Name: 모델 콩과 식물에서 초기 배아 발달의 규정 유학을위한 접합체 및 체세포 배아를 얻기위한 프로토콜 Medicago truncatula (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: 배우세요 Medicago truncatula를 이용한 식물 초기 배아 발생의 유전적 규제 연구 방법을 배우세요. 이 프로토콜은 포드 형태와 배아 발달 단계를 연결하고 체세포 배아 배양 기술을 활용하여 유전자 발현을 분석하는 데 도움을 줍니다.

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이 연구는 호주 연구 위원회(Australian Research Council)의 보조금 CEO348212와 뉴캐슬 대학교(University of Newcastle)의 지원을 받았습니다. Sam Zhang 박사의 도움은 인정됩니다.

1. 접합체 배아 개발 <ol><li> 식물 재료 <ol><li> 성장 Medicago는 14 시간의 광주와 유리 공장과 23 ° C / 19 ° C 일 / 밤 온도에서 야생형 Jemalong 또는 매우 다시 생성 가능한 그 근처 동종 (2HA라고도 함) 유전자형 Jemalong 2HA 13 truncatula. <ol><li> 물이 씨앗을 입력하고 물에 하룻밤 담가 허용되도록 씨앗을 파종하기 전에 피어스 (23 G 바늘) 씨 코트의 표면. 완전히 씨앗을 충당하기 위해 충분한 물을 추가합니다. </li><li> 포팅 혼합물의 각 15cm 직경 냄비에 3의 씨앗을 뿌리고 (10 냄비의 총) (굵은 모래, 펄라이트, 야자 껍질의 섬유 - 이탄 (1 : 1 : 1)을 더한 Osmocote 정확한 표준의 5g : 느린 방출 비료) 및 전송 유리 공장. 식물이 올라 줄기를 위해 냄비와 서라운드 당 1 공장은 격자에 의해이 때문에 발아 후 건강한 묘목을 유지. </li></ol></li></ol></li><li> 수확 포드 <ol><li> W에서 포드를 수집Jemalong 또는 2HA 적절한 초기 배아 단계를 얻기 ILD 유형은 제 9 기재. 주의 : 다른 포드 스테이지가도 1에 도시되고 대응하는 배아 단계는도 2에 도시되어있다. </li><li> 분리 스테이지 (6 및 7) (표 2)을 돕는 단계 (6)로부터의 경과 시간. 표 1에서와 같은 기준을 사용하여 수확에서 다른 포드 스테이지를 점검 측정한다. </li></ol></li><li> 포드에서 난자를 해부 및 배아 단계를 확인 <ol><li> 필요에 따라 단독으로 미세 집게를 사용하여 포드 또는 스테레오 해부 현미경과 집게에서 난자를 분리합니다. 필요한 경우 배아 단계 신속 표준 화합물 현미경 (도 3b)을 이용하여 확인할 수있다. </li><li> 아랍어 7.5 g 검, 100g의 클로 랄 하이드레이트, 5 mL의 글리세롤, 증류수 60 mL의 탈 이온수를 함유하는 용액을 호이어의 변성 준비한다. 3-5 시간 또는 하룻​​밤 교반 용해. </li><li> 더 조정을 위해D 현미경 수정 호이어의 솔루션 (15, 16)의 해부 난자을 취소합니다. 조심스럽게 명확 때까지 실온에서 (난자를 커버하기에 충분) 호이어의 솔루션의 작은 볼륨에서 그대로 난자와 장소를 선택하십시오. </li><li> 미분 간섭 대비 (DIC) 광학 샘플을 볼 수 있습니다. 