Name: 두뇌 활동의 중규모 넓은 필드 광학 이미징에 대한 큰 측면 개두술 절차 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: 배우세요 생쥐 대뇌피질의 측두엽과 두정엽에 걸친 대규모 일측 개두술 방법을 통한 중규모 넓은 필드 광학 이미징 기술입니다. 이 기술은 신경 역학 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 자연 과학 및 캐나다의 공학 연구위원회 (NSERC) 디스커버리 부여 # 40352에 의해 지원되었다, 캠퍼스 MHM에 혁신 프로그램 의자, 앨버타 알츠하이머 연구 프로그램에 대한 앨버타, 및 NSERC는 MK에 BIF 박사 교제와 AIHS 대학원 교제 CREATE. 우리는이 프로토콜의 개발 및 수술 훈련 푸 민 왕 감사하고, 베루 미르자 아그와 디 샤오 사육.

<html> 다음 프로토콜은 레스 브리지 동물 관리위원회의 대학 (ACC) 가이드 라인을 다음과 동물 관리에 캐나다위원회 (CCAC)의 기준에 따라 수행한다. 1. 준비 <ol><li> 장기간의 연구 기간 동안, 열려있는 모든 수술 소모품을 압력솥하고 불임 수술 동안 유지되어 있는지 확인합니다. 여러 수술이 필요한 경우 수술 사이의 오토 클레이브. </li><li> 한편 뇌 버퍼 많은 (적어도 50 ㎖)가 확인. 용액은 134 mM 염화나트륨, 5.4 mM의 칼륨, 1 mM의 염화 마그네슘 육수화물, 1.8 mM의 염화 칼슘 이수화 물, 및 5 mM의 HEPES 나트륨, 5 M 염화수소 7.4 평형 pH가 이루어진다. </li><li> 유도 챔버에 놓고 마우스를 마취 3 - 4 % 이소 플루 란. 수술하는 동안 유지 보수를 위해 2.0 %의 이소 플루 란 - 1.0 따릅니다. 영상 중 0.8 % - 또한 낮은 0.4로 감소S = &quot;외부 참조&quot;&gt; 5, 13, 14, 15, 제공된 적절한 마취를 유지한다. 마취의 이러한 낮은 수준은 고통스러운 자극에 areflexic 유지하기 위해 마우스 (약 5 분마다)의 경계 빈번한 모니터링이 필요합니다. 참고 : 탈수 마우스의 부피 비율로 인해 높은 표면에 문제가되고 이소 플루 란의 장시간 사용에 의해 악화 할 수 있습니다. <ol><li> 2 시간 - 식염수 피하 주사, 10 g의 체중 당 0.1 ㎖, 1 매 사용한다. 2 시간 - 충분히 수화 때 마우스마다 한 번씩 1 소변됩니다. </li></ol></li><li> 밀접하게 수술과 영상 전반에 걸쳐 일관된 마취을 보장하기 위해 마우스를 모니터링 할 수 있습니다. 무인 마우스를두고는 의식을 회복하지 않도록주의를하지 마십시오. </li><li> 37 ℃로 설정된 항온 조절 가열 패드에 머리 홀더 설정 장소로 ​​마취 된 마우스의 이동. 상단 TEET 보안치아 홀더 시간. </li><li> 약 30 °가 머리의 오른쪽 측면을 노출 왼쪽 방향으로 마우스의 머리를 돌려 귀 바 (그림 1A)의 뭉툭한 끝으로 마우스의 머리를 고정합니다. </li><li> 각막 건조를 방지하기 위해 안과 연고를 적용합니다. </li><li> 뇌부종을 줄이기 위해, (4 밀리그램 / kg)을 근육 주사 덱사메타손. </li><li> 4 % 클로르헥시딘 (3 회) 및 70 % 에탄올 (3 회)에 담근 면봉으로 외과 영역에 걸쳐 피부를 닦아주십시오. 한 번만 각 면봉을 사용합니다. </li><li> 돈 수술 장갑 및 접착제 플라스틱 포장으로 동물을 커버한다. 리도카인 주사하여 마취를 제공 (8-10 ㎎ / ㎏, 2 %의 에피네프린) 피하 개두술 사이트 위에. 약물이 조직에 흡수 될 때까지 5 분 - 3 기다립니다. </li></ol> 2. 피부를 제거하고 두개골에서 근육을 철회 <ol><li> 아래에있는 A 두개골을 보는 동안 거의 모든 절차를 수행해부 현미경 (예 : 0.7 - 4.5X 전력, 상황에 따라). </li><li> 집게로 (단지 귀 뒤에) 정중선의 왼쪽 피부 1mm를 들어 올려 수술 가위로 작은 수평 절개를합니다. </li><li> 오른쪽 귀쪽으로 6mm 측면 절단하고 머리의 주동이의 끝으로 컷 - 5합니다. </li><li> 초기 절개 시점에서, 가위를 삽입하고 rostrally 10mm를 잘라. </li><li> 오른쪽 귀 주위의 피부를 잘라 오른쪽 눈 근처에 두개골과 시간적 근육의 오른쪽을 노출 할 수 있습니다. 노광 영역의 가장 넓은 부분에 적어도 7mm 인 것을 확인. 수술 영역을 확장해야 할 경우 더 피부를 낸다. </li><li> 두개골과 피부 사이에 부틸 시아 노 아크릴 레이트 접착제의 몇 방울을 넣어 절개 주위의 피부를 수정합니다. 조직을 확인하는 것은 이전에 접착제의 효능을 증가시키는면 팁 어플리케이터 롤 또는 조직으로 건조되었다. </li><li> 면봉을 사용하여 표면을 문질러원 운동에 두개골의 두개골에서 골막을 제거한다. 아무도 완전히 두개골을 건조하여 남아 있는지 확인합니다. </li><li> 스프링 가위 집게를 사용하여, 두개골에서 시간적 근육 분리; 잘라는 squamosal 뼈 (그림 1C)를 도달 할 때까지 옆으로 근육을 수축. 