해 인간의 심근 세포 7. 정화 <ol><li> 10 일 후 분화에서, 6 웰 플레이트에 2 ㎖의 저혈당 배지의 각 웰에서 배지를 변경하고 (13 일까지) 3 일간이 배지에서 세포를 유지한다. </li><li> 하루에 13에서, (인슐린) RPMI / B27 매체에 세포를 반환합니다. </li><li> 선택적으로, 포도당 기아 동안 비 심근 쉽게 분리를 허용, 문화 판에서 비 심근 세포를 풀고 도움이 포도당 기아의 두 번째 라운드 이전에 심근 세포를 replate. <ol><li> 13 일째, 대기음 매체에서, PBS로 한번 세척하고, 37 ° C에서 5 분 동안 세포 해리 효소의 500 μl를 사용하여 단일 세포로 세포를 해리. 특히, 효소 처리의 5 분 후, 수동으로 반복 셀 탈퇴 효소를 위로 끌어 당기 cardiomyo에 대해 그것을 분사하여 6 웰 플레이트에서 심근 세포를 해리 1,000 μL 피펫을 사용cyte 단일 층. 30 피펫 반복 최대 단일 세포로 심근 세포를 떼어 놓다해야 할 수 있습니다. </li><li> 세포 해리 단일 셀 형태 인 후 X g (200)에서 4 분 동안 세포 해리 효소 및 원심 분리기를 희석 인슐린 RPMI / B27 배지 5 ㎖를 가득 15ml의 원뿔형 튜브에 모든 세포를 수집한다. 기음과 상층 액을 제거한다. </li><li> 새로운 ECMS 코팅 6 웰 플레이트에 2 ml의 RPMI / B27 매체 접시와 세포를 다시 일시 중지합니다. 일반적으로 심근의 높은 포화 상태가 replating 동안 세포 생존에 도움이됩니다. replating시 최적의 생존을위한 새로운 6 자 접시 당 2 백만 세포를 replate하는 것을 목표로하고 있습니다. </li></ol></li><li> 14 일에, 두 번째 포도당 박탈주기 위해 다시 낮은 포도당 배지 2 ㎖에 매체를 변경합니다. 문화 3 일 이상이 낮은 혈당 상태에서 세포. 비 심근 세포의 대부분이 낮은 포도당 배양 조건에서 죽을 것이다. </li><li> 17 일에, R의 2 ㎖의 배지를 변경인슐린 PMI / B27 매체. 나머지 세포는 고도로 정제 된 심근 될 것입니다. 이러한 심근은 유전자 발현 분석, 약물 스크리닝, 대사 분석 및 다양한 다른 하류 분석법에 사용될 수있다. </li></ol>

<ol><li>Sharma, A., Wu, J. C., Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+cardiovascular+disease+modeling+and+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiovascular disease modeling and drug screening.</a> Stem Cell Research & Therapy. 4 (6), 150(2013).</li>
<li>Kehat, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cells+can+differentiate+into+myocytes+with+structural+and+functional+properties+of+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes.</a> The Journal of Clinical Investigation. 108 (3), 407-414 (2001).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+cardiomyocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).</li>
<li>Kattman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-specific+optimization+of+activin%2Fnodal+and+BMP+signaling+promotes+cardiac+differentiation+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines.</a> Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).</li>
<li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), E1848-E1857 (2012).</li>
<li>Sharma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+as+an+in+vitro+model+for+coxsackievirus+B3-induced+myocarditis+and+antiviral+drug+screening+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes as an in vitro model for coxsackievirus B3-induced myocarditis and antiviral drug screening platform.</a> Circulation Research. 115 (6), 556-566 (2014).</li>
<li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+by+modulating+Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+under+fully+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions.</a> Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).</li>
<li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+metabolic+flow+enables+large-scale+purification+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 12 (12), 127-137 (2013).</li>
<li>Rodin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+self-renewal+of+human+pluripotent+stem+cells+on+human+recombinant+laminin-511%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511.</a> Nature Biotechnology. 28 (6), 611-615 (2010).</li>
<li>Li, X., Meng, G., Krawetz, R., Liu, S., Rancourt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ROCK+inhibitor+Y-27632+enhances+the+survival+rate+of+human+embryonic+stem+cells+following+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+And+Development%22%5BJournal%5D)">The ROCK inhibitor Y-27632 enhances the survival rate of human embryonic stem cells following cryopreservation.</a> Stem Cells And Development. 17 (6), 1079-1085 (2008).</li>
<li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+promotes+highly+efficient+cardiac+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells%3A+the+matrix+sandwich+method%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method.</a> Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).</li>
<li>Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+de+novo+cardiomyocytes%3A+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+and+direct+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).</li>
</ol>

저자는 경쟁 이해관계를 선언하지 않습니다.