디지털 카메라 (9) (그림 2) iwth 이미지를 캡처합니다. </li><li> 포드의 중심 지역에서 가장 균일 한 난자를​​ 확보하고 필요한 수를 축적. 일례가도 3a에 도시되어있다. 추가 분석을 위해 요구되는 온도에서 얼음 저장에 난자 (-80 ° C에 대한 핵산)를 수집합니다. 참고 : 조직 학적 섹션의 분석, 투과 전자 현미경에 대한 자세한 내용 및 현장 하이브리드에 논문 8, 9를 참조하십시오. </li></ol></li></ol> 체외 2. 체세포 배아 개발 <ol><li> 엠을 사용하여 truncatula 품종의 T모자는 쉽게 문화의 배아를 형성 할 수있다. 잎 외식이 프로토콜 2-4 개월이다 2HA 공장 13, 17을 사용합니다. </li><li> 신장 줄기의 최신 거의 완전히 확장 세 잎의 잎에서 전단지를 가져 가라. </li><li> 탈수를 방지하기 위해 문화 냄비에 축축한 종이 타월에 세 잎의 잎을 유지합니다. 주 : 세 잎의 잎이 수확되면 그들이 최소한의 지연으로 활용 될 필요가있다. </li><li> 배양 배지의 제조 <ol><li> 4 : 4 : 1 : 한천에 5 배지 (W 0.8 % : V)에 9cm 페트리 접시 (P4) (10)를 사용합니다. 참고 : P4 10 : 4 : 1 : 5 매체는 P4의 기저 매체 18 플러스 10 μm의 1 naphthaleneacetic 산 (NAA), 4 μm의 6 benzylaminopurine (BAP), 1 μm의 아브 산 (ABA)와 5 μm의 지베렐린으로 구성 산 (GA). GA + ABA의 사용은 배아 형성을 가속화하고 배아 번호 14의 실질적인 증가를 야기한다. </li><li> 1 리터의 P4의 기저 매체 메이크업; (calciu을 주요 염으로 구성된) 별도로 미터 사소한 염과 비타민 (표 3), 킬레이트 철 (별도 구성), 카사 미노산 (카제인 가수 분해물), 30g의 자당, 8g 한천. </li><li> 적당한 분량 씩 -20 ° C에서 주요 염, 칼슘, 카사 미노산, 약간의 소금과 비타민의 상점 재고 솔루션을 제공합니다. 4 ℃에서 킬레이트 철을 저장합니다. </li><li> • 7H 다음날에 FeSO4의 1.853 g을 추가하는 동안 교반하면서 탈 증류수 약 900 ml의 나 2 EDTA •의 7.44 g의 2H 2 O를 용해하여 킬레이트 철 (200X)를 확인 후 98 ~ 99 ° C의 솔루션을 가지고 2 O 성분이 용해 될 때 마지막으로 1 리터까지합니다. 호박에 보관은 4 ℃에서 병 색깔. </li><li> 표 4에서와 같이 주식 솔루션 (P4)의 기초 배지를 확인합니다. 매체의 호르몬은 10 μm의 NAA, 4 μM의 BAP, 1 μM의 ABA, 5 μm의 GA (표 4 및 특정 재료 표 참조). NAA 추가BAP 전에 가압 멸균 주사기에 부착 0.22 μm의 필터로 여과 멸균하여, 오토 클레이브 약 55 ° C로 냉각 후 ABA 및 GA를 추가한다. 부드러운 소용돌이에 의해 잘 섞는다. </li><li> 고압 증기 멸균에 앞서 1 M KOH으로 pH 5.8로 미디어를 조정합니다. 20 분 동안 121 ℃에서 오토 클레이브. </li><li> 필터 살균 ABA와 GA를 추가하고 층류 후드 또는 생물 학적 캐비닛에 멸균 9cm 페트리 접시에 미디어의 약 25 ml에 부어 고온 가압 멸균 한 후. 