Name: 마우스에 콜드 민감도 및 적응을 결정하기위한 간단하고 저렴한 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: 배우세요 마우스의 냉각 반응성과 적응을 측정하는 Cold Plantar Assay 방법을. 이 프로토콜은 건조한 드라이 아이스 펠릿과 스톱워치를 사용하여 철회 잠복 시간을 측정하며, 냉각 과민성과 진통 효과를 평가하는 신경과학 연구에 활용됩니다.

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저자는 원고 편집을 위한 전체 Gereau Lab의 기여에 감사를 표합니다. 이 작업은 DSB에 대한 NINDS 자금 1F31NS078852 및 RWG에 대한 NINDS 기금 NS42595의 지원을 받습니다.

모든 마우스 프로토콜은 건강 지침 국립 연구소에 따라이었고, 의학의 워싱턴 대학의 동물 연구위원회 (세인트 루이스, MO)에 의해 승인되었다. 1. 테스트 판 및 인클로저 준비 <ol><li> 유리 표면을 청소합니다. </li><li> 실험실 테이프로 유리판의 중앙에 표면에 T 형 필라멘트 열전쌍 프로브를 고정. </li><li> 플레이트의 중앙을 따라 한 줄로 유리 접시에 동물 인클로저를 놓습니다. </li><li> 중앙 동물 인클로저를 통해 열전쌍 프로브를 끼 우고 데이터 로거에 연결합니다. 자동 종료 기능을 비활성화하는 동안의 데이터 로거를 켜고 제공된 케이블로 컴퓨터에 데이터 로거를 연결합니다. <ol><li> 실험 기간 동안 판의 온도를 기록하는 경우, 플레이트 온도 기록을 시작하기 위해 데이터 로거 소프트웨어를 엽니 다. </li><li> 필요하다면, 다시 소프트웨어를 조정코드 플레이트 온도 매초마다. </li><li> 열 데이터 로거와 함께 패키지 소프트웨어를 사용하여 온도를 기록 시작합니다. </li></ol></li><li> 마우스 사이의 시각적 상호 작용을 방지하기 위해 검은 삽입 인클로저를 분리합니다. </li><li> 위치는 인클로저의 밑면이 편안한 장착 위치에서 볼 수 있도록 유리 아래에 반영한다. </li></ol> 2. 온난화 / 유리 접시를 냉각 <ol><li> 가온 물에 젖은 얼음, 드라이 아이스 알루미늄 상자를 채우고 유리판 상에 적절하게 위치 (드라이 아이스로 채워진 알루미늄 호일 패킷과 같은 유리를 냉각하기 위해 사용될 수있다;도 1) 2. <ol><li> 30 ° C에서 테스트를 위해, 멀리 동물 인클로저 (그림 2B) 2에서 &#39;약 0.25 알루미늄 상자를 배치합니다. <ol><li> 유리 기판의 양측에 가열 된 물이 순환 장치를 설정한다. 45 서큘 레이터 설정 - 60 ° C가, 우리뜨거운 물 (그림 1C) 2의 꾸준히 알루미늄 상자를 채우기 위해 전자. </li><li> 서큘 레이터의 위치를 같은 알루미늄 상자에서 뜨거운 물이 다시 직접 각면 (그림 1C)에 순환의 저수지에 배수 것을 2. </li></ol></li><li> 실온에서 테스트를 위해 상자를 빈 (그림 2) (2)를 둡니다. </li><li> (그림 2) 17 ° C에서 테스트를 위해, 거리 양쪽에 동물 우리에서 &#39;약 0.25 상자를 놓고 젖은 얼음 채우기 2. </li><li> (그림 2) 12 ° C에서 테스트를 위해, 거리 양쪽에 인클로저에서 &#39;약 1.25 상자를 놓고 드라이 아이스 채우기 2. </li><li> (그림 2) 5 ° C에서 테스트를 위해 약 0.25 &#39;&#39;거리 양쪽에 인클로저에서 상자를 놓고 드라이 아이스 채우기 2.<ol><li> 드라이 아이스와 유리를 냉각 할 때, 방에 이산화탄소 발생을 방지하기 위해 통풍이 있는지 확인하십시오. </li></ol></li></ol></li><li> 원하는 온도 범위에 도달하는 유리 기다립니다. </li><li> 접시에 인클로저에 마우스를 추가합니다. 주 : 백색 잡음 발생기 잡음 교란을 감소하기 위해 사용될 수있다. </li><li> 마우스 적응 기다립니다. 