고순도 hiPSC 유래 심근 세포를 다량 획득하는 기본 심장 연구뿐 아니라 임상 및 병진 애플리케이션에 중요하다. 심장 분화 프로토콜은 작은 분자 변조 및 단층 기반의 방법 (5)에 마지막으로 심인성 성장을 이용하여 배아 몸 기반 방식에서 전환, 최근 몇 년 동안 엄청난 개선을 시행 샌드위치 방법 (12) - 매트릭스, 2 인자하고있다. 전술 한 프로토콜, 여기에서 설명한 프로토콜은 최고 및 소분자 치르 및 IWR 5,7-을 사용의 Wnt / β 카테닌 신호를 변조함으로써 hiPSC 상이한 세포주에 대한 가장 재현성 심장 분화 효율 표시. 특히, 미분화 hiPSCs는 Wnt 신호 억제제 IWR1와 GSK3 베타 억제제 치르 이후 심장 차별화 중배엽 차별화를 받아야하도록 유도했다. 이러한 순차적 인 단계Wnt 신호 변조, 심장 계통의 유도 단계에서 인슐린 결핍에 힘 입어, 고효율의 심장 분화되었다. 치르가 중배엽 유도에 사용되는 공통의 소분자 GSK3...

차 인간 심근 인해 침습 심장 생검 및 배양 때문에 열악 장기 세포 생존의 단일 셀에 대한 해리 곤란한 요구 사항으로 얻는 것이 곤란하다. 차 인간의 심근 세포, 환자 맞춤형 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포의 부족을 감안할 때 (hiPSC-CM) 기술은 기초 연구에 대한 강력한 대안 심근 소스뿐만 아니라 질병 모델링 및 약물 임상 및 번역 응용 프로그램으로 간주되었습니다 발견 한. 심근 세포로 다 능성 줄기 세포를 분화 이른 노력 배양체 EBS ()을 사용하여 분화 프로토콜을 채용하지만, EB의 셀 종종으로 25 % 이상이 심근 2,3- 치기 때문에이 방법은 제조 심장 근세포에서 비효율적이다. 비교적, 및 BMP4를 티빈 사이토 카인을 사용하여 단층 계 분화 프로토콜 EB를보다 높은 효율을 표시하지만이 프로토콜은, 여전히 상대적으로 비효율적이다 인간 다 능성 줄기 세포 (4)의 제한된 수의 비싼 성장 인자, 및 전용 기능을 필요로한다. 최근 고효율 hiPSC 단층 계 심근 분화 프로토콜의 Wnt / β 카테닌 5 변조 신호에 의해 개발되었다. 이러한 hiPSC-CMS는 심장 트로포 닌 T와 알파 티닌, 심근 6의 표준 마커 두 sarcomeric 단백질을 표현한다. 프로토콜은 여기에 설명이 저분자 계, 피더 무 세포 단일 층 분화 방법 5,7의 적응이다. 우리는 7-10일 (그림 1) 이후 hiPSCs에서 심근 세포를 구타 얻을 수 있습니다. 그러나 50 %는 세포를 치고 그 결과 심근 세포의 분화에 따라 지속적으로 면역 염색하는 등 심장 관련 트로포 닌 T와 알파 - 티닌과 같은 심근 특정 마커에 대한 부정적 비 심근 세포의 인구의 존재를 보여줍니다. 푸에rther가 심근 세포를 정제 및 비 심근 제거 이기종 분화 된 세포 집단은 일 대 다수의 매우 낮은 글루코스 배지 (도 2)로 처리하여 기아 글루코스 행 하였다. 이러한 처리는 선택적으로 낮은 글루코스 8 환경에서 생존하기 위해 주 에너지 원으로 락트산을 대사하는 심근 세포의 능력으로 인해 비 심근 아니지만 비 심근 세포를 제거한다. 이 정제 단계 이후에, 비 심장 근세포로 심근 세포의 비율이 40 % 증가 (도 3,도 4)이 관측되고, 이러한 셀 하류 유전자 발현 분석, 질병 모델링, 및 약물 스크리닝 분석에 사용될 수있다.