쿨과 한천은 뚜껑으로 설정할 수 있습니다. 그런 다음 뚜껑에 넣고 뚜껑에는 응축수가없는 있는지 확인하십시오. (뚜껑 응축을 방지하기 위해 판지 상자) 4 ° C에서 요구 및 저장소로 레이블. </li></ol></li><li> 잎 조직의 살균 <ol><li> 자외선 살균 층류 후드 또는 생물 학적 캐비닛에 작업 할 수 있습니다. </li><li> 장소는 이전에 멸균 봄 차 주입기의 메쉬 볼에 나뭇잎. </li><li> 막 다른 에탄올 70 %에 (V V)를 잎을 포함하는 차 주입기를 담가30 초 동안 진짜야 냄비. 참고 :이 절차의 모든 단계를 사용할 250 ml의 멸균되는 캡 폴리 카보네이트 문화 냄비 나사. </li><li> 배수 후 전송하고 1 잎 조직 몰입 : 8 (V : V)로 희석 표백제 (0.5 % 염소)을 10 분 동안. 때때로 부드럽게 소용돌이. </li><li> 표백제를 배출하고 멸균 탈 증류수를 포함하는 문화 냄비에 차 주입기를 전송합니다. 부드럽게 소용돌이와 여분의 물을 배수. 멸균 탈 증류수 신선한 문화 냄비에 한 번 더 반복한다. </li><li> 멸균 탈 증류수 신선한 문화 냄비에 멸균 집게와 차 주입기에서 잎을 제거합니다. 멸균 캡 나사와 반전과 소용돌이로 헹군다. 외식을 준비 할 준비가 될 때까지 멸균 물에 떠있는 나뭇잎을 남겨주세요. </li></ol></li><li> 의 Explants 준비 및 도금 <ol><li> 멸균 기법을 사용하여, 메스 에지로부터 개별 멸균 전단을 트림 및 2 개 THR로 나머지 직사각형을 잘라직사각형 이식편 각 이식편 (도 5a)의 중앙에 중간 정맥과 (80-10 X 3-5mm)를 EE. 주 : 이식편의 크기는 제 캘러스를 개시에 매우 중요하다. 테이크 아웃 식품 용기에서 멸균 뚜껑에 절단을 수행하십시오. </li><li> 플레이트 9cm 직경 페트리 접시 (그림 5B)에서 한천 화 배지에 6 외식. 보통 잎의 방향을 유지하기 위해 아래로 외식 배축 측 플레이트. </li><li> 접시 주위에 뻗어 파라 필름 (그림 5C)와 페트리 접시를 밀봉합니다. 조직은 지금 배양을위한 준비가되어 있습니다. </li></ol></li><li> 조직 배양 <ol><li> 문화 기간 동안 온도 조절 실 또는 성장 캐비닛에 28 ° C에서 어둠 속에서 번호판을 품어. 참고 : 외식이 탈분화를 시작 세포 분열, 증식 (캘러스 형성)과 배아 (차별화)을 받게 될 것이다. </li><li> 차별화 expla을 배양신선한 매체에 3 주 후에 NTS. 이 계대 배양에서 층류 후드 또는 생물 캐비닛, 멸균 스테인리스 주걱과 집게를 사용하여 전체 이식편 옮긴다. 캘러스가 발생 캘러스는도 5C에서 가장 큰 하나의 크기를 초과하는 신선한 배지로 계대 배양 될 때, 개별 캘러스의 50 %를 전달. </li><li> 약 4 주 만에 처음으로 배아를 관찰한다. 동시성의 정도가되지만, 4-8 주간의 배양 기간 동안 상이한 배아 수집 단계 (도 6a를, B). 실험 목적에 따라 해부 현미경 및 프로세스에 따라 수집합니다. </li><li> 외식 3 개월 동안 배아를 생산하기 위해 계속 수 있도록 매 3 주 배양과 정기적으로 배아를 제거합니다. </li></ol></li></ol>