눈 근처는 squamosal 뼈의 수준을 따라 실행하는 표면 시간적 정맥이 손상되지 않도록 세심한주의를 기울 그렇지 않으면 발생할 수있는 출혈. </li><li> 제어 겔 발포체 뇌 완충액에 미리 침지 출혈. 심각한 출혈의 경우 열 cauterizer를 사용합니다. 열 cauterizer 치료 다음과 출혈 사이트에 부틸 시아 노 아크릴 레이트 접착제를 삭제합니다. 영역은 접착제의 효능을 증가시키는면 팁 어플리케이터 롤 또는 직물을 이용하여 미리 건조 확인. </li></ol> 3. 개두술 주 : 외과 의사는 두개골 제거하는 동안 부지런을 유지해야하며,두라는 불필요한 합병증을 방지 할 수 있습니다. 문제 해결 단계는 합병증이 발생해야 포함되어 있습니다. <ol><li> 브레 그마 마크의 위치에 미세한 팁 마커 또는 하부 뇌 영역의 방향을 (도 2A)를 소형 삼각형 조각 테이프를 절단 정수리에서 코너 포인트 중 하나. </li><li> 헤드 플레이트를 부착하기 전에 두개골이 완전히 건조되어 있는지 확인합니다. 더 건조가 필요한 경우 뇌 완충액에 침지 겔 발포체의 도포 후에, 목화 팁 면봉을 사용하여 두개골 빠르게 공기 건조한다. 이 단계는 헤드 고정 플레이트 (도 1b)에 매우 중요하다. 참고 :이 골막 왼쪽 두개골에, 또는 두개골 머리 판에 접착 전에 건조하지 않은 경우, 그것은 분리 가능성이됩니다. 이 경우, 부드럽게 머리 판을 제거하고 다시 시작. 이 과정에서 발생할 수있는 출혈; 이 응고 할 몇 분을 허용하고 부드럽게 제거합니다. 이 과정은 두 번 이상 반복하지 않는 것이 좋습니다. </li> &lt;리&gt; 헤드 판 (16)의 하단 주위에 에틸 시아 노 아크릴 레이트 접착제를 적용하고 영역 개두술 (도 1d 및도 2a) 위에 헤드 판 접착제. </li><li> 치과 용 시멘트 만 개두술 영역 노출 떠나는 두개골 및 헤드 판의 개방 공간을 채운다. 10 분 (도 2B) - 치과 건조 시멘트 경화 일반적 5 기다린다. <ol><li> 시멘트가 설정되면, 간단히 뇌 버퍼 웰을 채우는 3 담가 있도록 - 5 분. (그림 2C)를 시추하기 전에 뇌 버퍼를 제거하는 압연 조직을 사용합니다. </li></ol></li><li> 가볍게 치과 드릴로 두개골의 표면을 득점하여 수술 영역을 설명합니다. FG ¼ 버로 (20 PSI의 최대로 설정) 공기 드릴을 사용하여 가변 속도 풋 페달로 제어. </li><li> 부드럽게를 깊게하는 원래의 점수를 따라 드릴을 추적, 전자드릴을 nsuring하면 뇌 (그림 2D)에 두개골을 관통하지 않습니다. 테이크는 드릴링 및 적신 압연 조직으로 두개골 표면을 뿌리며 마치 사이 몇 분 간격으로 변합니다. 이것은 기계적 마찰 장기간 노출 두개골의 가열 건조를 감소시킬 것이다. 참고 : 두개골 신속하게 젖은 젤 폼의 응용 프로그램 후 공기 건조합니다. 더 건조가 필요한 경우,면 팁 면봉을 사용합니다. 주의 : 두개골 두께가 고르지입니다. 두개골의 정중선 가까운 영역과는 squamosal 최적 비교적 얇고 예를 들면, 정수리 시간적 리지는 가장 두꺼운 영역이다. </li><li> 시추하는 동안 주기적으로 부드럽게 집게 또는 비 이동 드릴 비트와 함께 눌러서 두개골의 좌굴을 확인합니다. 뼈 버클하기 시작하면, 드릴링을 중지하고 뇌 버퍼의 전체 창을 담그지. 참고 : 혈액이 지역에서 러시 경우는 경막이 손상되었다는 것을 제안 할 수 있습니다. 이 경우, 주사 전자 현미경 (SEM)을 배치전 습윤 영역 위로 겔 발포체 부드럽게면 팁 면봉 겔 발포체에 압력을인가하면서 혈액을 흡수하려고. </li><li> 뼈를 부드럽게하고 두개골 제거 프로세스를 쉽게 만들기, 뼈에 부착 경질 가능성을 줄이기 위해 두개골을 제거하기 전에 최소 5 분 동안 기다립니다. </li><li> 두개골은 뇌 버퍼에 잠긴 상태에서 두개골 제거 프로세스를 수행합니다. 참고 : 두개골의 일부가 완고하게 부착 된 상태를 유지한다면, # 11 메스 블레이드가 부드럽게 두개골을 득점하는 데 사용할 수 있습니다. 두개골을 통해 뇌에 블레이드를 뚫지하기 위해 세심한주의를 기울입니다. </li><li> 앞쪽 가장자리에서 시작, 부드럽게 집게를 사용하여 경질의 느슨한 두개골을 들어 올립니다. 참고 : 출혈의 작은 금액이 두개골 제거 과정에서 발생하는 경우, 전송 피펫 또는 주사기로 버퍼를 제거한 다음 새로운 버퍼로 교체. </li><li> 뼈가 느슨하고 나면 집게로 뼈, 경막에 단단히 그립을 &quot;부동&quot;과에서 뼈를 들어 올려두라. 뼈는 결코 뇌에 침투 없어야합니다. </li><li> 출혈을 제어하기 위해 점으로 조직의 모서리를 굴려 두개골 우물에서 버퍼의 대부분을 제거합니다. 목화 팁 면봉으로 매우 가벼운 압력을가하면서 빠르게 출혈 영역 겔 발포체 완충액에 미리 침지를 적용한다. 