의 수직 이미지 초파리 계란 챔버

이 절차의 전반적인 목표는 초파리 난실의 극에 대한 고해상도 이미징을 가능하게 하는 것입니다. 이것은 먼저 난소를 절개하고 형광 항체로 염색함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 관심 있는 난실을 식별하고 분리하는 것입니다.

다음으로 선택된 샘플은 방향을 지정하고 정렬한 다음 글리세린 젤리 블록에 삽입됩니다. 마지막 단계는 블록을 자르고 회전하여 계란 챔버를 장착하여 장축이 수직이 되도록 하는 것입니다. 궁극적으로, 컨포칼 현미경은 난자 챔버의 극에서 세포 및 하위 세포 조직을 밝히는 데 사용됩니다.

경계 세포 배열과 같은 상피, 광학 절편 및 알고리즘 3D 재구성을 통해 이미징 평면에 수직인 표본을 보는 기존 방법은 광표백 및 광 산란을 유발할 수 있으며 해상도가 낮아 정확도가 떨어지는 이미지를 생성할 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 표본을 새로운 각도로 장착하고 직접 볼 수 있다는 것입니다. 우리는 이 기술을 사용하여 발달 중인 난실의 극을 이미지화하여 난포 세포의 조직에 대한 통찰력을 제공했습니다.

이 방법의 시각적 시연은 염색 표본의 미세 조작과 기존 관점에서 샘플의 방향 변경이 필요하기 때문에 준비 및 장착 단계를 배우기 어렵기 때문에 매우 중요합니다. 이 절차를 시연하는 것은 Lathea가 제 연구실에 있는 대학원생을 관리하는 것입니다. 실험을 시작하려면 유리 함몰 슬라이드를 구하고 각 캐비티에 여러 방울의 박리 매체를 피펫으로 주입합니다.

이산화탄소로 파리를 마취하고 해부 현미경 아래에 놓습니다. 다음으로, 암컷 파리 한 마리가 날개를 아래로 향하고 머리를 왼쪽으로 향하게 합니다. 주로 사용하지 않는 손으로 양손의 집게를 탁자에 대해 30도 각도로 잡습니다.

집게를 사용하여 파리를 집습니다. 흉부 근처의 복부 앞쪽에 있는 파리를 잡고 해부 매체에 담그십시오. 움푹 들어간 곳에서 다른 한 쌍의 집게로 미끄러집니다.

복부 뒤쪽의 복부 뒤쪽에 있는 외골격을 잡고 뚫습니다. 뒤쪽 끝에 있는 난소를 잡은 다음 복부에서 꺼내 함몰 슬라이드의 반대편에 있는 신선한 배지에 넣습니다. 그런 다음 가장 큰 난자 챔버 근처의 뒤쪽 끝에 있는 난소를 잡고 다른 손으로 가장 앞쪽에 있는 난자 챔버 중 하나를 꼬집거나 천천히 꾸준히 잼을 합니다.

난소초에서 난소 사슬을 당겨 빼내고 원하는 모든 난실이 제거될 때까지 난소를 개별적으로 계속 해부합니다. 박리가 완료되면 플라스틱 이송 피펫을 사용하여 난소를 0.6ml 튜브로 옮기고 난소가 튜브 바닥에 가라앉도록 합니다. 피펫을 사용하여 난소에서 가능한 한 많은 박리 매체를 조심스럽게 제거합니다.

새 튜브에서 난소 또는 난자를 제거하지 않도록 주의하십시오. 50마이크로리터의 0.1몰 인산칼륨 완충액 150마이크로리터에 16%파라 포름알데히드 50마이크로리터를 첨가하고 이를 난실에 추가합니다. 10분 동안 흔들면서 배양하십시오 배양 후 고정액을 제거하십시오.

NP 40 버퍼로 두 번 헹군 다음 실온에서 각각 15분 동안 0.5ml의 NP 40 버퍼로 안테나에서 두 번 세척합니다. 고정 및 세척 후 1차 항체를 추가하고 배양 후 섭씨 4도에서 밤새 또는 실온에서 3시간 동안 난소를 배양합니다. 실온에서 0.5ml의 NP 40 버퍼로 샘플을 20분 동안 4회 세척합니다.

그런 다음 1-200 희석으로 2차 항체를 추가하고 난소를 섭씨 4도에서 3시간 또는 밤새 배양합니다. 다음으로, 1에서 1000 사이의 희석으로 DPI를 추가하고 10분 동안 난소를 배양합니다. 그런 다음 실온에서 세척당 20분 동안 0.5ml의 NP 40 세척 버퍼로 샘플을 4회 세척합니다.

면역형광 또는 IF 프로토콜이 완료되면 PBS에 함유된 50% 글리세롤 200마이크로리터를 난자 챔버에 첨가하고 빛을 차단한 실온에서 2시간 동안 방치합니다. 용액을 제거한 다음 PBS의 70% 글리세롤로 교체하고 튜브를 호일로 덮습니다. 장착할 준비가 될 때까지 샘플을 섭씨 4도에서 보관하십시오.

글리세린 젤리를 준비하기 위해 주걱으로 부분 표본 글리세린 젤리를 15ml 파이렉스 유리 배양 튜브를 채우고 글리세린 젤리를 섭씨 55도의 수조에서 30분 동안 녹입니다. 한편, 원액에서 300마이크로리터의 글리세롤 한 방울을 두 개의 현미경 슬라이드에 놓습니다. 티슈를 사용하여 글리세롤을 각 슬라이드에 얇은 층으로 펴 바릅니다.