참고 : 우리 시설에서이 약 2.5 시간이 필요하지만이 동물 하우징 및 취급 조건에 따라 상당히 다를 수 있습니다. </li><li> 상자를 따뜻하게 물, 젖은 얼음 또는 드라이 아이스의 전체 유지하도록하여 원하는 온도 범위에서 유리를 유지한다. 참고 : 우리의 장치와 함께 상자 얼음 대략 매 90 분 리필 할 필요가있다. 주 : 17 ° C 조건의 경우,이 얼음을 보충하기 전에 배수 구멍을 통해 알루미늄 상자에서 대부분의 물을 비우는 것이 도움이된다. 이것은 더 나은 온도, 및 PR을 안정화이벤트 오버 플로우 주 : 드라이 아이스의 정확한 양은 계절에 따라 다르지만, 일반적으로 온도를 일정하게 유지한다 상자의 전체 길이를 따라 완전 이상 박스 ¼ 유지한다. </li></ol> 고정 온도에서 3. 테스트 마우스 <ol><li> 행동 방 밖에서, 드라이 아이스의 전체 절반에 대한 얼음 양동이를 입력합니다. </li><li> 망치 또는 망치를 사용하여 미세 분말로 드라이 아이스를 분쇄. 참고 : 버킷을 너무 가득 채우면하는 것은 어려운 완전히 분말로 드라이 아이스 호감을 만들 것입니다. </li><li> 직선 면도날이나 가위를 사용하여, 3 ML의 주사기를 상단을 잘라. </li><li> 21 G 바늘을 사용하여, 주사기 (6 구멍 전체)에 대향하는 측면 (3) 구멍을 찌를. 주 : 드라이 아이스를 압축하면서이 구멍은 승화에 의해 생성 된 압력이 감소한다. 컷오프 주사기 여러 실험을 위해 재사용 될 수있다. </li><li> 주사기, 드라이 아이스 분말, 및 행동 방에 휴대용 스톱워치를 가져 가라. </li><li> 드라이 아이스 분말의 절반 전체 주사기 챔버를 입력합니다. 평면 객체와 주사기의 절단 끝을 잡고 단단히 플런저를 사용하여 분말을 압축합니다. 주의; 플라스틱 플런저는 구부리거나 압력에서 중단 될 수 있습니다. 이 경우, 새로운 주사기에서 플런저를 교체합니다. </li><li> 주사기의 가장자리를지나 압축 된 드라이 아이스 펠릿의 끝을 확장합니다. </li><li> 휴식을 충분히입니다 테스트 마우스. <ol><li> 30 ° C, 23 ° C, 17 ° C에서 4 유리에 발 및하지를 테스트 마우스는 이동하지만, 19 완전히 잠이 없습니다. </li><li> 12 ° C 5 ° C에서, 이동하거나 점프 2 발, 4 발과하지에있는 테스트 마우스. </li></ol></li><li> 부드럽게, 타겟팅을 위해 거울을 사용하여 단단히 마우스 뒷발 (그림 1A)이 아래 유리 표면에 평평 펠릿 플러시를 누릅니다. 손으로 타이머를 시작합니다. </li><li> 타이머를 중지하고 마우스가 떨어져 냉각 된 유리에서 이동할 때 펠렛을 제거합니다. 참고 : 철수 운동이 수직 또는 수평이 될 수 있습니다. <ol><li> 마우스가 매우 간략하게 발을 이동 한 후 냉각 표면에 반환하는 경우 마우스가 떨어져 영구적 인 이동을하게 될 때까지, 타이밍과 자극을 계속합니다. 참고 : 우리 연구소는 대부분의 경우에 마우스 20 초 최대 자극 시간을 사용합니다. </li></ol></li><li> 각 동물의 각 발에 3 개 이상의 값을 수집 할 때까지이 테스트 절차를 반복합니다. 적어도 15 분에 의해 단일 ​​발에 적어도 7 분, 별도의 연속 시험하여 동일한 마우스에 반대 발을 테스트 별도의 시험. </li><li> 필요한 경우, 냉각 (그림 3) (1)의 서로 다른 속도를 생성하는 유리의 다른 두께를 사용합니다. 주 : 냉각 속도가 반비례 유리의 두께와 상관된다. </li></ol> 4. 콜드 적응하는 동안 마우스를 테스트 주 :이 작은지면 유리로 테스트 할 수 대체 프로토콜전자는 오히려 판을 안정화하고 마우스가 완전히 추운 환경에 적응 한 번 이상, 냉각시킨다. <ol><li> 장치를 설정하는 제 1 절에 나와있는 지침을 따르십시오. </li><li> RT (그림 7A) 2에서 기준 측정을 수행하기 위해 제 3 절에 나와있는 지침을 따르십시오. </li><li> 드라이 아이스와 알루미늄 상자를 사전 냉각. </li><li> 기준 철수 대기 시간을 측정 한 후, 멀리 인클로저의 양쪽에 접시 약 1.25 &#39;&#39;의 미리 냉각 된 상자의 위치 (그림 7a는, 화살표가 표시된 &quot;드라이 아이스 추가&quot;) 2. </li><li> 유리 접시가 냉각됨에 따라 가능한 한 자주 측정을, 측정을 수행 할 제 3 절에 나와있는 지침을 따르십시오. </li></ol>