참고 : 출혈은 일반적으로 뼈 또는 경질의 표면의 가장자리에서 온다; 두 경우 모두 정상이며, 더 중요한 혈관이 손상되지 않은 경우 출혈은 빨리 중지됩니다. 출혈이 계속되면 혈액 이미징 영역 위에 응고 시트를 형성 창 전체를 채울 수도있다. <ol><li> 조심스럽게 응고 시트를 제거하고 파열 된 혈관의 소스 주위 그대로 혈액 응고를 유지하면서 이미징 영역에서 응고 된 혈액의 조각을 선택합니다. 이 훨씬 더 많은 혈액 손실의 원인이 될 수 있습니다 블리드 소스에서 혈전을 제거하지 않도록주의하십시오. 모든 혈액을 씻어 뇌 완충액으로 뇌의 표면 관개. </li><li> 에 손이 닿지 않도록주의하십시오민감한 뇌 조직 또는 이물질을 뇌에 추가; 출혈이 멈출 때까지 약 2 ~ 5 분 동안 반복하십시오 ( 그림 2E ). 참고 :이 시점에서 craniotomy는 cranial 창을 준비 (5 단계 참조) 준비가되었습니다. 필요한 경우, 두개골 창을 이식하기 전에 경질을 제거하십시오 (4 단계 참조). </li></ol></li></ol> 4. 두라 제거 참고 : Dura 제거에는 극도의주의가 필요하며 15 분 이상 걸릴 수 있습니다. <ol><li> craniotomy에서 초과 버퍼를 멀리합니다. 촉촉한 표면을 유지하면서 집게로 작은 경질의 조각을 잡고 경질을 부드럽게 찢어냅니다. </li><li> 경도를 부드럽게 찢어 내고 자르기 위해 집게와 스프링 가위를 사용하십시오. </li><li> 뇌의 표면에 더 많은 뇌 완충액을 떨어 뜨려 두라를 부 풀려 두뇌와 분리되게하십시오. 모든 두라가 두개골 창 사이트에서 제거 될 때까지 계속하십시오. 정확하게 수행하면 두뇌가 뚜렷한 bl로 매우 깨끗하게 보입니다.짐 우드 선박없고 결점 (2 층 그림의 2E를 비교). 주의 : 경질의 일부 지역 (정수리 협회 지역의 중간 선 근위 근처 예) 뇌의 표면에 작은 동맥에 연결되어, 이러한 제거는 세동맥을 파열 할 수 있습니다. 이러한 경우, 세동맥의 정상에 그대로 두라의 작은 조각을 떠나 더 좋을 수 있습니다. 변속 드라이브는 작은 면적을 통과하지 않을 수도 있지만, 이는 대 출혈을 갖는 것이 바람직하다. </li><li> 빨리 맥동으로부터 이동을 최소화하고 상기 팽윤 방지 가능한 아가 뇌 표면을 수정 (공정 5 참조). </li></ol> 5. 두개골 윈도우 준비 <ol><li> 70 % 에탄올로 커버 유리를 스프레이 가볍게 건조 공기를 사용하는 용기. 유리가없는 점이나 먼지가 존재하는 완전히 깨끗한 확인합니다. </li><li> 뇌 완충액 15 ㎖에 녹이고 아가 분말 200 mg을 가열하여 1.3 % 아가로 오스를 준비한다. 전자 레인지, 설정모든 한천이 녹을 때까지 한 번에 10-15 초 동안 고온에서 열을 가하여 부드럽게 저어 준다. 참고 : 이미징을 방해 할 수 있으므로 거품이나 입자가 없어야합니다. </li><li> 뜨거운 아가로 오스에 온도계를 놓고 응고 온도 (~ 40 ° C) 바로 위까지 아가로 오스를 식힌다. 참고 : 아가로 오스 용기 바깥쪽으로 시원한 물을 흐르게하면 냉각 과정이 빨라질 수 있습니다. 거품이나 미립자가 없도록 부드럽게 계속 저어줍니다. </li><li> 한천을 적용하기 직전에 두개의 우물에서 뇌 완충제를 제거하십시오. 전달 피펫으로 아가로 오스를 작성하고 직접 아가로 오스를 두뇌에 떨어 뜨립니다. 커버 슬립을 표면 위에 빠르게 놓고 커버 슬립을 모서리에 아가로 오스 방울로 고정하십시오. </li></ol> 6. 안락사 참고 : 우리의 경험에 따르면,이 절차는 90 % 이상을 달성하기 위해 경험이 풍부한 외과 의사에게 최소 3 ~ 4 번의 수술을 필요로합니다.성공률. 경험이 적은 의사는 더 많은 연습이 필요할 수 있습니다. 개두술 또는 durotomy 동안, 뇌는 뇌에 뼈를 통해 드릴 펀치처럼 손상을 유지 할 수 있습니다. 개두술의 가장자리에 약간의 손상이 허용 될 수 있습니다. 뇌가 밝은 빨간색 손상되지 않은 혈관과 흰색 피질과 &quot;깨끗한&quot;보이지 않는 경우, 실험 종료해야 할 수도 있습니다. 불량한 제제의 예는 데드 혈관을 가진 것들을 포함하거나, 외피가 찢어 지거나 손상된 혈관 표시됩니다. 이러한 징후가있는 경우, 실험은 가능성 높은 품질의 데이터를 얻을 것입니다. 수술 / 실험의 성공 여부와 관계없이 인도적으로 실험이 완료 마우스를 안락사. <ol><li> 깊이 적어도 3.5 % 이소 플루 란 마취. 다음에, 300 ㎎ / ㎏에 펜토 바르 비탈 나트륨의 복강 내 주사를 준다. 바늘간에 삽입되는 경우 이상적 죽음은 매우 급속한 (&lt;1 분) 일 것이다. </li><li> 관류가 필요한 경우, 진행하기 전에 동물이 깊이 마취되었는지 확인하십시오 (1.3 단계 참조). </li><li> 또는 관류가 필요하지 않은 경우 최소 5 분 동안 기다린 다음 마우스가 죽었는지 확인하십시오. 호흡, 심장 박동, 통증 철수 및 각막 반사가 없는지 확인하십시오. 또한 말단의 엷은 청색 / 백색 채색 및 피질에 대한 혈관의 어둡기를 관찰하십시오. </li></ol>