<table><tbody><tr><td>Matrigel (9-12 mg/ml)</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 배지</td><td>Invitrogen</td><td>11835055</td><td></td></tr><tr><td>Glucose free RPMI 배지</td><td>Invitrogen</td><td>11879-020</td><td></td></tr><tr><td>B27 Minus Insulin</td><td>Invitrogen</td><td>A1895601</td><td></td></tr><tr><td>B27 Supplement (w/ insulin)</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Pen-strep antibiotic</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>BenchMark</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D-2650</td><td></td></tr><tr><td>ROCK 억제제 Y-27632</td><td>EMD Millipore</td><td>688000</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Thermo Fisher</td><td>508306</td><td></td></tr><tr><td>IWR1</td><td>Sigma</td><td>I0161</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Millipore</td><td>SCR005</td><td></td></tr><tr><td>Cell lifter</td><td>Fisher</td><td>08-100-240</td><td></td></tr><tr><td>극저온</td><td>피셔(NUNC 튜브)</td><td>375418</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select Enzyme</td><td>Invitrogen</td><td>12563-011</td><td></td></tr></tbody></table>

작은 분자 변조 차별화 및 후속 포도당 기아을 사용하여 인간 유도 만능 줄기 세포에서 고도로 정제 된 심근 세포의 유도

Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포 (hiPSC-CMS)은 기초 연구와 번역 애플리케이션에 사용할 수 차 심근 세포의 부족을 해결하기위한 중요한 셀 소스되고있다. 심근에 hiPSCs 차별화, 배아 체 (EB) 기반 분화 및 성장 인자 유도를 포함하는 다양한 프로토콜들이 개발되었다. 그러나, 이들 프로토콜은 비효율적 정제 심근 세포를 생성하는 능력에서 매우 다양하다. 최근의 Wnt / β-catenin의 신호의 작은 분자 기반 프로토콜을 사용하는 변조는 높은 효율로 심장 분화를 촉진 것으로 나타났다. 이 프로토콜로, 분화 된 세포의 50 % 초과 -60 % 심장 트로포 닌 양성 심근 세포가 지속적으로 관찰했다. 또 심근 순도를 증가시키기 위해, 구체적으로는 분화 세포 대사 차이에 기초하여 비 - 심근 세포를 제거하는 기아 글루코스 행 하였다심근 세포와 비 심근 세포 사이의. 이 선택 전략을 사용하여, 우리는 지속적으로 분화 된 세포의 집단에서 비 심근에 심근의 비율보다 30 % 증가를 획득. 이러한 고순도 심근 질환 체외 모델링 연구 및 약물 스크리닝 분석법 인간 IPSC 기반 결과의 신뢰성을 향상한다.

hiPSC 차별화 동안 형태 학적 변화. 공급 장치가없는 접시에서 배양 hiPSC는 평면의 2 차원 식민지 증가했다. 약 85 %의 포화 상태에 도달하면, hiPSCs는 분화 (그림 1A) 6 μM 치르 처리 하였다. 세포 죽음, 정상 및 일반적인 현상은 상당량 치르 처리 24 시간 후에 관찰 하였다. 치르 처리 이틀 후, hiPSCs는 중배엽 운명 향해 분화하는 것을 계속했다. hiPSC 식민지에서 세포와 비교할 때 이러한 일이 세포에 대한 세포의 크기가 증가했다. 세포 수는 세포 분열 (그림 1B)를 통해 증가했다. 5 일째, 중배엽 세포 계보 심장 (심장 중배엽)을 지향 하였다. 이 때, 세포 유착과 특성, 가지 같은 구조 (그림 1C)을 형성하기 시작. 10 일에, 지사와 같은 구조는 매우 발음 및 심근 스타했다테드는 자발적으로 (그림...