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CPA는 마우스의 냉감 민감성과 냉기 적응을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 다양한 온도 범위에서 억제되지 않고 적응한 동물의 냉기 반응을 측정하는 저렴하고 효율적인 방법을 제공합니다. 또한 쉽게 정량화되고 분석되는 출력 변수를 통해 명확한 행동 응답을 제공합니다. 염증1, 신경병성 손상1, 진통제1, 유전적 녹아웃20 및 유전적 뉴런 절제 연구26에 의해 유발된 냉감도의 변화를 평가하는 데 이미 사용되었습니다. 다양한 두께의 유리를 사용하여 다양한 냉각 속도에 대한 반응을 측정하도록 수정할 수 있으며, 적용되는 냉자극의 크기는 다양한 크기의 주사기를 사용하여 변경할 수 있습니다. 
이 분석을 올바르게 수행하기 위한 가장 중요한 단계는 테스트 중에 유리판을 고르게 냉각하거나 예열하는 것입니다. 알루미늄 상자를 동물 인클로저의 양쪽에 균일한 간격으로 배치하도록 조심스럽게 ...

설치류 냉 반응성 측정은 모두 정상 및 병리학 적 조건 하에서 인간 감기 감도의 전위 메커니즘에 대한 이해를 향상시키는 것이 중요하다. 콜드 발바닥 분석 (CPA)는 원래 전 1 몇 년이, RT에 전달 차가운 자극에 재현, 모호하지 않은 쥐의 행동 반응을 생성하도록 설계 개발했다. 이러한 분석의보다 최근의 개선이 온도의 넓은 범위에서 감기 감도 측정 재현성있게되었다. 두 버전은 상대적으로 높은 처리량, 사용이 저렴하도록 설계되어 있습니다. 진보는 많은 다른 방법을 이용하여 행동 민감성 감기 메커니즘을 이해에서했다. 하나의 방법은 dabbing 또는 마우스 발에 분사하고 아세톤 마우스 발바닥 3,4 플릭 소비하는 시간의 양을 측정하는 것을 포함 아세톤 증발 시험이다. 불행하게도,아세톤의 증발에 대한 응답은 젖은 감각과 아세톤의 냄새에 의해 혼동된다. 또한, 아세톤 증발 시험에서인가되는 냉 자극을 적용 아세톤의 양을 기준으로 정량화하기 어렵다 변할 수있다. 마지막으로, 손상되지 않은 마우스는 기준선 아세톤 최소한 응답이 불가능이 방법 과민증의 부재 진통을 측정 할 수있다. 차가운 반응에 대한 또 다른 고전적인 분석은 꼬리가 차가운 물 5,6에 침지 한 후 철수 대기 시간을 측정 꼬리 영화 분석이다. 이 분석에서 행동 반응가 명확한 및 분석은 특정 온도에 대한 반응을 측정하는 동안, 동물은 잘 설명 스트레스 유발 진통 메커니즘 (7)를 통해 차가운 응답을 변경할 수있는, 테스트 기간 동안 억제해야합니다. 일반적으로 사용되는 또 다른 도구는 행동을 측정하는 냉각 판 테스트입니다마우스의 응답은 그들이 펠티어 냉각 판 8-10에 배치 된 후. 이 도구는 특정 온도에서 동물의 응답에 대한 정보를 제공하지만, 그것은 또한 일관성없이 사용되어왔다; 상이한 그룹 점프 8,11 수, 제 13 8,11- 응답 대기 시간을 포함한 다른 종류의 반응을 측정하고, 발과의 수는 매우 다른 결과 11,13,14 리프트. 콜드 플레이트 분석은 한번에 시험 할 수 하나만 동물로 비교적 낮은 스루풋이며 비싸고 깨지기 펠티에 소자를 필요로한다. 2 판 온도 환경 시험 동물이 서로 다른 온도 9,15- (17)이 연결 판에 보내는 시간의 상대적인 양을 측정 냉각 판 시험의 일반적으로 사용되는 파생 상품이다. 또 다른 유사한 분석은 일반적으로 사용되는 열 구배 분석 생쥐으로 다른 온도 대에서 보내는 시간의 양긴 금속 접시에 5 ° C와 45 ° C 사이의 범위는 (16)을 측정한다. 이러한 분석은 온도의 비교를 할 수 있지만, 그것은 행동이 온도 회피 또는 온도 취향을 나타내는 지 여부를 명확하지 않다. 