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</ol>

저자는 경쟁하는 이해관계가 없음을 선언합니다.

설명 프로토콜은 상대적으로 정직하고 모든 현대의 세포 및 분자 기술과 콩과 식물 배아의 조사를 할 수 있습니다. 우리는 장점과 생체 내 및 생체 외 접근 모두 단점이 있다는 것을 인정한다. 모두 미숙 씨 (19)의 문화에 비해 초기 배 발생에 더 초점을 수 있습니다. 생체 내 연구의 경우에 무엇을 설명하는 것은 주로 많은 배아 연구에 적합한 포드로부터 난자의 분리이다. 더 나아가 &quot;후크&quot;영역 (도 3B)를 오프 자르는 배아 조직을 위해 농축하는 것도 가능하다. 그것은 잘 유리한 난자의 활용, 인접 조직에 부착되지 않는 동안 disection 배아 종종 분실로서 배아 발달의 매우 초기 단계를 분리하는 것이 곤란하다. 꽃의 태그는 포드의 형태를 제거 사용 및 시간 C를 갖는각각의 꽃에 대한 ourse을 정권. 환경이 매우 엄격하게 제어되지 않는 한 또한 잠재적 인 ...

수확 면적과 총 생산량 1 곡물에 두 번째 콩은 약 20,000 종과 콩과 (또는 콩과 (Fabaceae)) 가족과 함께 고등 식물의 세 번째로 큰 가족입니다. 콩은 세 번째로 큰 재배 작물이다. 곡물 콩류는식이 단백질의 3 분의 1과 인간의 소비를 2 식물성 기름의 3 분의 1에 대해 제공합니다. 자신의 N (2) 고정 용량 콩은 그 씨앗의 자엽 콩, 저장 단백질과 기름처럼. 지속 가능한 농업 시스템에 Medicago의 truncatula 기여 상당한 유전자와 게놈 자원 3,4와 유전자 및 게놈 콩과 식물 모델이다. M. 동안 truncatula는 점점 콩과 식물 씨앗 생물학 5-7 및 배아 8,9을 연구하기 위해 사용 된 콩과 식물 - 근류균 공생 (4) 이해의 발전을 가능하게했다. 애기 배아 광범위 10,11 공부하지만 난되었습니다SA 비 콩과 식물과 배아의 세부 사항은 Medicago 8,10 동일하지 않다. 엠의 접합체 배아 truncatula는 특유의 다세포 뇌하수체, endoployploid suspensor 및 기저 전송 세포 8, 흥미로운 기능을 가지고 있습니다. 체세포 배 (SE)는 일반적으로 식물 (12)를 재생하는 데 사용됩니다. 콩과 식물의 모델 (M)에서 truncatula는, 부모 Jemalong에서 개발 된 종자 라인 Jemalong 2HA (2HA)는 체세포 배 (13)의 높은 비율을 가지고있다. 생성 된 배아의 개수는 최근 실질적 노포 매체 (14)에 모두 산 지베렐린 (GA)과 아브 산 (ABA)을 추가하여 증가하고있다. GA와 ABA는 일반적으로 길항 (14)의 역할을 주어진 특이한 시너지이 경우 GA 및 ABA의 행동합니다. 캘러스로부터 생성 된 배아는 배아의 단계를 용이 visuall 결정될 수 있도록 표면에 개발Y 쉽게 수확. 체세포 배의 조사 (Jemalong) (2HA) 배 발생 및 비 배아있는 동종 라인 근처에 용이 갖는 생체 내에서 서로 다른 실험 가능성을 제공 체외 시스템을 모두 가지고. 배아 개발의 세포 및 분자 메커니즘을 이해하는 것은 이해 종자 및 식물 개발을위한 필수적이다. 콩에서 다른 쌍떡잎 식물에서와 같이, 이는 인간의 영양 섭취에 사용되는 제품을 저장 배아 자엽이다. 초기 배 발생이 빠른 세포 분열, 그리고 올바른 배아 패턴을 포함한다. 약 팔일 수정 후, M.에서 truncatula 배아 초기 자엽 단계에 도달한다. 형태 학적 특성은 정확하게 온실 조건의 수정 후 일에 의해 표시되지 않습니다. 따라서, 개발 배아의 무대를 표시 할 수있는 효율적인 표준화 된 접근 방식은 유전 regul 연구에 가치가있다초기 접합체 배아의 ATION. 본 논문에서는 콩과 식물 모델 엠에서 배아의 생물학적 연구 개발 배아를 수집하기 위해 두 개의 표준화 된 프로토콜을 제공 truncatula. 첫 번째를 손쉽게 대형 배아 번호를 제공하기 위해 배양 잎 외식 통해 체세포 배는 배 발생 동안 포드 형태를 연결하여 접합체 배아를 수집하는 것이다.