여기에서는 소분자 조절 심장 분화와 포도당 결핍 매개 심근세포 정제를 결합하여 심혈관 질환 모델링 및 약물 스크리닝을 위해 정제된 심근세포를 생산할 수 있는 인간 심근세포 유도를 위한 강력한 프로토콜을 설명합니다.

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) have become an important cell source to address the lack of primary cardiomyocytes ...

이 절차의 전반적인 목표는 정제된 인간 유도만능줄기세포 유래 심근세포 집단을 생성하는 것입니다. 먼저, 인간 유도만능줄기세포를 세포 단층으로 배양하여 약 85% confluency에 도달하게 합니다. 그 후 Wnt 세포 신호 전달 경로를 활성화하는 저분자 화합물을 첨가하고, 중배엽 형성을 유도하기 위해 세포를 2일 동안 배양합니다.다음으로, 심장 중배엽 분화를 유도하기 위해 wind 세포 신호 전달 경로를 억제하는 저분자 화합물을 세포에 첨가합니다. 이후 세포를 이틀 더 배양합니다. 7일째가 되면 분화된 심근세포가 박동하기 시작하며, 이 불균일한 분화 세포 집단을 저포도당 세포 배양 배지에서 배양하여 심근세포를 선택적으로 정제합니다.마지막으로, 광학 현미경으로 세포를 육안 확인하고 유세포 분석법으로 분석하여 박동하는 심근세포의 고순도 집단이 생성되었는지 확인합니다. 저분자 화합물을 이용하는 다른 심근세포 분화 프로토콜과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 추가적인 포도당 결핍 단계를 적용한다는 점입니다. 이를 통해 포도당 이외의 세포 에너지원을 이용할 수 있는 심근세포를 정제할 수 있습니다.분화된 세포의 이질적인 집단으로부터 비심근세포를 선택적으로 제거할 수 있습니다. 이렇게 정제된 심근세포는 인 비트로(in vitro) 질환 모델링이나 고속 대량 약물 스크리닝과 같은 후속 연구 목적으로 활용될 수 있습니다. 실험 준비를 위해, 동반 텍스트에 설명된 대로 세포외 기질 용액(ECMS)으로 6-웰 플레이트를 사전 코팅하고, 냉동 보관된 인간 유도만능줄기세포(hiPSCs) 바이알을 해동하십시오.원심분리 후, 해동된 세포를 ROCK 억제제가 포함된 E eight 배지에 부유시킵니다. 그런 다음 바이알의 내용물을 ECM으로 사전 코팅된 6-웰 플레이트의 한 웰로 옮깁니다. 세포를 37 °C, 5% CO₂ 조건의 인큐베이터에 넣습니다.24시간 후에 세포가 부착됩니다. 배지를 rock inhibitor가 포함되지 않은 E eight 배지로 교체하십시오. 세포 배양을 계속하며 E eight 배지를 매일 교체해 줍니다.HI PSCs의 밀도가 75~80%에 도달하면 계대 배양을 수행합니다. 배양액을 빠르게 흡입하여 제거합니다. 웰을 1 mL의 멸균된 상온 PBS로 세척한 후, PBS를 흡입하여 제거합니다.그런 다음 0.5 millimolar EDTA 또는 다른 세포 분리 용액 500 microliters를 첨가합니다. 실온에서 1~7분 동안 배양하며 현미경으로 관찰하다가, 콜로니 가장자리가 말리거나 두꺼워지는 세포 분리 현상이 뚜렷하게 보이면 세포 분리 용액을 흡입하여 제거합니다. 그 후 10 micromolar rock inhibitor가 보충된 E eight 배지 1 milliliter를 첨가하고, P 1000 피펫을 사용하여 반복적으로 파이펫팅함으로써 H-I-P-S-C 콜로니를 플레이트에서 완전히 분리하여 5~10개의 세포 덩어리를 형성합니다.그 다음, 큰 세포 덩어리들을 더 분산시키기 위해 현탁액을 15 milliliter 원추형 튜브로 옮깁니다. 여기에 표시된 것처럼 더 작은 덩어리가 형성될 때까지 피펫으로 상하 흡입을 반복합니다. 그런 다음, 1 milliliter의 세포 현탁액에 rock inhibitor가 포함된 E eight 배지 11 milliliters를 첨가하여 세포를 1:12로 희석합니다.다음으로, 사전 코딩된 플레이트에서 ECMS를 흡입하여 제거합니다. 각 웰에 재현탁된 세포 2 mL를 추가합니다. 6-웰 플레이트의 경우 웰당 약 100,000 cells가 적당하며, 세포가 웰 중앙에 뭉치지 않도록 웰 전체에 고르게 분주하는 것을 목표로 합니다. 플레이트를 인큐베이터에 넣고 24시간 동안 배양합니다.다음 날, 락(rock) 억제제가 포함되지 않은 E8 배지로 교체합니다. 세포가 80% 합류(confluent)될 때까지 24시간마다 배지를 교체하십시오. 일반적으로 EDTA 또는 1X Cell detachment solution으로 해리시킨 후 3~6일 이내에 세포를 다시 계대 배양할 수 있습니다. 분화를 위해 ECM으로 코팅된 6-웰 배양 플레이트에 약 100,000개의 인간 iPSC를 접종합니다.세포의 밀도가 85%에 도달하면 HI PSCs에 사용된 것과 동일한 단계를 따라, 인슐린이 없고 6 µM의 GSK 3β 억제제인 CHIR 99021이 포함된 RPMI 1640 medium으로 교체하십시오. 세포를 48시간 동안 배양하며 매일 현미경으로 세포 상태를 관찰하십시오.CHIR 처리 24시간 후에 상당한 양의 세포 사멸이 관찰될 수 있습니다. 