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<li>Mohajerani, M. H., Aminoltejari, K., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+mini-strokes+produce+changes+in+interhemispheric+sensory+signal+processing+that+are+indicative+of+disinhibition+within+minutes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Targeted mini-strokes produce changes in interhemispheric sensory signal processing that are indicative of disinhibition within minutes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (22), E183-E191 (2011).</li>
<li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+for+intersectional+targeting+of+neural+sensors+and+effectors+with+high+specificity+and+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice for intersectional targeting of neural sensors and effectors with high specificity and performance.</a> Neuron. 85 (5), 942-958 (2015).</li>
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큰 두개 창 혁신적인 프로토콜은 대뇌 피질의 시간적 정수리 부분 위에 동시 촬상을 가능하게한다. 광학 영상과 결합하여, 그 자발적 자극 유도 활성 영역 중에 피질 내의 신경 동성을 나타 내기 위해 도움이 될 수 있습니다. 이 넓은 개두술 또한 혈류와 허혈성 모델 외측 용기 직접 조작의 생체 내 이미징 있도록 중간 대뇌 동맥 (MCA)의 기단부를 포함한 피질 혈관계 네트워크의 큰 신장을 노출시킨다. 이 기술은 전압 및 칼슘 표시기 단백질 (23)을 표현하는 쥐의 최근 개발 라인을 위해 잘 사용 될 것입니다. 이 마우스는 피질에 전압에 민감한 염료를 배양의 필요성을 우회의 실질적인 이점을 제공합니다. 이러한 외부 염료는 적절하게 뇌 조직에 침투 시간이 걸릴 (~ 60-90 분)과 온화한 독성에 의해 제한됩니다. 대형 craniotomies도 있습니다이전에 VSDI (11)와 함께 개발 쥐의 뇌를 연구하기 위해 사용되었다. 신생아 ...