마지막으로, 냉각 판 동적 분석은 마우스 (18) 주변의 온도 변화에 어떻게 반응하는지 측정하기 위해 사용되었다. 이 방법은 RT의 펠티어 장치에 마우스를 놓고 마우스 점프 또는 다른 판의 온도에서 자신의 발을 핥고 얼마나 측정하면서 1 ° C로 낮아진다 포함한다. 이 마우스는 냉각 환경에 적응하는 방법을 테스트하는 동안, 마우스는 냉각기 주위 온도의 환경에서 냉 자극에 반응하는 방법을 테스트하기위한 방법을 제공하지 않는다. 또한, 그것을 수행하기 위해 고가의 장비를 필요로하며, 그 감기 감도를 측정하기 전에 테스트 장비에 쥐를 적응 방법을 제공하지 않는다. 이러한 분석을 보완하기 위해, CPA는 ACCLIMA을 테스트다양한 온도 범위에서 잘 정의 냉 자극에 응답 테드 또는 차가운 주변 온도에 적응하는 과정. 그것은 저렴한 비용으로 높은 처리량 테스트를 위해 확장 할 수있는 가능성과 함께, 우리의 현재 장치에 한 번에 14 마우스까지 테스트 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>T 형 열전대 프로브</td><td>Physitemp</td><td>IT-24p</td><td>유리의 표면 온도를 측정하는 데 사용 (http://www.physitemp.com/products/probesandwire/)</td></tr><tr><td>유리판</td><td>지역 유리 회사 (St. Louis, Stemmerich Inc)</td>우리는 파이렉스 유리 (붕규산 플로트)<td></td><td>를 사용합니다. 우리 연구실은 일반적으로 1/4 "를 사용하지만 3/16 "및 1/8"도 유용한</td></tr><tr><td>열 데이터 로거</td><td>Extech</td><td>EA15</td><td>Thermologger 유리 온도 (http://www.extech.com/instruments/product.asp?catid=64&prodid=408)</td></tr> <tr><td>3 ml 주사기</td><td>BD</td><td>309657</td><td>상단을 절단하고 주사기에서 드라이 아이스를 압축하여 콜드 프로브</td></tr><tr><td>컴퓨터를</td> <td>생성합니다.Extech 로거를 사용하는 경우, 모든 Pcwill 작업</td><td></td><td></td></tr><tr><td>알루미늄 상자</td><td>워싱턴 대학교의 세인트루이스 기계 공장</td><td></td><td>상자는 길이 3', 너비 4.5', 높이 3'이며 뚜껑이 밀봉되어 있습니다.&nbsp; 바닥 근처의 각 상자의 한쪽 짧은면에 1/2 "구멍이 뚫려 있습니다. 이 구멍은 상자에 젖은 얼음이나 뜨거운 물이 채워질 때 고무 마개로 채워집니다.</td></tr><tr><td>가열수 순환기</td><td>VWR</td><td></td><td>펌프가 있는 모든 물 순환기 모델이 작동합니다</td></tr><tr><td>21G 바늘</td><td>BD</td><td>305165</td><td>정확한 바늘 크기는 중요하지 않습니다</td></tr><tr><td>핸드 타이머</td><td></td><td></td><td>모든 핸드 타이머가 작동합니다</td></tr><tr><td>거울</td><td></td><td></td><td>모든 평면 거울이 작동합니다</td></tr></tbody></table>

마우스에 콜드 민감도 및 적응을 결정하기위한 간단하고 저렴한 방법

A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice

한랭 과민증은 심각한 임상적 문제로, 광범위한 환자에게 영향을 미치고 삶의 질을 현저히 저하시킵니다. 저온 발바닥 분석법을 사용하면 생쥐의 추위 민감도를 객관적이고 저렴하게 평가할 수 있으며 진통과 과민증을 모두 정량화할 수 있습니다. 쥐는 유리판에 순응하고 압축된 드라이아이스 펠릿을 뒷발 아래의 유리 표면에 대고 고정합니다. 냉각 유리에서 인출까지의 대기 시간은 추위 민감도의 척도로 사용됩니다.