이는 정상적인 현상이며 처리 2일 후에 흔히 나타납니다. hPSC는 크기와 수가 증가하며 중배엽 운명으로 계속 분화합니다.CHIR가 포함된 배양 배지를 R-P-M-I-B 27 insulin 배지로 교체하고, 3일까지 배양합니다. 3일째에 배지를 insulin이 없는 R-P-M-I-B 27로 교체합니다. 5 µM의 Wnt 억제제 IWR-1을 첨가하고 세포를 48시간 동안 배양합니다.5일째에 현미경으로 세포를 관찰합니다. 중배엽 세포는 심장 계통으로 분화되어 서로 융합되기 시작하며 특징적인 가지 모양의 구조를 형성해야 합니다. 배지를 다시 인슐린이 포함되지 않은 R-P-M-I-B 27로 교체하고 세포를 48시간 동안 배양합니다.7일째에, 인슐린이 포함된 R-P-M-I-B 27 배지로 교체하십시오. 이후 3일마다 배지를 교체하며, 8일에서 10일 사이에도 동일한 배지로 교체합니다. 분화 10일 후 심근세포의 자발적 박동이 관찰됩니다.세포 면적의 50% 이상이 박동합니다. 하지만 박동하는 세포 시트는 비심근세포와 섞여 있을 수 있으며, 10일째에는 가지 모양의 구조가 매우 뚜렷하게 나타납니다. 최종 분화된 심근세포는 이 시점 이후로 더 이상 증식하지 않습니다.분화 후 10일 차에, 6-웰 플레이트의 각 웰에 있는 배지를 2 mL의 저포도당 배지로 교체하고 13일 차까지 3일 동안 세포를 이 배지에서 유지합니다. 13일 차에 세포를 인슐린이 포함된 R-P-M-I-B 27 배지로 되돌리거나, 선택적으로 포도당 기아 상태 동안 비심근세포의 해리를 촉진하기 위해 세포를 재부유(reflate)합니다.배지를 흡입하여 제거하고 PBS로 한 번 세척합니다. 세포 해리 효소 500 µL를 첨가하고 세포를 5분 동안 배양합니다. 5분간의 효소 처리 후, P 1000 피펫을 사용하여 심근세포를 최대 30회까지 상하로 피펫팅함으로써 단일 세포 현탁액으로 수동 분산시킵니다. 세포가 해리되면 이를 15 mL 원심분리관(conical tube)으로 옮깁니다.세포 해리 효소를 희석하기 위해 인슐린이 포함된 R-P-M-I-B 27 배지 5 mL를 채운 후, 200 Gs에서 4분 동안 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 상층액을 흡입하여 제거합니다. 그다음 세포를 R-P-M-I-B 27 배지 2 mL에 재현탁하여 ECMS가 코팅된 새로운 6-웰 플레이트에 분주합니다. 일반적으로 세포 생존율은 합류도(confluence)가 높을 때 증가하며, 이는 최적의 세포 생존을 위해 필요합니다.6-well dish의 well당 2백만 개의 세포를 재배양합니다. 재배양되지 않은 세포의 경우, 14일 차에 배지를 2 mL의 저농도 포도당 배지로 다시 교체하여 두 번째 포도당 결핍 주기 배양을 진행합니다. 세포를 이 저농도 포도당 상태에서 3일 더 배양합니다.대부분의 비심근세포는 17일째에 사멸합니다. 배지를 인슐린이 포함된 2 mL의 R-P-M-I-B 27로 교체하십시오. 남은 세포들은 고도로 정제된 심근세포가 됩니다.이 세포들은 유전자 발현 분석, 약물 스크리닝, 대사 분석 및 기타 다양한 하위 분석에 사용될 수 있으며, 포도당 기아법(glucose starvation method)을 통한 분화 및 정제 후 심근세포의 순도를 조사하기 위해 심근세포 마커인 cardiac troponin 및 CTN T에 대한 면역 염색을 통해 세포 특성을 분석하였습니다. 정제되지 않은 분화 세포 집단의 면역형광 현미경 관찰 결과, 녹색으로 표시된 CTN T 양성 세포가 많았으나 많은 세포에서 CTN T 발현이 나타나지 않아 13일 차에 비심근세포가 존재함이 시사되었습니다. 이와 대조적으로, 10일 차부터 3일간 포도당 기아 처리를 수행한 후 13일 차에는 거의 모든 세포가 CTNT 양성을 나타내어, 포도당 기아법을 통한 심근세포 정제가 성공적으로 이루어졌음을 확인하였습니다.이러한 데이터는 유세포 분석(flow cytometry analysis)을 통해 추가로 입증되었습니다. 빨간색으로 표시된 바와 같이, 포도당 기아 상태를 거치지 않은 세포의 약 50%가 tn NT two 양성이었습니다. 반면, 포도당 기아 상태의 세포는 90%가 tn NT two 양성이었습니다.이 영상을 시청하고 나면, 인간 유도만능줄기세포를 고순도의 심근세포 집단으로 분화시키는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이렇게 정제된 세포들은 다양한 하위 in vitro 응용 분야를 위해 고처리량 방식으로 생산될 수 있습니다. 만능줄기세포를 배양할 때, 메시징(messaging) 전까지 세포의 합류도(confluency)가 100%에 도달하지 않도록 주의하십시오.일부 줄기세포주는 초기 다능성 줄기세포의 공통 유동성이 85% 미만일 때 가장 잘 분화합니다. 마지막으로, 일부 줄기세포주는 포도당 결핍 단계에 더 빠르게 또는 더 심하게 반응할 수 있습니다. 새로운 줄기세포주로 작업하기 전에 항상 이러한 매개변수들을 모니터링하십시오.