개두술 뇌의 일부분을 나타 내기 위해 신경 과학자들에 의해 사용되는 표준 절차이다. 전기 생리학의 새벽 이후, 개두술는 신경 과학 분야에서 전례없는 혁신을 허용했다. 전극 대뇌 피질의 밀도 매핑은이지도를 기반으로 실험 테스트 가설과 이론을 주도하고있다. 우리는 최근 개두술이 노출 된 영역 (5, 6), (7) 내 피질 활성의 실시간 시각화를 가능 피질 혈류 1, 2, 3 및 신경 혈관 구조 (4)의 생체 내 촬영에 이용되는 새로운 시대를 입력. 많은 연구 구조 및 피질 뉴런, 아교 세포의 기능 및 고전 공부 생체 내 광 이미징 기술과 결합 craniotomies를 사용하지만tical 혈관 (8, 9), 상기 조사에 노출 피질의 작은 면적에 의해 제한 (그러나 10 참조)된다. 이 프로토콜의 목적은, 넓은 측면 개두술을 만드는는 squamosal 뼈 정중선에서 대뇌 피질을 노광 및 브레 그마 및 람다 넘어 연장하는 방법을 제공하는 것이다. 이 대형 개두술 동시 연관 피질의 시청 (retrosplenial,에 cingulate 및 두정엽), 주 및 보조 모터, 감각, 시각 및 청각 피질 수있다. 이 방법은 이전 피질 영역 자발적 자극 유도 활성 피질 5, 11, 12 중 서로 어떻게 상호 작용 하는지를 조사 여러 전압 감응 염료 영상 (VSDI)와 결합하고있다. 이 절차의 가장 어려운 부분은 머리의 위치를 ​​포함동물의 헤드 판을 고정하고, 마루 뼈로부터 시간적 근육 분리 동안 출혈을 방지. 치료는 비스듬한 각도로 두개골 커브로 드릴링과 두개골의 제거 과정에서주의해야한다.

