두뇌 활동의 중규모 넓은 필드 광학 이미징에 대한 큰 측면 개두술 절차

이 광범위한 외측 두개골 절개술의 전반적인 목적은 대뇌 반구의 넓은 영역에 대해 실시간 영상을 촬영하는 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 피질의 넓은 영역을 노출시켜 관찰할 수 있으며, 광유전학과 같은 기술과 병행하여 사용할 수 있다는 점입니다. 이 기술은 서로 다른 시간적 및 공간적 해상도에서 세포 간의 신경 역동성뿐만 아니라 서로 다른 뇌 회로 간의 신경 역동성을 특성화하는 데 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

경막은 흔히 뇌 표면 및 혈관과 유착되어 있어 출혈 및 피질 손상의 위험이 높으므로, 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 이 방법은 새로운 경험이나 알츠하이머병, 뇌졸중과 같은 병리에 반응하여 평생에 걸쳐 일어나는 뇌 회로 발달 및 그 변화의 기저에 있는 신경생물학적 메커니즘을 연구하는 데 적용될 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면 모든 수술 도구를 오토클레이브로 멸균하고 수술 전 과정 동안 멸균 상태가 유지되도록 하십시오.

수술에 충분한 양의 뇌 버퍼(brain buffer)가 있는지 확인하십시오. 다음으로, 마취된 마우스를 헤드 홀더 장치로 옮기고 37 °C로 설정된 온도 조절 가열 패드 위에 놓습니다. 마우스의 상악 치아를 치아 홀더에 고정하십시오.

그런 다음 머리를 왼쪽으로 약 30도 회전시켜 머리의 우측 외측면이 드러나게 합니다. 이어서 귀 고정 바(ear bars)의 뭉툭한 끝부분으로 마우스의 머리를 고정합니다. 그 후 각막 건조를 방지하기 위해 안연고를 도포합니다.

뇌부종을 줄이기 위해 dexamethasone 4 mg/kg을 근육 내로 주입합니다. 수술 부위의 피부를 4% chlorhexidine에 적신 면봉으로 3회 닦아낸 후, 70% alcohol로 3회 닦아냅니다. 개두술 부위에 lidocaine을 피하 주사합니다.

해부 현미경 하에서, 핀셋을 사용하여 귀 바로 뒤쪽 정중선에서 왼쪽으로 1 mm 떨어진 지점의 피부를 들어 올린 후 수술용 가위로 작은 수평 절개를 가합니다. 오른쪽 귀 방향으로 5~6 mm 측면 절개를 한 다음, 머리의 주둥이 쪽(rostral end)으로 절개합니다. 처음 절개한 지점에 가위를 삽입하여 주둥이 방향으로 10 mm 절개합니다.

그 후, 오른쪽 귀 주변과 오른쪽 눈 근처의 피부를 절개하여 두개골의 우측면과 측두근을 노출시킵니다. 노출된 부위의 가장 넓은 부분이 최소 7 mm가 되도록 하십시오. 수술 부위를 더 확장해야 하는 경우 피부를 추가로 다듬습니다.

면봉을 사용하여 두개골 표면을 원형으로 문질러 골막을 제거합니다. 헤드 플레이트를 성공적으로 부착하려면 골막이 남아 있지 않아야 하며 두개골이 완전히 건조된 상태여야 하므로 이 과정이 매우 중요합니다. 다음으로, 스프링 가위와 핀셋을 사용하여 측두근을 두개골에서 분리합니다.

근육을 외측으로 절개하고 젖혀서 인상골에 도달할 때까지 밀어냅니다. 이때 눈 근처의 인상골 높이를 따라 흐르는 표면측두정맥이 손상되지 않도록 각별히 주의하십시오. 그렇지 않으면 출혈이 발생할 수 있습니다. 뇌 버퍼에 미리 적신 젤 폼을 사용하여 지혈합니다.

심한 출혈이 있는 경우, 열 소작기를 사용하십시오. 출혈 부위에 부틸 시아노아크릴레이트 접착제를 떨어뜨립니다. 이 절차를 시작하려면, 먼저 브레그마(bregma)를 표시하여 하부 뇌 영역의 방향을 잡고, 헤드 플레이트의 하단 가장자리에 에틸 시아노아크릴레이트 접착제를 도포한 뒤 두개골 절제 부위 위로 헤드 플레이트를 부착합니다.

그 후, 두개골과 헤드 플레이트 사이의 빈 공간을 치과용 시멘트로 채우고, 두개골 절개 부위만 노출시키십시오. 그런 다음 치과용 시멘트가 건조되어 굳을 때까지 기다립니다. 이어서, 치과용 드릴로 두개골 표면을 가볍게 긁어 두개창 영역의 외곽선을 표시하십시오.