derivation-highly-purified-cardiomyocytes-from-human-induced

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

우리는 심혈관 수리를 위해 인간의 심장 progenitors 및 기능 cardiomyocytes의 큰 공급 파생을 가능하게 작은 분자와 함께 정의된 조건 하에서 유지 pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 직접 cardioblasts의 유도를위한 프로토콜을 설립했습니다.

작은 분자와 유도 Pluripotent 인간 배아 줄기 세포로부터 인간 심장 엽 성의 전구 물질과 Cardiomyocytes의 효율 유도

만능 줄기 세포는 배아 또는 유도 된 pluripotent 줄기 (IPS의) 세포 중 하나는 심근을 포함한 인간의 차별화 된 세포의 중요한 소스를 구성합니다. 여기, 우리는 배아 체 기반 프로토콜을 통해 기능적 인간의 심근을 얻기 위해 그들을 사용하는 방법을 보여주는, IPS 세포의 심장 유도에 초점을 맞출 것이다.

인간의 Cardiomyocytes의 생성 : 피더없는 인간 유도 만능 줄기 세포에서 분화 프로토콜

이 기사는 효율적으로 선택적으로 참조 마커의 분석은 인구의 동질성과 정체성을 평가하기 위해 유동 세포 계측법 다음에 대한 Wnt 경로를 변조하여 심근에 인간 만능 줄기 세포를 구별하는 자세한 방법을 설명합니다.

