마우스에 콜드 민감도 및 적응을 결정하기위한 간단하고 저렴한 방법

본 절차의 전반적인 목표는 마우스의 추위 반응성을 측정하는 것입니다. 이를 위해 먼저 유리를 원하는 온도로 냉각하거나 가열합니다. 두 번째 단계는 마우스가 안정을 취할 때까지 적응시키는 것입니다.

세 번째 단계는 주사기 내에서 드라이아이스 분말을 압축하여 펠릿으로 만드는 것입니다. 마지막 단계는 드라이아이스 펠릿과 스톱워치를 사용하여 생쥐를 테스트하고 회피 잠복기를 측정하는 것입니다. 궁극적으로, 콜드 플랜터 분석법은 자유롭게 행동하는 생쥐의 냉각 반응성과 적응성을 측정하는 데 사용됩니다.

아세톤 테스트나 콜드 플레이트 테스트와 같은 기존 분석법과 비교했을 때 본 분석법의 주요 장점은, 다양한 환경 조건 하에 기저 상태에서의 과민반응과 진통 효과를 모두 테스트할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 마우스의 냉각 반응에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 원숭이, 쥐 및 사람과 같은 다른 시스템에도 적용 가능합니다. 실험 절차는 본 연구실의 대학원생인 Daniel Brenner가 시연하겠습니다.

유리 표면을 세척한 후, T형 필라멘트 열전대 프로브를 실험용 테이프를 사용하여 유리판 중앙 표면에 고정합니다. 동물 케이지를 유리판 중앙을 따라 일렬로 배치합니다. 그런 다음 열전대 프로브를 중앙 동물 케이지를 통해 통과시켜 데이터 로거에 연결합니다.

데이터 로거의 전원을 켜고 자동 종료 기능을 비활성화하십시오. 제공된 케이블을 사용하여 데이터 로거를 컴퓨터에 연결하십시오. 마우스 간의 시각적 상호작용을 방지하기 위해 검은색 삽입물로 동물 케이지를 분리하고, 케이지 하단을 관찰할 수 있도록 유리 아래에 거울을 배치하십시오.

테스트를 시작하려면, 동물 케이지 양옆의 유리판 위에 알루미늄 박스를 일정 거리로 배치하십시오. 30 °C에서 테스트하는 경우, 동물 케이지에서 0.25 inches 떨어진 곳에 배치한 알루미늄 박스에 가열 수조 순환기를 연결하십시오. 배수 구멍을 막은 상태에서 박스의 절반까지 물을 채우십시오.

알루미늄 박스에서 나오는 온수가 각 측면의 순환기 저장조로 직접 배수되도록 순환기를 배치하십시오. 각 순환기에 물을 보충해야 합니다. 금속 박스가 채워지면, 순환기 온도를 45~60 °C로 설정하고 알루미늄 박스에 온수를 일정하게 흘려 채우십시오.

유리가 원하는 온도 범위에 도달하면, 마우스를 플레이트 위의 인클로저에 넣습니다. 마우스가 장치와 온도에 적응하도록 합니다. 마우스는 2.5시간 동안 적응 과정을 거칩니다.

순화 기간이 끝날 무렵, 아이스 버킷의 절반 정도를 드라이아이스로 채우고 망치나 말렛을 사용하여 드라이아이스를 가루 형태로 부숩니다. 이때 생쥐가 놀라지 않도록 행동 실험실 외부에서 작업하십시오. 다음으로, 면도날이나 가위로 3 mL 주사기의 윗부분을 잘라냅니다.

그런 다음 21 gauge 바늘을 사용하여 주사기의 반대편 양쪽에 세 개씩 두 세트의 구멍을 뚫어, 행동실로 드라이아이스를 다시 가져가 압축하는 동안 승화로 인해 발생하는 압력을 줄입니다. 주사기 챔버의 절반을 드라이아이스 분말로 채웁니다. 주사기의 절단된 끝부분을 평평한 물체에 대고 플런저를 사용하여 분말을 단단하게 압축합니다. 압축된 드라이아이스 펠릿의 끝부분이 주사기 가장자리 밖으로 나오도록 밀어냅니다.

이제 네 발이 모두 유리판 위에 있고 움직이지는 않지만 완전히 잠들지는 않은 마우스들을 테스트합니다. 거울을 통해 위치를 조준하여, 마우스의 뒷발 아래 유리 표면에 평평한 펠렛을 부드럽고 단단하게 밀착시킵니다. 동시에 타이머의 시작 버튼을 누릅니다.

