모델 콩과 식물에서 초기 배아 발달의 규정 유학을위한 접합체 및 체세포 배아를 얻기위한 프로토콜 Medicago truncatula

다음 절차의 전반적인 목표는 식물의 배발생에 대한 유전적 조절을 조사하기 위해 서로 다른 발달 단계에서 얼마나 많은 화물 툴라 배아를 얻을 수 있는지 보여주는 것이며, 이는 포드 형태학을 다른 접합 배아 발달 단계와 연결하고 잎 엑스플랜을 배양하여 다른 단계에서 체세포 배아를 얻음으로써 달성할 수 있습니다. 궁극적으로, 정량적 PCR 및 베타 글루쿠로니다아제는 관심 있는 특정 발달 단계에서 배발생 중 유전자 발현을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 기술의 장점은 생체 내 실험에 개별 꽃에 태그를 붙일 필요가 없으며 체외 절차가 최적화되어 무료 실험 접근 방식을 제공한다는 것입니다.

배양 절차를 시각적으로 보여주는 것은 조작의 세부 사항을 보다 면밀히 따를 수 있기 때문에 중요합니다. 생체 내 시술을 시연하는 사람은 Ing Wang이고 Kim Nolan은 체외 시술을 시연할 것입니다. 접합 배아 발달을 촉진하려면 Monte cargo trinocular 식물의 종자 외피 표면을 뚫고 씨앗을 물에 완전히 덮은 상태로 밤새 담가둡니다.

다음날, 지름 15cm 크기의 화분 10개에 각각 3개의 씨앗을 화분 혼합물에 파종하고 화분을 유리 집으로 옮깁니다. 낮에는 섭씨 23도에서 19도의 밤 온도에서 14시간의 사진 기간 동안 식물을 성장시키고, 발아 후 가장 건강한 묘목을 유지하여 화분당 하나의 식물이 있도록 하고 꼬투리가 나타날 때 식물 줄기가 올라갈 수 있도록 격자로 묘목을 둘러쌉니다. 표 1과 그림 1에 요약된 적절한 단계에서 수집하여 원하는 초기 배아 발달 단계를 얻습니다.

다음으로, 집게를 사용하여 포드에서 les를 분리합니다. 또는 Hoyer 용액에서 완전히 투명한 보다 정교한 현미경 검사를 위해 표준 복합 현미경에서 배아를 이미징하여 배아 단계를 확인할 수 있습니다. 그런 다음 포드의 중앙 영역에서 실험에 필요한 UL 수를 수집하고 체세포 배아 발달을 위한 다운스트림 분석을 위해 적절한 온도에 보관합니다.

배양에서 쉽게 배아를 형성할 수 있는 tran atula 품종의 길쭉한 줄기의 최신의 거의 완전히 확장된 테이트 잎에서 시험관 내 수확 전단지. 탈수를 방지하기 위해 테이트 잎을 축축한 종이 타월에 담아 배양 냄비에 보관하십시오. 그런 다음 UV 살균 생물 안전 캐비닛에서 작업하여 잎을 오토클레이브 봄 차 주입기의 메쉬 볼에 넣었습니다.

오토클레이브 250 밀리리터 나사 캡에 70% 에탄올에 잠긴 주입기. 폴리카보네이트 배양 냄비는 30초 후 잎 조직을 배수한 다음 인퓨저를 1-8개의 희석된 표백제 용액에 10분 동안 담급니다. 가끔 부드럽게 소용돌이치면서 냄비를 부드럽게 휘젓고 여분의 물을 빼냅니다.

그런 다음 인퓨저를 헹굽니다. 새 냄비에 담수 탈이온수에 한 번 더. 지금 메마른 신선한 배양물, 메마른 모자에 메마른 탈 이온을 입힌 증류수 나사의 남비로 차 infuser에서 잎을 옮기기 위하여 잎을 이용하십시오.

그런 다음 반전과 소용돌이로 잎을 헹굽니다. 그런 다음 전단지가 멸균 물 위에 떠서 임플란트를 플레이트화하도록 합니다. 멸균 기술을 사용하여 개별 멸균된 전단지의 가장자리를 다듬습니다.

그런 다음 나머지 직사각형을 2 개 또는 3 개, 8-10 x 3-5 밀리미터 직사각형 explan으로 자르고 각 X explan 플레이트의 중앙에 중간 정맥을 놓습니다. 한천 당 6 x 외식은 직경 9cm의 고형 배양 배지를 응고시킵니다. 일반적인 잎 방향을 유지하기 위해 ABA 밀봉 면이 아래로 향하게 한 페트리 접시.

그런 다음 페트리 접시를 퍼필로 밀봉하고 온도가 조절되는 방에서 섭씨 28도의 어둠 속에서 접시를 배양합니다. 3주 후, 멸균 스테인리스 스틸 주걱과 집게를 사용하여 차별화된 구멍 외식식물을 새로운 배지에 외삽합니다. 첫 번째 배아는 굳은살이 발생함에 따라 약 4주 안에 관찰되어야 하며, 굳은살은 여기에 표시된 가장 큰 배아의 크기를 초과합니다.

하위 배양 시 개별 굳은살의 50%만 신선한 배지로 전달합니다. 마지막으로, 실체 현미경을 사용하여 4-8주의 배양 기간 동안 다양한 배아 단계를 수집하고 실험 목적에 따라 외식을 처리합니다. C에서 다운스트림으로 방금 입증된 바와 같이 접합 배아를 수확한 후, 이러한 이미지에서 입증된 바와 같이 두 개의 혼성화 또는 기타 적절한 전략을 특히 흥미롭게 사용할 수 있으며, SSIS와 Spencer의 고유성은 도금된 X 계획을 따름으로써 관찰할 수 있습니다.

4주에서 8주 동안 신중한 단계의 체세포 배아를 찾아 즉시 분석할 수 있습니다. 예를 들어, 이러한 데이터는 초기 올레인 단계의 배아가 한 종류의 메디카고 툴라 어인 유전자의 발현을 나타내지만 다른 유형의 발현은 나타내지 않는 방법을 보여줍니다. 체세포 배아 시스템의 특별한 장점은 식물 전체를 재생하지 않고도 굳은살의 변형을 수행할 수 있다는 것입니다.

실제로, here 에서 입증 된 바와 같이. 베타 글루쿠로니다아제는 배발생의 여러 단계에서 유전자 발현을 시각화하는 데 사용할 수 있습니다. 비디오를 시청한 후에는 Andres를 얻기 위해 포드를 선택하고 해부하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

또한 발달 후 체세포 배발생을 위해 무균 엑스플랜을 준비하고 플레이트하는 방법에 대해 잘 이해해야 합니다. 이러한 기술은 배아 성장 발달 및 영양소 저장과 관련하여 배발생 초기 단계의 전사 조절을 조사할 수 있게 해주었습니다.