<table><tbody><tr><td>P4 매체</td><td>: 시그마 - 알드리치</td><td>: 시그마 - 알드리치 화학 물질 또는 기타 분석 등급 공급 업체 사용</td>: 주요 염 : 미량 염 : 비타민 한천 Bacto Laboratories 214010 : Bacto 한천 식물 호르몬 : 1-<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 나프탈렌 아세트산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0640</td><td>1M</td></tr><tr><td>NaOH Abscisic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1049</td><td>1M NaOH</td></tr><tr><td>6-Benzylaminopurine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B3274</td><td>가열과 몇 방울로 MQ 물에 용해 1N HCl</td></tr><tr><td>지베렐릭 산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7645</td><td>소량의 에탄올</td></tr><tr>에 용해<td>장비</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>: 스테레오 해부 현미경</td><td>Leica</td><td>MZFLIII</td><td>또는 이와 유사한</td></tr><tr><td>광학 현미경</td><td>Zeiss</td><td>Axiophot</td><td>또는 이와 유사한 광학</td></tr><tr><td>디지털 카메라</td><td>Zeiss</td><td>AxioCam HRc</td><td>또는 이와 유사한</td></tr><tr><td>살균 잎</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 mL 나사 캡 폴리 프로필렌 뚜껑이있는 폴리 카보네이트 용기</td><td>SARSTEDT</td><td>75.9922.519</td><td>오토클레이브 가능</td></tr></tbody></table>

모델 콩과 식물에서 초기 배아 발달의 규정 유학을위한 접합체 및 체세포 배아를 얻기위한 프로토콜<em&gt; medicago truncatula</em

Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

단일 세포 접합자부터 초기 배 발생이 빠른 세포 분열 및 형태 형성을 통해 진행하고, 형태 학적으로 전 구형, 구형, 심장, 어뢰 및 자엽 단계를 특징으로한다. 이 진보적 개발 복잡한 분자 네트워크의 타이트한 규제 받고있다. 개발의 유사한 단계에서 충분한 초기 배아를 수확하는 것은 초기 배아의 세포 및 분자 규제 조사를 위해 필수적이다. Medicago 예 : 팔일이 초기 자엽 단계에 도달 truncatula 동안 초기 배 발생이 짧은 빠른 형태 형성을 거쳐 때문에 이것은 간단하지 않다. 여기서 우리는 두 가지 방법으로 문제를 해결. 첫 번째는 접합체 배아의 단계를 나타내는 데 배아 개발 및 포드 형태 사이의 연결을 설정합니다. 이것은 특히 포드 나선과 등뼈의 개발의 수에 기초한다. 생체의를 보완하는 다른 방법tudies는 체세포 배아를 생산하는 배양 잎 외식를 통해입니다. 매체는 비정상적인 호르몬의 조합을 포함 - 옥신 (1 naphthaleneacetic 산), 사이 토키 닌 (6 benzylaminopu​​rine), 아브 산, 지베렐린 산을. 다른 단계는 절개없이 캘러스의 성장 식별 할 수 있습니다.