<table><tbody><tr><td>히팅 패드</td><td>FHC</td><td>40-90-2</td><td></td></tr><tr><td>파인 가위</td><td>파인 사이</td>언스 도구 <td>14058-09</td><td></td></tr><tr><td>펜치&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td>2쌍 이상이 권장됩니다</td></tr>. <tr><td>봄 가위</td>. <td>Fine Science Tools</td><td>15000-00, 15000-10</td><td>1쌍은 dura 제거를 위해 지정되어야 합니다&nbsp;</td></tr><tr><td>제트 치아 쉐이드 파우더</td><td>LANG 치과</td><td>제트 치아 쉐이드 파우더</td><td>는 제트 리퀴드</td></tr><tr><td>제트 치아 쉐이드 액체</td><td></td><td></td><td></td></tr>와 혼합될 수 있습니다.<tr><td>드릴 헤드 - 카바이드 버스 FG 1/4 389</td><td>Midwest Dental</td><td>385201</td><td></td></tr><tr><td>Agarose Powder</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9793</td><td></td></tr><tr><td>Gelfoam</td><td>Sinclair Dental Canada</td><td>Pfizer Gelfoam</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Western Drug Distribution Centre Ltd</td><td>124125</td><td></td></tr><tr><td>Lidocaine 2% Epinephrine</td><td>Western Drug Distribution Centre Ltd</td><td>125299</td><td></td></tr><tr><td>덱사메타존 5&nbsp; mg/mL</td><td>Western Drug Distribution Centre Ltd</td><td>125231</td><td></td></tr><tr><td>부틸 시아노아크릴레이트 접착제(VetBond)</td><td>Western Drug Distribution Centre Ltd</td><td>12612</td><td></td></tr></tbody></table>

두뇌 활동의 중규모 넓은 필드 광학 이미징에 대한 큰 측면 개두술 절차

A Large Lateral Craniotomy Procedure for Mesoscale Wide-field Optical Imaging of Brain Activity

개두술은 생체 실험을 위해 뇌를 노출 일반적으로 수행 절차입니다. 마우스 연구에서 대부분의 실험실은 작은 개두술, 일반적으로 3mm X 3mm를 사용합니다. 이 프로토콜은 마우스 시간적 두정 피질 위에 대뇌 반구의 대부분을 노출시키는 대략 큰 7mm × 6 mm 두개 창을 생성하는 방법을 소개 (- 폭 4.5 mm - 0 6mm 예 2.5 정수리). 이 수술을 수행하려면, 머리는 약 30 ° 기울어해야하며, 시간적 근육의 대부분은 철회되어야한다. 때문에 뼈 제거의 많은 양이 절차는 수술과 실험을하는 동안 마취 동물 급성 실험을위한 것입니다. 혁신적인 많은 측면 창 두개의 주요 장점은 피질 모두 내측 및 외측 영역에 대한 동시 액세스를 제공하는 것이다. 이 대형 일방적 두개골 창은 세포 사이의 신경 역학을 연구하는 데 사용할 수 있습니다,다 전극 전기 생리 학적 녹음, 신경 활동 ( 예 : 내인성 또는 외인성 영상)의 영상화, 및 광 생성 자극을 조합하여 다른 피질 영역 사이에서도 가능합니다. 또한,이 큰 craniotomy은 대뇌 피질의 vasculature의 직접적인 조작을 허용 대뇌 피질 혈관의 큰 영역을 노출합니다.

<html> 한쪽 반구 내 대뇌 피질 부위 사이의 상호 작용을 연구하기 위해 우리는 시상 정맥동과 5 - 6 mm 측면을 가로 지르는 큰 두개 절개술을 사용했습니다. 이 두개골 창은 우뇌 반구의 일차 (모터, 체성 감각, 시각, 청각), 이차 (운동, 시각) 및 연관 (후퇴, 대뇌 피질, 정수리 연합) 피질을 포함했다 ( 그림 3A ). 이 연구에서 우리는 막 전위의 변화를 반영하는 전압 감응 형 염료 (VSD) 이미징을 사용했습니다 3 . 이 프로토콜은 다른 외인성 ( 예 : 칼슘 17 및 글루 탐 산염 18 이미징) 또는 내장 이미징 실험에도 유용합니다. 0.5 % isoflurane을 사용하여 가볍게 마취 된 마우스의 뒷다리, 앞다리, 수염, 시각 또는 청각 시스템을 자...