차가운 느낌은 계절에 따라 온도가 변하는 지역에서 생존하는 데도 중요하며, 민감도를 유지하기 위해 동물은 주변 온도에 맞게 열 반응 임계값을 조정할 수 있어야 합니다. 또한 CPA(Cold Plantar Assay)를 통해 30°C에서 5°C 범위의 온도에서 마우스의 저온 민감도를 테스트하여 주변 온도 변화에 대한 적응을 연구할 수 있습니다. 마우스는 상기와 같이 순응하지만, 유리판은 뜨거운 물, 젖은 얼음 또는 드라이 아이스로 채워진 알루미늄 상자(또는 알루미늄 호일 패킷)를 사용하여 원하는 시작 온도로 냉각됩니다. 플레이트의 온도는 필라멘트 T형 열전대 프로브를 사용하여 중앙에서 측정됩니다. 플레이트가 원하는 시작 온도에 도달하면 위에서 설명한 대로 동물을 테스트합니다.
이 분석을 통해 무해한 온도에서 유해한 온도까지 다양한 온도에서 마우스를 테스트할 수 있습니다. CPA는 다치지 않은 마우스에서 명확하고 일관된 행동 반응을 생성하며 과민증과 진통을 모두 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 CPA를 사용하여 마우스의 추위 과민증, 진통 및 적응을 측정하는 방법을 설명합니다.

30 ° C, 23 ° C, 17 ° C, 12 ° C에서 시작 마우스에서 유발 행동 반응이 높은 재현성 (그림 4A) (20)이다. 뒷발에 따라 발생되는 냉 자극을 측정하기 위하여, 마우스를 케타민 / 자일 라진 / 아세 프로 마진 칵테일로 마취하고 그의 발은 T 형 필라멘트 열전대 (도 4b) (20)의 상부에 유리에 고정 하였다. 유리 냉각하거나 원하는 테스트 범위로 가온 하였다. 판은 판 (도 5a) (2)의 길이를 따라 균일하게 냉각되어 있지만, 저온 구배가 동작 인클로저 (도 5B)이 양단에 발생되는 것은 아니다. 중앙부가 약간 따뜻 (도 5b)을 2 동안 인클로저의 양쪽에 드라이 아이스에 가까운 인클로저 부분은 냉각기이...

Cold Plantar Assay(CPA)는 30°C에서 5°C 사이의 추위 반응성을 측정하고 추위 적응도 측정할 수 있습니다. 이 프로토콜은 CPA를 사용하여 마우스의 추위 과민증, 진통 및 적응을 측정하는 방법을 설명합니다.

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life.  The cold ...