F - 다른 배아 단계는도 2a에 도시 동안 F - 다른 배아 단계에 해당하는 접합체 배아 다른 포드 구조에 대해서는 그림 1A에 표시됩니다. 동일한 단계에서 포드를 선택함으로써, 난자의 샘플 상당히 균일 (도 3a)를 얻을 수 있음. RT-qPCR의 배아를 이용하여 특정 유전자는 쉽게 검출 및 시간 과정 연구 9를 평가할 수있다. 일부 추가 해부 배아 (그림 3B)의 추가 농축을 허용합니다. 제자리 혼성화 처리 전략을 용이하게 임의의 상보 광 관련된 연구 (도 4A, B) 및 전자 현미경 (8)뿐만 아니라 수행 할 수있다 위해. 이 시스템을 구성하는 특정 값의 뇌하수체 및 suspensor (도 4A, B)의 특수성이다. <...

목표는 콩과 식물이 아닌 애기장대 모델을 보완하기 위해 초기 식물 배아 발생의 조절을 조사하는 데 모델 콩과 식물 Medicago truncatula를 쉽게 사용할 수 있음을 설명하는 것입니다. 포드 형태학은 접합 배발생 단계와 관련이 있으며 조직 배양을 사용하여 배아를 수집하는 프로토콜도 제공됩니다.

모델 콩과 식물에서 초기 배아 발달의 규정 유학을위한 접합체 및 체세포 배아를 얻기위한 프로토콜<em&gt; Medicago truncatula</em

Early embryogenesis starting from a single cell zygote goes through rapid cell division and morphogenesis, and is morphologically characterized by ...