마우스가 냉각된 유리에서 수직 또는 수평 방향으로 멀어지면 타이머를 멈추고 드라이아이스 펠릿을 제거하십시오. 하지만 마우스가 발을 아주 짧게 움직였다가 다시 냉각 표면으로 되돌린 경우에는, 마우스가 완전히 멀어질 때까지 타이밍과 자극을 계속 유지하십시오. 만약 마우스가 냉각된 유리에서 멀어지지 않는다면, 20 seconds 후에 자극을 중단하십시오.

17 °C에서 마우스의 각 발당 최소 3개의 값이 수집될 때까지 이 테스트 절차를 반복합니다. 방금 보여드린 실험 과정을 그대로 반복하되, 알루미늄 상자에 가열된 물을 채우는 대신 젖은 얼음을 사용하고 상자를 케이지로부터 약 0.25 inches 떨어진 곳에 배치하여 마우스를 테스트합니다. 12 °C에서는 드라이아이스를 사용하며, 상자를 케이지로부터 1.25 inches 떨어진 곳에 배치합니다.

이 대체 프로토콜은 플레이트의 온도가 안정화된 후가 아니라 온도가 내려가는 동안 마우스를 테스트합니다. 이를 통해 장치를 설정한 후 마우스의 적응 과정을 실시간으로 테스트할 수 있습니다. 이전과 마찬가지로, 실온에서 측정값을 얻기 위해 앞서 설명한 대로 실험을 수행하십시오.

실온에서 기저 잠복기를 측정한 후, 앞서 설명한 절차에 따라 빈 알루미늄 상자에 드라이아이스를 채우고 이를 인클로저 양옆으로 1.25 inches 거리에 배치합니다. 마지막으로 실험을 반복하여 유리판이 냉각됨에 따라 잠복기 측정값을 기록합니다.

가능한 한 자주 측정값을 측정합니다. 이 그래프는 12 °C, 17 °C, 23 °C 또는 30 °C에서 시작한 마우스의 평균 회피 잠복기를 보여줍니다. 회피 잠복기는 모든 온도에서 일관되게 나타납니다.

진통 효과는 여기에 표시된 것과 같이 cold planter assay를 사용하여 측정할 수 있습니다. kg당 1.5 mg의 모르핀을 피하 주사하면, 주사 60분 후 Bonferroni 사후 검정을 포함한 이원 분산 분석(two-way ANOVA)으로 측정한 결과, 주사 30분 후 마우스의 회피 반응 잠복기가 증가합니다. 모르핀 주사군과 식염수 주사군 사이에 유의미한 차이는 없습니다.

마우스의 과민반응 또한 여기서 측정할 수 있습니다. 완전 프로이드 보조제(complete Freud's adjuvant) 10 µL를 발바닥 내에 주입하면, Bonferroni 사후 검정을 포함한 이원 분산 분석(two-way ANOVA) 측정 결과, 주입 2시간 및 3시간 후 마우스의 철회 잠복기(withdrawal latency)가 유의하게 감소합니다. 동일한 마우스에 4시간째에 모르핀을 피하 주입하였으며, Dunnett 사후 검정을 포함한 일원 분산 분석(one-way ANOVA) 측정 결과, 4.5시간째의 모든 철회 잠복기는 3시간째와 비교하여 유의하게 높았습니다.

투여 5.5시간 후 모르핀이 대사되었을 때, Bonferroni 사후 검정을 포함한 이원 분산 분석(two-way ANOVA)으로 측정한 결과 CFA가 투여된 마우스는 여전히 식염수를 투여받은 마우스보다 낮은 회피 잠복기를 보였습니다. 냉각되는 환경 변화에 대한 적응은 이 분석법을 통해 실시간으로 측정할 수 있습니다. 야생형 마우스는 유리판이 냉각됨에 따라 동일한 회피 잠복기를 유지했는데, 이는 야생형 마우스가 CPA로 측정 가능한 수준보다 더 빠르게 냉각 온도에 적응함을 시사하며, CPA에서는 그룹 간에 유의미한 차이가 나타나지 않았습니다.

하지만 PIP2 가수분해를 차단하기 위해 U 7 3 1 2 2를 마우스에 주입하면, 플레이트의 온도가 낮아짐에 따라 잠복기가 감소하며 이는 적응 능력이 손상되었음을 시사합니다. 일단 숙달되면, 순응 시간을 포함하여 이 기술은 5시간 이내에 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 깨어 있는 상태로 자유롭게 행동하는 마우스의 냉각 감각 및 적응력을 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 드라이아이스를 사용하는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 이 방법을 수행하는 동안 적절한 환기와 공기 정화가 이루어지는지 확인해야 함을 잊지 마십시오.