이 프로토콜은 마우스 대뇌 피질의 시간과 정수리 영역에 걸쳐 큰 일방적 개두술을 만들기위한 방법을 제시한다. 이것은 대뇌 피질 반구의 광대 한 지역에 걸쳐 실시간 영상에 특히 유용합니다.

The craniotomy is a commonly performed procedure to expose the brain for in vivo experiments. In mouse research, most labs utilize a small craniotomy, ...

이 광범위한 외측 두개골 절개술의 전반적인 목적은 대뇌 반구의 넓은 영역에 대해 실시간 영상을 촬영하는 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 피질의 넓은 영역을 노출시켜 관찰할 수 있으며, 광유전학과 같은 기술과 병행하여 사용할 수 있다는 점입니다. 이 기술은 서로 다른 시간적 및 공간적 해상도에서 세포 간의 신경 역동성뿐만 아니라 서로 다른 뇌 회로 간의 신경 역동성을 특성화하는 데 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.경막은 흔히 뇌 표면 및 혈관과 유착되어 있어 출혈 및 피질 손상의 위험이 높으므로, 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 이 방법은 새로운 경험이나 알츠하이머병, 뇌졸중과 같은 병리에 반응하여 평생에 걸쳐 일어나는 뇌 회로 발달 및 그 변화의 기저에 있는 신경생물학적 메커니즘을 연구하는 데 적용될 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면 모든 수술 도구를 오토클레이브로 멸균하고 수술 전 과정 동안 멸균 상태가 유지되도록 하십시오.수술에 충분한 양의 뇌 버퍼(brain buffer)가 있는지 확인하십시오. 다음으로, 마취된 마우스를 헤드 홀더 장치로 옮기고 37 °C로 설정된 온도 조절 가열 패드 위에 놓습니다. 마우스의 상악 치아를 치아 홀더에 고정하십시오.그런 다음 머리를 왼쪽으로 약 30도 회전시켜 머리의 우측 외측면이 드러나게 합니다. 이어서 귀 고정 바(ear bars)의 뭉툭한 끝부분으로 마우스의 머리를 고정합니다. 그 후 각막 건조를 방지하기 위해 안연고를 도포합니다.뇌부종을 줄이기 위해 dexamethasone 4 mg/kg을 근육 내로 주입합니다. 수술 부위의 피부를 4% chlorhexidine에 적신 면봉으로 3회 닦아낸 후, 70% alcohol로 3회 닦아냅니다. 개두술 부위에 lidocaine을 피하 주사합니다.해부 현미경 하에서, 핀셋을 사용하여 귀 바로 뒤쪽 정중선에서 왼쪽으로 1 mm 떨어진 지점의 피부를 들어 올린 후 수술용 가위로 작은 수평 절개를 가합니다. 오른쪽 귀 방향으로 5~6 mm 측면 절개를 한 다음, 머리의 주둥이 쪽(rostral end)으로 절개합니다. 처음 절개한 지점에 가위를 삽입하여 주둥이 방향으로 10 mm 절개합니다.그 후, 오른쪽 귀 주변과 오른쪽 눈 근처의 피부를 절개하여 두개골의 우측면과 측두근을 노출시킵니다. 노출된 부위의 가장 넓은 부분이 최소 7 mm가 되도록 하십시오. 수술 부위를 더 확장해야 하는 경우 피부를 추가로 다듬습니다.면봉을 사용하여 두개골 표면을 원형으로 문질러 골막을 제거합니다. 헤드 플레이트를 성공적으로 부착하려면 골막이 남아 있지 않아야 하며 두개골이 완전히 건조된 상태여야 하므로 이 과정이 매우 중요합니다. 다음으로, 스프링 가위와 핀셋을 사용하여 측두근을 두개골에서 분리합니다.근육을 외측으로 절개하고 젖혀서 인상골에 도달할 때까지 밀어냅니다. 이때 눈 근처의 인상골 높이를 따라 흐르는 표면측두정맥이 손상되지 않도록 각별히 주의하십시오. 그렇지 않으면 출혈이 발생할 수 있습니다. 뇌 버퍼에 미리 적신 젤 폼을 사용하여 지혈합니다.심한 출혈이 있는 경우, 열 소작기를 사용하십시오. 출혈 부위에 부틸 시아노아크릴레이트 접착제를 떨어뜨립니다. 이 절차를 시작하려면, 먼저 브레그마(bregma)를 표시하여 하부 뇌 영역의 방향을 잡고, 헤드 플레이트의 하단 가장자리에 에틸 시아노아크릴레이트 접착제를 도포한 뒤 두개골 절제 부위 위로 헤드 플레이트를 부착합니다.그 후, 두개골과 헤드 플레이트 사이의 빈 공간을 치과용 시멘트로 채우고, 두개골 절개 부위만 노출시키십시오. 그런 다음 치과용 시멘트가 건조되어 굳을 때까지 기다립니다. 이어서, 치과용 드릴로 두개골 표면을 가볍게 긁어 두개창 영역의 외곽선을 표시하십시오.드릴로 기존의 절개선을 따라 조심스럽게 따라가며 깊게 파내되, 드릴이 두개골을 관통하여 뇌 조직에 닿지 않도록 주의하십시오. 그동안 몇 분 간격으로 드릴 작업과 물에 적신 롤 티슈로 두개골 표면을 닦아내는 작업을 교대로 수행하십시오. 이 매우 까다로운 초기 단계에서 외과의는 하부 피질에 손상을 주지 않으면서 두개골을 제거할 수 있도록 노화된 두개골을 드릴로 뚫어 분리해야 합니다.천천히 움직이면 헐거워지고, 부드럽게 움직여야 빠릅니다. 드릴링 하는 동안, 포셉이나 움직이지 않는 드릴 비트로 두개골을 살짝 눌러 굴곡(buckling)이 발생하는지 주기적으로 확인하십시오. 뼈에 굴곡이 생기기 시작하면 드릴링을 중단하고 윈도우 전체를 뇌 버퍼에 담그십시오.뼈를 연화시키고 경막이 뼈에 달라붙어 두개골 제거 과정이 어려워지는 것을 방지하기 위해, 두개골을 제거하기 전 최소 5분 동안 기다립니다. 그 다음, 전면 가장자리부터 시작하여 두개골 제거 과정을 수행합니다. 핀셋을 사용하여 경막으로부터 분리된 두개골을 조심스럽게 들어 올립니다.뼈가 느슨해져 경막 위에 떠 있으면, 포셉으로 뼈를 단단히 잡고 경막에서 들어 올립니다. 이때 뼈가 뇌 속으로 침범하지 않도록 주의하십시오. 포셉과 스프링 가위(spring scissors)를 사용하여 경막을 조심스럽게 찢어 절제합니다.뇌 실질과 혈관이 손상되지 않도록 주의해야 합니다. 두개창 부위에서 모든 경막이 제거될 때까지 작업을 계속합니다. 올바르게 수행되었다면, 뇌는 뚜렷한 혈관이 보이고 결점이 없는 매우 깨끗한 상태로 나타납니다.커버글라스에 70% ethanol을 분사한 후, 에어 캔을 사용하여 부드럽게 건조시킵니다. 유리가 얼룩이나 먼지 없이 완전히 깨끗한지 확인하십시오. 다음으로, 15 milliliters의 brain buffer에 200 milligrams의 agarose 분말을 녹여 가열함으로써 1.3% agarose를 준비합니다.가열된 아가로스에 온도계를 넣고 아가로스가 응고되기 직전 온도인 약 40 °C까지 식힙니다. 튜브 겉면에 찬물을 흘려보내 냉각 속도를 높일 수 있으며, 이때 아가로스 내부로 물이 들어가지 않도록 주의하십시오. 온도를 확인하면서 온도계로 부드럽게 저어줍니다.한천(agar)을 도포하기 직전에 두개골 웰(cranial well)에서 뇌 완충액(brain buffer)을 제거하십시오. 기포나 입자가 있으면 이미징에 방해가 되므로 없음을 확인하십시오. 이제 트랜스퍼 파이프 헤드(transfer pipe head)로 아가로스(agarose)를 빨아들여 뇌 위에 직접 떨어뜨리십시오.그런 다음 빠르게 커버슬립을 표면 위에 덮고, 모서리에 아가로스 방울을 떨어뜨려 커버슬립을 고정합니다. 여기에 표시된 것은 광범위한 단측 두개골 절제술의 광미세구조 사진이며, 각 이미지에서 브레그마(bregma)는 흰색 원으로 표시되어 있습니다. 피질 활성화 패턴은 0.5% isoflurane으로 마취된 마우스에서 반대측 수염 자극, 청각 자극, 반대측 앞다리 자극, 반대측 뒷다리 자극 및 발광 다이오드를 이용한 반대측 안구의 시각 자극 후의 모습입니다.모든 형태의 감각 자극에 대해 일차 감각 피질 활성화 후 10~25ms 사이에 정중선 활성화가 나타났습니다. 이 기술을 숙달하면 3~4시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때는 출혈을 최소화하고 피질이 손상되지 않도록 주의하는 것이 중요합니다.본 절차를 통해 광학 이미징과 같은 다른 이미징 기술을 활용하면 정상 뇌와 질환 뇌에서 자발적 활동이 신경 역동성에 어떤 영향을 미치는지와 같은 중요한 질문에 대한 답을 얻는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 개발 이후, 시스템 신경과학 분야의 연구자들은 생쥐의 서로 멀리 떨어진 피질 영역 간의 상호작용과 신경 역동성을 탐구할 수 있는 길을 열게 되었습니다. 본 영상에서는 출혈과 피질 손상을 최소화하면서 생쥐의 광범위한 측면 두개골 절제술을 수행하는 방법을 보여주며, 이를 통해 귀하의 가장 시급한 과학적 질문에 답하는 데 필요한 데이터를 수집할 수 있도록 안내합니다.

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이 비디오 및 프로토콜은 설치류에 유리 커버 두개골 창을 이식하는 방법을 보여줍니다. 이러한 준비는 생체내 개월 시간 단위 동안 네크로 텍스의 2 광자 이미징에서 만성 사용할 수 있습니다. 그것은 광학 내장 신호 이미징을 포함한 이미징의 다른 유형에도 사용할 수 있습니다.