본 절차의 전반적인 목표는 마우스의 추위 반응성을 측정하는 것입니다. 이를 위해 먼저 유리를 원하는 온도로 냉각하거나 가열합니다. 두 번째 단계는 마우스가 안정을 취할 때까지 적응시키는 것입니다.세 번째 단계는 주사기 내에서 드라이아이스 분말을 압축하여 펠릿으로 만드는 것입니다. 마지막 단계는 드라이아이스 펠릿과 스톱워치를 사용하여 생쥐를 테스트하고 회피 잠복기를 측정하는 것입니다. 궁극적으로, 콜드 플랜터 분석법은 자유롭게 행동하는 생쥐의 냉각 반응성과 적응성을 측정하는 데 사용됩니다.아세톤 테스트나 콜드 플레이트 테스트와 같은 기존 분석법과 비교했을 때 본 분석법의 주요 장점은, 다양한 환경 조건 하에 기저 상태에서의 과민반응과 진통 효과를 모두 테스트할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 마우스의 냉각 반응에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 원숭이, 쥐 및 사람과 같은 다른 시스템에도 적용 가능합니다. 실험 절차는 본 연구실의 대학원생인 Daniel Brenner가 시연하겠습니다.유리 표면을 세척한 후, T형 필라멘트 열전대 프로브를 실험용 테이프를 사용하여 유리판 중앙 표면에 고정합니다. 동물 케이지를 유리판 중앙을 따라 일렬로 배치합니다. 그런 다음 열전대 프로브를 중앙 동물 케이지를 통해 통과시켜 데이터 로거에 연결합니다.데이터 로거의 전원을 켜고 자동 종료 기능을 비활성화하십시오. 제공된 케이블을 사용하여 데이터 로거를 컴퓨터에 연결하십시오. 마우스 간의 시각적 상호작용을 방지하기 위해 검은색 삽입물로 동물 케이지를 분리하고, 케이지 하단을 관찰할 수 있도록 유리 아래에 거울을 배치하십시오.테스트를 시작하려면, 동물 케이지 양옆의 유리판 위에 알루미늄 박스를 일정 거리로 배치하십시오. 30 °C에서 테스트하는 경우, 동물 케이지에서 0.25 inches 떨어진 곳에 배치한 알루미늄 박스에 가열 수조 순환기를 연결하십시오. 배수 구멍을 막은 상태에서 박스의 절반까지 물을 채우십시오.알루미늄 박스에서 나오는 온수가 각 측면의 순환기 저장조로 직접 배수되도록 순환기를 배치하십시오. 각 순환기에 물을 보충해야 합니다. 금속 박스가 채워지면, 순환기 온도를 45~60 °C로 설정하고 알루미늄 박스에 온수를 일정하게 흘려 채우십시오.유리가 원하는 온도 범위에 도달하면, 마우스를 플레이트 위의 인클로저에 넣습니다. 마우스가 장치와 온도에 적응하도록 합니다. 마우스는 2.5시간 동안 적응 과정을 거칩니다.순화 기간이 끝날 무렵, 아이스 버킷의 절반 정도를 드라이아이스로 채우고 망치나 말렛을 사용하여 드라이아이스를 가루 형태로 부숩니다. 이때 생쥐가 놀라지 않도록 행동 실험실 외부에서 작업하십시오. 다음으로, 면도날이나 가위로 3 mL 주사기의 윗부분을 잘라냅니다.그런 다음 21 gauge 바늘을 사용하여 주사기의 반대편 양쪽에 세 개씩 두 세트의 구멍을 뚫어, 행동실로 드라이아이스를 다시 가져가 압축하는 동안 승화로 인해 발생하는 압력을 줄입니다. 주사기 챔버의 절반을 드라이아이스 분말로 채웁니다. 주사기의 절단된 끝부분을 평평한 물체에 대고 플런저를 사용하여 분말을 단단하게 압축합니다. 압축된 드라이아이스 펠릿의 끝부분이 주사기 가장자리 밖으로 나오도록 밀어냅니다.이제 네 발이 모두 유리판 위에 있고 움직이지는 않지만 완전히 잠들지는 않은 마우스들을 테스트합니다. 거울을 통해 위치를 조준하여, 마우스의 뒷발 아래 유리 표면에 평평한 펠렛을 부드럽고 단단하게 밀착시킵니다. 동시에 타이머의 시작 버튼을 누릅니다.마우스가 냉각된 유리에서 수직 또는 수평 방향으로 멀어지면 타이머를 멈추고 드라이아이스 펠릿을 제거하십시오. 하지만 마우스가 발을 아주 짧게 움직였다가 다시 냉각 표면으로 되돌린 경우에는, 마우스가 완전히 멀어질 때까지 타이밍과 자극을 계속 유지하십시오. 