유동 세포 계측법에 의한 고효율 심근에 인간 다 능성 줄기 세포의 분화 및 특성

여기에서는 인간 만능 줄기세포(hPSC)를 위한 강력하고 빠르며 확장 가능한 심근세포 분화 프로토콜을 제시합니다. 이 대규모 방법을 사용하여 파생된 심근세포는 인간 심혈관 질환 모델링, 고처리량 약물 스크리닝 및 잠재적인 임상 응용 분야에서 효과적으로 사용할 수 있는 충분한 세포 수를 제공할 수 있습니다.

고도의 재현 작은 분자 기반의 차별화 프로토콜을 사용하여 인간 다 능성 줄기 세포로부터 심근 세포의 대규모 생산

인간의 다 능성 줄기 세포 (hPSC-CM)에서 유래 된 심근 세포의 전기 생리 학적 특성은 심장병 모델링 및 약물 반응 결정에 중요합니다. 이 프로토콜은 다중 전극 배열에서 hPSC-CM을 해리 및 플레이트하고 필드 전위를 측정하며 QT 및 RR 간격을 분석하는 데 필요한 정보를 제공합니다.

다중 전극 배열 (MEAs)을 이용한 인간 다 능성 줄기 세포 유래 심근 세포 (hPSC-CMs)의 전기 생리 학적 분석

본 문서는 멀티웰 MEA 플레이트상에서 배양된 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근세포(hiPSC-CM) 네트워크의 개발을 위한 프로토콜 세트를 함유하고 있으며, 작용 전위 측정을 위해 세포막을 가역적으로 전기화한다. 높은 처리량 기록은 며칠 동안 반복적으로 동일한 셀 사이트에서 얻어진다.

재발 동작 전위 기록을 위한 멀티웰 마이크로 전극 어레이의 인간 iPSC 유래 심근구 네트워크

여기서 우리는 견고한 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근세포를 일관되게 생성하고 그 기능을 특성화하는 방법을 설명하고 검증한다. 이러한 기술은 신호 경로에 대한 기계적 통찰력을 개발하고, 대규모 약물 스크리닝을 위한 플랫폼을 제공하고, 심장 질환을 안정적으로 모델링하는 데 도움이 될 수 있습니다.

칼슘 취급 특성화를 위한 심실 유사 HiPSC 유래 심근세포 및 고품질 세포 제제 의 생성

여기서, 우리는 미리 분화된 인간 유도만능 줄기 세포 유래 심근세포, 심장 섬유아세포 및 내피 세포로 구성된 3D 자가 조립 심장 미세 조직 배열을 생성하는 사용하기 쉬운 방법론을 기술합니다. 심장 미세 조직을 생성하는 기술을 요구하는 이 사용자 친화적이고 낮은 세포는 질병 모델링 및 약물 개발의 초기 단계를 위해 구현될 수 있습니다.

인간 iPSC 유래 심근세포, 심장 섬유아세포 및 내피 세포를 사용하여 3D 심장 미세 조직 배열의 제조

이 방법은 형광 태그 sarcomere 단백질을 가진 다능한 줄기 세포 유래 심근세포를 사용하여 sarcomere 단축을 검사하는 것을 이용할 수 있습니다.

형광 태그 사코레 단백질을 사용하여 다능줄기 세포 유래 심근 세포의 Sarcomere 단축.

여기서, 우리는 환자 말초 혈액 단핵 세포에서 인간 심근세포를 강력하게 생성하고 확장하는 프로토콜을 제시합니다.

환자 말초 혈액 단핵 세포에서 인간 심근세포의 생성 및 확장

학습하세요 인간 유도 만능 줄기 세포에서 작은 분자 변조와 포도당 기아를 이용해 고도로 정제된 심근 세포를 유도하는 방법을. 이 기술은 심혈관 질환 모델링과 약물 스크리닝에 활용됩니다.

작은 분자 변조 차별화 및 후속 포도당 기아을 사용하여 인간 유도 만능 줄기 세포에서 고도로 정제 된 심근 세포의 유도

더 많은 동영상 탐색