글리세린 젤리를 쉽게 제거할 수 있는 베이스를 제공합니다. 글리세린 젤리가 완전히 녹았는지 확인하십시오. 다음으로, 여과된 1000마이크로리터 피펫 팁의 팁을 잘라내고 1000-1, 500마이크로리터의 따뜻한 글리세린 젤리를 기포 형성을 방지하도록 주의하면서 각 현미경 슬라이드에 천천히 옮깁니다.

글리세린 젤리 슬라이드를 실온에서 5분 동안 그대로 두어 각 글리세린 젤리를 레이스로 고정합니다. 60mm x 15mm 페트리 접시에 밀어 넣습니다. 접시를 플라스틱 랩으로 덮고 슬라이드를 섭씨 4도에서 밤새 보관하십시오.

이전에 준비된 샘플에서 70% 글리세롤이 섞인 3마이크로리터의 난자 챔버를 하나의 글리세린 젤리 슬라이드에 걸쳐 여러 방울 피펫팅합니다. 모든 계란 챔버가 슬라이드에 올 때까지 3마이크로리터 방울을 계속 피펫팅하고 각 방울에 최소 10개의 계란 챔버가 포함되어 있는지 확인합니다. 다음으로, 글리세린 젤리의 배양 튜브를 섭씨 55도의 수조에서 가열하고, 해부 현미경으로 난실이 있는 글리세린 젤리 슬라이드를 놓고 시야에 한 방울의 난자만 나오도록 배율을 조정합니다.

30게이지 바늘을 숟가락으로 사용하여 필요할 때 원하는 스테이지 계란 챔버를 집습니다. 이미징을 방해할 수 있는 파편을 피하기 위해 바늘을 칼로 사용하여 난소 사슬에서 원하는 난실을 분리합니다. 계란 챔버를 두 번째 글리세린 젤리 슬라이드로 옮깁니다.

앞쪽이 왼쪽을 향하도록 기둥에 최소 7개의 난자가 정렬될 때까지 이 단계를 반복합니다. 바늘로 파편이나 원치 않는 난자를 긁어내고 원하는 모든 난자가 두 번째 글리세린 젤리로 옮겨질 때까지 7개의 새로운 열을 만들고 작은 Kim 물티슈 조각을 비틀어 각 난자를 가볍게 만져 난자실에서 여분의 PBS 글리세롤을 흡수합니다. 달걀 챔버를 제거하지 않도록 주의하십시오.

필터 끝을 잘라내고 200마이크로리터 피펫 팁을 절단하고 150마이크로리터의 글리세린 젤리를 전달하여 난실 챔버의 모든 열을 덮습니다. 현미경으로 모든 난자 챔버 컬럼이 덮여 있는지 확인합니다. 장착된 난실을 글리세린 젤리의 최상층이 완전히 응고될 때까지 실온에서 5분 동안 그대로 두십시오.

그런 다음 60mm x 15mm 페트리 접시에 장착된 달걀 챔버 슬라이드를 놓고 플라스틱 랩으로 덮습니다. 글리세린 젤리 층이 어둠 속에서 서로 응고될 수 있도록 접시를 섭씨 4도에서 밤새 보관하십시오. 광표백이 발생할 수 있는 경우, 장착된 난자 챔버의 슬라이드를 해부 현미경 아래에 놓습니다.

난자 챔버의 한 열만 시야에 있도록 배율을 조정합니다. 45도 각도의 소형 메스를 사용합니다. 난실의 첫 번째 기둥의 오른쪽을 따라 난실의 뒤쪽에 가까운 직선을 자릅니다.

다음으로, 기둥의 맨 위에 있는 첫 번째 난자 챔버 위와 마지막 난실 아래를 잘라 이제 난자가 세 면으로 절단되도록 합니다. 마이크로 나이프를 사용하여 기둥의 왼쪽을 따라 난자 챔버의 앞쪽에 최대한 가깝게 자릅니다. 그런 다음 100 마이크로 리터의 차가운 XPBT를 원형과 주걱으로 절단 된 기둥 위에 피펫합니다.

난실의 절단 기둥 3면 주위의 과도한 글리세린 젤리를 제거하고 초과분을 버립니다. 난자 챔버의 앞쪽에 만들어진 절단면에 주걱을 삽입하고 1차 글리세린 젤리 블록에서 컬럼을 분리하여 슬라이드에 장착하고 이미징을 진행합니다. 직립 이미징 방법을 사용하면 8단계에서 전방 여포 상피의 세포 조직을 직접 시각화할 수 있습니다.

여포 황산염, 눈이 없거나 IA 단백질이 없는 경우, 핵 DNA 마커 DPI에 대한 일반적인 마커는 이 세포 영역 전반에 걸쳐 균일한 발현을 보여주며 모든 세포가 유사한 염색 강도로 보일 수 있음을 보여줍니다. 난자 챔버에 대한 기존의 관점은 알 챔버의 3차원 재구성에 의해 생성된 온 뷰와 대조됩니다. 삽입은 회전된 액시를 보여줍니다.

x축이 아래쪽입니다. 이제 Z축은 왼쪽을 향하고 Y축은 뷰어를 향합니다. 개별 셀은 Z축의 낮은 해상도로 인해 흐려집니다.

따라서 새로운 접근 방식은 상당한 이미징 개선을 나타냅니다. 직립 이미징 방법은 9기 난실의 전방 상피를 효과적으로 시각화합니다. 이 발달 단계에서 경계 세포는 극 세포 주위로 함께 합쳐집니다.

이러한 압축된 클러스터는 엔돈 이미징으로 관찰됩니다. 이 비디오를 시청한 후에는 새로운 보기 관점을 사용하도록 샘플을 탑재하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 우리는 이 기술을 사용하여 선택된 단계에서 발달 중인 난실의 극을 이미지화했습니다.

이 일반적인 기술은 초파리, 난자 형성의 다른 단계 또는 다른 유형의 작은 조직에 사용할 수 있습니다.