의 동기화 Caulobacter Crescentus 세균 세포주기의 조사에 대한

이 절차의 전반적인 목표는 동기화된 세포 배양을 확립하기 위해 Coob backer swarmer 세포를 분리하는 것입니다. 이는 먼저 coob backer 세포의 혼합 배양을 성장시킨 다음 Resus를 통해 세포를 저온 배지에 현탁시켜 성장을 잠시 멈춤으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 차등 밀도 원심분리를 통해 스워머 세포를 분리하는 것입니다.

다음 단계는 세포가 세포 주기에 진입할 수 있도록 따뜻한 배지에서 군집 세포를 재현탁하는 것입니다. 마지막으로, 분리된 군집 세포는 생화학적 분석 또는 현미경을 사용하여 세포 주기 전반에 걸쳐 추적할 수 있습니다. 아기 세포 기계와 같은 다른 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 세포를 신속하게 분리하고 생화학 연구를 위해 충분한 양을 확대할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 염색체 분리 및 비대칭 세포 분열 주기를 제어하는 것과 같은 세포 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 먼저 colo backer CSIS 균주 NA 1000 플레이트의 박테리아를 5ml의 PYE 배지에 접종합니다. 다음날 흔들면서 섭씨 28도에서 하룻밤 동안 배양액을 성장시키고, 하룻밤 배양액 0.5 밀리리터를 M 2 G 배지 25 밀리리터를 함유 한 플라스크로 옮기고, 배양액이 0.5에서 0.6 사이의 광학 밀도에 도달 할 때까지 섭씨 28 도에서 플라스크를 흔든다.

다음으로, 배양액을 1 리터의 M2 G 배지로 희석하여 원하는 시작 광학 밀도를 얻고 배양물의 광학 밀도가 슬라이드에 배양의 1 마이크로 리터 인 0.5 피펫에 도달하면 섭씨 28도에서 플라스크를 흔든 다음 액체를 커버 슬립으로 덮습니다. 빠르게 헤엄치는 무리 세포의 존재를 확인하기 위해 위상 현미경으로 세포를 이미지화합니다. 배양액을 멸균 원심분리기 튜브로 옮긴 다음 섭씨 4도에서 15분 동안 7, 000배 G로 세포를 회전시킵니다.

다음으로, 상등액을 부을 때 느슨하게 흩어진 세포를 버리고 180ml의 차가운 M 2 배지를 첨가합니다. 혈청학적 피펫을 사용하여 세포를 부드럽게 재현탁합니다. 그런 다음 60ml의 차가운 콜로이드 실리카 용액을 세포 현탁액에 넣고 잘 섞습니다.

세포 현탁액을 8개의 30ml 튜브에 붓고 6, 400배 G로 30분 동안 원심분리합니다. 섭씨 4도로 설정합니다. 원심분리기에서 튜브를 부드럽게 제거하고 튜브에 두 개의 뚜렷한 밴드가 있는지 확인합니다.

아래쪽 밴드에는 스웜머 세포가 포함되어 있고 분열 전 세포는 위쪽 밴드에 있습니다. 다음으로, 상단 밴드와 액체를 하단 밴드에서 약 1cm 위까지 조심스럽게 흡입합니다. 페이스트르 피펫을 사용하여 스웜 밴드를 제거하고 깨끗한 튜브로 옮깁니다.

튜브에 차가운 M 2 배지를 채운 다음 튜브를 원심 분리하여 콜로이드 실리카를 씻어냅니다. 다음으로, 상등액을 조심스럽게 버리고 20ml의 차가운 M 2 매체 원심 분리기에 세포를 재현탁시킵니다. 다시 세포를 펠릿화하기 위해, 펠릿을 30 밀리리터의 차가운 M 2 매체에 재현탁시킨 다음 현탁액의 광학 밀도를 측정합니다.