다음 절차의 전반적인 목표는 식물의 배아 형성 과정에서의 유전적 조절을 조사하기 위해 다양한 발달 단계에서 얼마나 많은 배아를 얻을 수 있는지 입증하는 것입니다. 이는 꼬투리의 형태를 서로 다른 접합자 배아 발달 단계와 연결하거나, 잎 절편을 배양하여 다양한 단계의 체세포 배아를 얻음으로써 달성할 수 있습니다. 최종적으로, 정량적 PCR(quantitative PCR)과 beta glucuronidase를 사용하여 관심 있는 특정 발달 단계 동안의 배아 형성 과정 중 유전자 발현을 평가할 수 있습니다. 이러한 기술의 장점은 인비보(in vivo) 실험을 위해 개별 꽃에 태그를 붙일 필요가 없으며, 최적화된 인비트로(in vitro) 절차가 상호 보완적인 실험적 접근 방식을 제공한다는 점입니다.배양 과정의 시각적 시연은 조작 세부 사항을 더 면밀히 따를 수 있게 하므로 중요합니다. in vivo 절차는 Wang이 시연하고, in vitro 절차는 Kim Nolan이 시연할 예정입니다. 접합자 배아 발달을 촉진하기 위해 Monte cargo trinocular 식물 종자의 종피 표면을 뚫고, 종자가 완전히 잠기도록 하여 하룻밤 동안 물에 담가 두십시오.다음 날, 직경 15 centimeter 화분 10개에 상토를 채우고 각각 씨앗 3알씩을 심은 후 화분을 온실로 옮깁니다. 14시간의 광주기와 주야간 온도 23 to 19 degrees Celsius 조건에서 식물을 재배하며, 발아 후 가장 건강한 묘를 선택하여 화분당 한 개체만 남깁니다. 꼬투리가 생겼을 때 줄기가 타고 올라갈 수 있도록 묘 주변에 격자 지지대를 설치합니다. 원하는 초기 배 발생 단계를 얻기 위해 표 1과 그림 1에 기술된 적절한 시기에 시료를 수집합니다.다음으로, 핀셋을 사용하여 꼬투리에서 종자를 분리합니다. 또는 더 정밀한 현미경 관찰을 위해 Hoyer 용액으로 완전히 투명화한 후, 표준 복합 현미경으로 배를 이미징하여 배의 발달 단계를 확인할 수 있습니다. 그런 다음 꼬투리의 중앙 영역에서 실험에 필요한 수의 UL을 수집하고, 체세포 배 발달을 위한 후속 분석을 위해 적절한 온도에서 보관합니다.배양 시 배아를 쉽게 형성할 수 있는 *Tran atula* 품종의 신장 중인 줄기에서 가장 최근에 거의 완전히 전개된 tate 잎으로부터 leaflet을 in vitro 수확합니다. 탈수를 방지하기 위해 tate 잎을 배양 포트 내의 젖은 종이 타월 위에 보관하십시오. 그 다음 UV 멸균된 생물안전 작업대 내에서, 잎을 오토클레이브 가능한 스프링 티 인퓨저의 메쉬 볼 안에 넣습니다.250 mL 스크류 캡 폴리카보네이트 배양 포트 내의 70% Ethanol에 인퓨저를 담급니다. 30초 후 잎 조직의 액체를 따라내고, 인퓨저를 1:8로 희석한 표백제 용액에 10분 동안 담급니다. 가끔 부드럽게 회전시키며 포트를 살살 흔들어 준 뒤, 과잉의 물을 따라냅니다.그런 다음 인퓨저를 헹굽니다. 새 비커에 담긴 신선한 탈이온수로 한 번 더 헹굽니다. 이제 멸균 핀셋을 사용하여 찻잎을 인퓨저에서 멸균 증류수가 담긴 새로운 배양 비커로 옮긴 후, 멸균 캡을 돌려 닫습니다.그런 다음 잎을 뒤집어 흔들며 헹굽니다. 이어서 소엽들이 멸균수에 뜨게 하여 임플란트를 플레이팅합니다. 멸균 기술을 사용하여 개별 멸균 소엽의 가장자리를 다듬습니다.그 다음 남은 직사각형 조각을 각각의 외식편(explant) 플레이트 중앙에 중맥이 위치하도록 8~10 x 3~5 mm 크기의 직사각형으로 2~3개 절단합니다. 9 cm 직경의 한천 고형 배지가 담긴 페트리 접시에 일반적인 잎의 방향을 유지하기 위해 ABA 면이 아래로 향하게 하여 외식편을 6개씩 배치합니다.그다음 페트리 접시를 파라필름으로 밀봉하고 온도 조절실의 28 °C 암조건에서 배양합니다. 3주 후, 멸균된 스테인리스 스틸 스파튤라와 핀셋을 사용하여 분화 중인 절편을 신선한 배지로 계대 배양합니다. 캘러스 형성이 일어나고 캘러스의 크기가 여기에 제시된 가장 큰 절편의 크기를 초과함에 따라 약 4주 후에 첫 배아가 관찰될 것입니다.신선한 배지로 계대배양할 때는 개별 캘러스의 50%만 옮깁니다. 마지막으로 실체현미경을 사용하여 4~8주의 배양 기간 동안 다양한 배아 단계를 수집하며, 실험 목적에 따라 외식편을 처리합니다. 방금 시연한 것과 같이 접합자 배아를 수확한 후, C2 하이브리드화 또는 기타 적절한 전략을 하위 단계에서 채택할 수 있습니다. 이 이미지들에서 보여주듯이, 플레이트에 도말된 외식편을 관찰함으로써 SSIS와 Spencer의 뚜렷한 차이점을 확인할 수 있습니다.4주에서 8주 사이에 다양한 단계의 체세포 배를 찾아 즉각적인 분석을 위해 채취할 수 있습니다. 예를 들어, 이 데이터는 초기 Olein 단계의 배가 한 종류의 medicago Tula eoin 유전자의 발현은 나타내지만, 다른 종류의 유전자는 나타내지 않는 방식을 보여줍니다. 체세포 배 시스템의 특별한 장점은 식물 전체를 재생시키지 않고도 캘러스의 형질전환을 수행할 수 있다는 점입니다.실제로 본 실험에서 입증되었듯이, Beta glucuronidase는 배아 발생의 서로 다른 단계에서 유전자 발현을 시각화하는 데 사용될 수 있습니다. 영상을 시청한 후, 여러분은 Andres를 얻기 위해 포드를 선택하고 해부하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.또한 체세포 배발생을 위해 발달 후 멸균된 외식편을 준비하고 배양하는 방법에 대해 충분히 숙지하고 있어야 합니다. 이러한 기술들을 통해 배아의 성장, 발달 및 영양분 저장과 관련하여 배발생 초기 단계의 전사 조절에 관한 연구가 가능해졌습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

우리의 개발 초기 단계에서 배아를 분리하는 효율적이고 간단한...