드릴로 기존의 절개선을 따라 조심스럽게 따라가며 깊게 파내되, 드릴이 두개골을 관통하여 뇌 조직에 닿지 않도록 주의하십시오. 그동안 몇 분 간격으로 드릴 작업과 물에 적신 롤 티슈로 두개골 표면을 닦아내는 작업을 교대로 수행하십시오. 이 매우 까다로운 초기 단계에서 외과의는 하부 피질에 손상을 주지 않으면서 두개골을 제거할 수 있도록 노화된 두개골을 드릴로 뚫어 분리해야 합니다.

천천히 움직이면 헐거워지고, 부드럽게 움직여야 빠릅니다. 드릴링 하는 동안, 포셉이나 움직이지 않는 드릴 비트로 두개골을 살짝 눌러 굴곡(buckling)이 발생하는지 주기적으로 확인하십시오. 뼈에 굴곡이 생기기 시작하면 드릴링을 중단하고 윈도우 전체를 뇌 버퍼에 담그십시오.

뼈를 연화시키고 경막이 뼈에 달라붙어 두개골 제거 과정이 어려워지는 것을 방지하기 위해, 두개골을 제거하기 전 최소 5분 동안 기다립니다. 그 다음, 전면 가장자리부터 시작하여 두개골 제거 과정을 수행합니다. 핀셋을 사용하여 경막으로부터 분리된 두개골을 조심스럽게 들어 올립니다.

뼈가 느슨해져 경막 위에 떠 있으면, 포셉으로 뼈를 단단히 잡고 경막에서 들어 올립니다. 이때 뼈가 뇌 속으로 침범하지 않도록 주의하십시오. 포셉과 스프링 가위(spring scissors)를 사용하여 경막을 조심스럽게 찢어 절제합니다.

뇌 실질과 혈관이 손상되지 않도록 주의해야 합니다. 두개창 부위에서 모든 경막이 제거될 때까지 작업을 계속합니다. 올바르게 수행되었다면, 뇌는 뚜렷한 혈관이 보이고 결점이 없는 매우 깨끗한 상태로 나타납니다.

커버글라스에 70% ethanol을 분사한 후, 에어 캔을 사용하여 부드럽게 건조시킵니다. 유리가 얼룩이나 먼지 없이 완전히 깨끗한지 확인하십시오. 다음으로, 15 milliliters의 brain buffer에 200 milligrams의 agarose 분말을 녹여 가열함으로써 1.3% agarose를 준비합니다.

가열된 아가로스에 온도계를 넣고 아가로스가 응고되기 직전 온도인 약 40 °C까지 식힙니다. 튜브 겉면에 찬물을 흘려보내 냉각 속도를 높일 수 있으며, 이때 아가로스 내부로 물이 들어가지 않도록 주의하십시오. 온도를 확인하면서 온도계로 부드럽게 저어줍니다.

한천(agar)을 도포하기 직전에 두개골 웰(cranial well)에서 뇌 완충액(brain buffer)을 제거하십시오. 기포나 입자가 있으면 이미징에 방해가 되므로 없음을 확인하십시오. 이제 트랜스퍼 파이프 헤드(transfer pipe head)로 아가로스(agarose)를 빨아들여 뇌 위에 직접 떨어뜨리십시오.

그런 다음 빠르게 커버슬립을 표면 위에 덮고, 모서리에 아가로스 방울을 떨어뜨려 커버슬립을 고정합니다. 여기에 표시된 것은 광범위한 단측 두개골 절제술의 광미세구조 사진이며, 각 이미지에서 브레그마(bregma)는 흰색 원으로 표시되어 있습니다. 피질 활성화 패턴은 0.5% isoflurane으로 마취된 마우스에서 반대측 수염 자극, 청각 자극, 반대측 앞다리 자극, 반대측 뒷다리 자극 및 발광 다이오드를 이용한 반대측 안구의 시각 자극 후의 모습입니다.

모든 형태의 감각 자극에 대해 일차 감각 피질 활성화 후 10~25ms 사이에 정중선 활성화가 나타났습니다. 이 기술을 숙달하면 3~4시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때는 출혈을 최소화하고 피질이 손상되지 않도록 주의하는 것이 중요합니다.

본 절차를 통해 광학 이미징과 같은 다른 이미징 기술을 활용하면 정상 뇌와 질환 뇌에서 자발적 활동이 신경 역동성에 어떤 영향을 미치는지와 같은 중요한 질문에 대한 답을 얻는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 개발 이후, 시스템 신경과학 분야의 연구자들은 생쥐의 서로 멀리 떨어진 피질 영역 간의 상호작용과 신경 역동성을 탐구할 수 있는 길을 열게 되었습니다. 본 영상에서는 출혈과 피질 손상을 최소화하면서 생쥐의 광범위한 측면 두개골 절제술을 수행하는 방법을 보여주며, 이를 통해 귀하의 가장 시급한 과학적 질문에 답하는 데 필요한 데이터를 수집할 수 있도록 안내합니다.