1마이크로리터의 세포 현탁액을 현미경 슬라이드에 놓고 위상 이미징을 사용하여 스웜 세포를 확인합니다. 다음으로, 세포를 원심 분리하고 0.3 및 0.4 사이의 광학 밀도로 M 2 G 배지에 재현탁시킵니다. 서부 플롯 또는 유전자 발현 분석을 위해 섭씨 28도에서 진탕하여 배양물을 배양합니다.

배양물의 광학 밀도가 두 배가 될 때까지 약 140분 동안 10-30분마다 1ml의 부분 표본을 제거합니다. 탁상용 원심분리기를 사용하여 30초 동안 셀을 스핀다운한 다음 중간 플래시를 빠르게 흡입합니다. 세포 펠릿을 액체 질소에 동결하고 소규모 동기화를 위해 섭씨 음의 80도에서 보관하고, NA 1000 세포를 5 밀리리터의 M, 2, G 배지에 접종하고 다음날 섭씨 28도에서 흔들면서 밤새 세포를 성장시킵니다.

배양액을 15 밀리리터의 M 두 G 배지로 희석하고 광학 밀도가 0.5에서 0.6 사이가 될 때까지 세포를 성장시킵니다. 세포를 원심분리한 다음 1ml의 차가운 M 2 배지에 재현탁합니다. 세포를 2밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고, 원심분리로 세포를 펠렛화하고, sup natant를 흡인합니다.

그런 다음 튜브를 얼음 위에 놓고 세포 펠릿을 900마이크로리터의 차가운 M 2 배지에 다시 현탁시킵니다. 다음으로, 900마이크로리터의 차가운 PVP 코팅된 콜로이드 실리카를 넣고 튜브를 20분 동안 원심분리합니다. 상단 분열 전 세포 밴드를 조심스럽게 흡인한 다음 하단 스웜머 밴드를 새 마이크로 원심분리기 튜브에 수집합니다.

스워머 세포를 1ml의 차가운 M 미디엄 2개로 두 번 세척하고 각 세척 사이에 최종 탈수 직전에 3분 동안 원심분리를 합니다. 미리 냉각된 1ml 유리 시험관에 세포 현탁액을 넣고 세포의 광학 밀도를 측정합니다. 그런 다음 원심융합 후 세포를 마이크로 fuge 튜브와 원심분리기로 옮깁니다.

Reese, 0.3 및 0.4 사이의 광학 밀도에서 Prewarm M two G medium에 최종 세포 펠릿을 현탁시키고 섭씨 28도에서 세포를 흔듭니다. 현미경 검사가 필요한 경우, 1마이크로리터의 배양액을 적절한 시점의 M two G 에어로스 패드에 놓습니다. 비동기식 배양액의 차등 밀도 원심분리는 두 개의 세포 밴드를 생성합니다.

아래쪽 밴드에는 밀도가 더 높은 스웜머 세포가 포함되어 있고 위쪽 밴드에는 밀도가 낮은 비축된 세포와 분열 전 세포가 포함되어 있습니다. 배양물의 광학 밀도는 세포 주기가 진행되는 동안 약 2배 증가합니다. 이 기간 동안 군집 세포는 비축된 세포로 분화하고, 비축된 세포는 복제되어 비대칭 세포 분열을 겪습니다.

각 분열에서 새로운 스워머 세포와 모체 비축 세포가 생성됨에 따라 세포주기 마스터 레귤레이터 CTRA에 대한 웨스턴 블롯은 동기화를 확인하는 데 유용한 대조군이며, CTRA는 스워머 세포에서 DNA 복제를 차단하고 DNA 복제 시 분해됩니다. 그런 다음 CTRA는 세포주기의 후반부에 합성되어 DNA 복제의 재시작을 방지하고 많은 발달 유전자의 전사를 활성화합니다. CTRA 단백질 수준의 이러한 진동 패턴은 성공적인 동기화를 나타냅니다.

이 비디오를 시청한 후에는 박테리아 세포 주기를 조사하기 위해 콜백 또는 NA 1000 세포를 동기화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 셀 동기화 절차는 올바르게 수행되면 1-2시간 내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 수행하는 것은 신속하게 작업하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.