에서 초기 단계의 배아의 효율적이고 신속한 분리<em&gt; 애기 장대</em&gt; 씨앗

얼룩말 핀치새(Taeniopygiaguttata)는 가치 있는 모델 유기체입니다. 그러나 얼룩말 핀치새의 발달 초기 단계는 광범위하게 연구되지 않았습니다. 이 프로토콜은 발달 및 분자 응용을 위해 초기 배아를 해부하는 방법을 설명합니다.

개발의 초기 단계에서의 해부와 얼룩말 핀치 태아의 다운 스트림 분석

morphant 배아를 생성하는 방법은 발달 메커니즘과 유전자 규제 네트워크를 연구하는 것이 필수적이다. 바다 스타 Patiria miniata는 이러한 연구에 대한 새로운 모델 시스템입니다. 여기서 우리는 배아의 문화를, 배우자를 얻기 생산을위한 프로토콜,이 종 접합자의 빠른 미세 주입을 제시한다.

의 미세 주입을위한 방법 Patiria의 minata 접합자

생체 내에서 세포 기관 및 기타 세포 내 구조의 동적 거동을 이미징하면 생리학적 및 질병 조건에서 그 기능을 밝힐 수 있습니다. 여기에서는 중심체와 미토콘드리아의 두 소기관을 유전적으로 태그하고 광시야 및 컨포칼 현미경을 사용하여 살아있는 제브라피시 배아에서 이들의 역학을 이미징하는 방법을 제시합니다.

살아있는 Zebrafish의 배아에서 세포 이하 구조를 이미징

이 프로토콜 embryogenesis 애기 에 난 허가 뒤에 현미경으로 배아 패턴 형성의 검사를 통해 관찰 하는 방법을 설명 합니다.

애기 에서 Embryogenesis를 특성화 하는 방법

이 원고는 체 외에 난 재배 방법을 라이브 셀 이미징 애기 zygotes 및 배아의 수를 설명 합니다. 이 메서드는 zygote 분극 동안 세포내 역학 및 배아 개발 세포 운명 명세를 시각화 하기 위해 이용 된다.

생체 외에서 라이브 셀 이미징의 접합 자 양극 화와 애기 thaliana 패터 닝 태아 난 재배

식물 형태 유전자는 반발성 유전자형의 유전적 변형을 개선하는 데 사용될 수 있다. 여기에 설명된 것은 3개의 중요한 공공 옥수수 근친선에 대한 아그로박테리움-매개유전형형(QuickCorn) 프로토콜이다.

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이 논문은 단일 세포 및 핵의 염기서열 분석을 위한 gastrulating mouse embryos의 고품질 single-cell 및 nuclei suspensions를 위한 파이프라인을 설정합니다.

돌연변이 전체 마우스 배아의 단일 세포 RNA 염기서열 분석: epiblast에서 gastrulation 말기까지

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Xenopus mini 배아를 생성하기 위한 신체 조작

배우세요 Medicago truncatula를 이용한 식물 초기 배아 발생의 유전적 규제 연구 방법을 배우세요. 이 프로토콜은 포드 형태와 배아 발달 단계를 연결하고 체세포 배아 배양 기술을 활용하여 유전자 발현을 분석하는 데 도움을 줍니다.

모델 콩과 식물에서 초기 배아 발달의 규정 유학을위한 접합체 및 체세포 배아를 얻기위한 프로토콜

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