만성 뇌 영상에 대한 Craniotomy 외과 절차

방법은 네크로의 미리 결정된 기능 마이크로 도메인에 형광 염료와 뉴런을 라벨에 설명되어 있습니다. 첫째, 고유 신호 광학 이미징은 기능지도를 얻을하는 데 사용됩니다. 그런 다음 두 광자 현미경은지도의 마이크로 도메인 내에서 라벨 및 이미지 뉴런하는 데 사용됩니다.

특정 기능 내장 신호를 결합하여 네크로의 마이크로 도메인과 투 광자 영상에서 뉴런의 대상 라벨링

우리는을위한 마우스 모델에서 얇게 - 두개골 대뇌 피질의 창 (TSCW)를 생성하는 방법을...

에 얇게 - 두개골 두피 창 기술<em&gt; 생체 내</em&gt; 광 결맞음 단층 촬영 영상

여기에서 우리는 동일한 살아있는 동물 내의 침습적 외과 적 개입 (예를 들어, 생검) 전후 뇌 종양 세포의 고해상도 시간 경과 다광자 이미징을위한 방법을 설명합니다. 이 방법은 종양 세포의 철새, 침략적 인 행동에 대한 이러한 침습적 인 외과 적 절차의 영향을 단일 세포 수준에서 연구 할 수 있습니다.

침략적인 외과 생검에 응하여 뇌종양 세포 행동의 경도 내 활력 화상 진찰

우리는 두개골 기본 종양에 대한 내시경 적 박상 수술에 환자 작업 업에서 확산 MRI 학법을 통합하는 프로토콜을 제시한다. 수술 전 및 수술 내 단계에서 이러한 신경 이미징 연구를 채택하는 방법이 설명되어 있습니다.

내시경 성 상반신 두개골 기본 수술에서 확산 MRI 기관도법의 역할

이 문서는 주입 캐뉼라와 마우스의 해마의 CA1 영역에 이식으로 보충 된 맞춤형 이미징 창의 준비를 보여줍니다.

마우스를 면도하는 해마에서 신경 활동을 시각화하기위한 두개골 절제술 절차

본 프로토콜은 식품 랩, 투명 실리콘 및 커버 유리를 사용하여 큰(6 x 3 mm2) 두개골 창을 만드는 방법을 설명합니다. 이 두개골 창은 동일한 마우스에서 생체 내 광시야 및 2광자 칼슘 이미징 실험을 허용합니다.

생체 내 큰 두개골 창을 사용한 마우스의 광시야 및 2광자 칼슘 이미징

헤드 플레이트 및 단일 광자 및 이광자 현미경과 호환되는 광학 설계와 통합될 경우, 마이크로프리즘 렌즈는 머리가 고정된 상태에서의 잘 제어된 실험이나 자유롭게 움직이는 동물의 자연스러운 행동 작업을 포함하여 다양한 조건에서 수직 컬럼의 신경 반응을 측정하는 데 상당한 이점을 제공합니다.

자유롭게 움직이고 머리가 고정된 동물에서 마이크로프리즘을 사용하여 식별된 신경 집단의 장기 이미징

여기에서는 쥐와 생쥐의 고밀도 마이크로 전기 피질 검사(μEcoG) 기록을 위한 수술, 이식 및 기록 방법을 포함한 두 가지 프로토콜을 제시합니다. μECoG 기록은 쥐의 청각 피질에서 층류 다원(laminar polytrode) 기록 또는 쥐의 체성 감각 피질(somatosensory cortex)에서 신경 활동의 광유전학적 조작과 함께 수행됩니다.

설치류의 미세 전기 피질 조영술과 층류 폴리트로드 및 광유전학을 통합하여 피질 처리의 멀티스케일 조사

우리는 광학 다층 간섭 단층촬영(OMLIT)이라는 새로운 영상 기술을 도입했는데, 이는 뇌 표본의 모든 세포를 중간 규모에서 편향 없이 촬영할 수 있게 하며, 동일한 샘플에 대한 테이프 기반 직렬 주사 전자현미경의 영상 워크플로우에 원활하게 통합할 수 있게 합니다.

중간경적 전세포 뇌 지도화를 위한 주사 전자현미경 호환 광학 영상 방법

이 프로토콜은 쥐에서 크고 재밀봉 가능한 경막 보존 두개골 창을 만들기 위한 2단계 수술 방법을 설명합니다. 이 기술은 기본 모드 네트워크와 같은 분산된 심부 뇌 네트워크에서 몇 주에 걸쳐 만성적이고 다중 모달 전기생리학적 기록을 가능하게 합니다.

마우스 기본 모드 네트워크의 종단적이고 다중 모드 전기생리학 기록을 가능하게 하는 대형 재밀봉 가능한 두개골 창을 위한 수술 프로토콜

배우세요 생쥐 대뇌피질의 측두엽과 두정엽에 걸친 대규모 일측 개두술 방법을 통한 중규모 넓은 필드 광학 이미징 기술입니다. 이 기술은 신경 역학 연구에 활용됩니다.

두뇌 활동의 중규모 넓은 필드 광학 이미징에 대한 큰 측면 개두술 절차

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