만약 마우스가 냉각된 유리에서 멀어지지 않는다면, 20 seconds 후에 자극을 중단하십시오.17 °C에서 마우스의 각 발당 최소 3개의 값이 수집될 때까지 이 테스트 절차를 반복합니다. 방금 보여드린 실험 과정을 그대로 반복하되, 알루미늄 상자에 가열된 물을 채우는 대신 젖은 얼음을 사용하고 상자를 케이지로부터 약 0.25 inches 떨어진 곳에 배치하여 마우스를 테스트합니다. 12 °C에서는 드라이아이스를 사용하며, 상자를 케이지로부터 1.25 inches 떨어진 곳에 배치합니다.이 대체 프로토콜은 플레이트의 온도가 안정화된 후가 아니라 온도가 내려가는 동안 마우스를 테스트합니다. 이를 통해 장치를 설정한 후 마우스의 적응 과정을 실시간으로 테스트할 수 있습니다. 이전과 마찬가지로, 실온에서 측정값을 얻기 위해 앞서 설명한 대로 실험을 수행하십시오.실온에서 기저 잠복기를 측정한 후, 앞서 설명한 절차에 따라 빈 알루미늄 상자에 드라이아이스를 채우고 이를 인클로저 양옆으로 1.25 inches 거리에 배치합니다. 마지막으로 실험을 반복하여 유리판이 냉각됨에 따라 잠복기 측정값을 기록합니다.가능한 한 자주 측정값을 측정합니다. 이 그래프는 12 °C, 17 °C, 23 °C 또는 30 °C에서 시작한 마우스의 평균 회피 잠복기를 보여줍니다. 회피 잠복기는 모든 온도에서 일관되게 나타납니다.진통 효과는 여기에 표시된 것과 같이 cold planter assay를 사용하여 측정할 수 있습니다. kg당 1.5 mg의 모르핀을 피하 주사하면, 주사 60분 후 Bonferroni 사후 검정을 포함한 이원 분산 분석(two-way ANOVA)으로 측정한 결과, 주사 30분 후 마우스의 회피 반응 잠복기가 증가합니다. 모르핀 주사군과 식염수 주사군 사이에 유의미한 차이는 없습니다.마우스의 과민반응 또한 여기서 측정할 수 있습니다. 완전 프로이드 보조제(complete Freud's adjuvant) 10 µL를 발바닥 내에 주입하면, Bonferroni 사후 검정을 포함한 이원 분산 분석(two-way ANOVA) 측정 결과, 주입 2시간 및 3시간 후 마우스의 철회 잠복기(withdrawal latency)가 유의하게 감소합니다. 동일한 마우스에 4시간째에 모르핀을 피하 주입하였으며, Dunnett 사후 검정을 포함한 일원 분산 분석(one-way ANOVA) 측정 결과, 4.5시간째의 모든 철회 잠복기는 3시간째와 비교하여 유의하게 높았습니다.투여 5.5시간 후 모르핀이 대사되었을 때, Bonferroni 사후 검정을 포함한 이원 분산 분석(two-way ANOVA)으로 측정한 결과 CFA가 투여된 마우스는 여전히 식염수를 투여받은 마우스보다 낮은 회피 잠복기를 보였습니다. 냉각되는 환경 변화에 대한 적응은 이 분석법을 통해 실시간으로 측정할 수 있습니다. 야생형 마우스는 유리판이 냉각됨에 따라 동일한 회피 잠복기를 유지했는데, 이는 야생형 마우스가 CPA로 측정 가능한 수준보다 더 빠르게 냉각 온도에 적응함을 시사하며, CPA에서는 그룹 간에 유의미한 차이가 나타나지 않았습니다.하지만 PIP2 가수분해를 차단하기 위해 U 7 3 1 2 2를 마우스에 주입하면, 플레이트의 온도가 낮아짐에 따라 잠복기가 감소하며 이는 적응 능력이 손상되었음을 시사합니다. 일단 숙달되면, 순응 시간을 포함하여 이 기술은 5시간 이내에 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 깨어 있는 상태로 자유롭게 행동하는 마우스의 냉각 감각 및 적응력을 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 드라이아이스를 사용하는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 이 방법을 수행하는 동안 적절한 환기와 공기 정화가 이루어지는지 확인해야 함을 잊지 마십시오.

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