Name: 엔테로 바이러스 및 문화와 RT-qPCR에 의해 물에서 노로 바이러스의 발생의 EPA 방법 1615 측정. 파트 III. RT-qPCR에 의한 바이러스 검출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 32 s
Description: 학습하세요 RT-qPCR을 이용한 수중 엔테로바이러스 및 노로바이러스 정량 분석 방법입니다. 원심초여과를 통한 바이러스 농축과 역전사 정량 PCR 기법으로 지하수에서 폴리오바이러스 20%, 무는 노로바이러스 30%의 회수율을 달성할 수 있습니다.

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저자는 표준 곡선 시약 개발에 사용된 클론을 준비한 Eric Rhodes 박사, 시료 처리에 도움을 준 Brian McMinn, 통계 분석을 제공한 Larry Wymer, 이 연구에 사용된 사빈 소아마비 바이러스 혈청형 3형을 공급한 위스콘신주 마쉬필드에 소재한 미국 농무부의 Mark Borchardt 박사, 워싱턴 대학의 H. W. Virgin 박사에게 감사를 표합니다. 세인트루이스, 미주리, 쥐 노로바이러스. 저자는 또한 재고 실험실 시약 준비에 도움을 준 Gretchen Sullivan, 쥐 노로바이러스 재고를 전파한 Mohammad Karim 박사, 물 샘플을 수집할 수 있도록 허용한 지역 개인 우물 소유자 및 유틸리티에 감사를 표합니다. 이 작업은 EPA의 검토를 거쳐 출판 승인을 받았지만 반드시 EPA의 공식 정책을 반영하는 것은 아닙니다. 상표명 또는 상용 제품에 대한 언급은 사용에 대한 보증 또는 권장 사항으로 간주되지 않습니다.

주 : 사용 데이터 시트가 프로토콜의 모든 단계를 추적하는 단계; 예를 들어, 데이터 시트는 보충 자료 테이블 S2-S4에 제시되어있다. 1. 표준 곡선 준비 <ol><li> (예를 들어, 장갑 RNA EPA-1615) 2.5 × 108 입자 / ㎖ (2.5 × 10 8 GC / ㎖) TSM의 사용 농도로 제조자에 의해 공급되는 농도로 희석하여 표준 곡선 시약 작업 스톡을 제조 III 버퍼입니다. -20 ℃에서 1.5 ml의의 microcentrifuge 튜브 및 저장소를 사용하여 250 μL 분취 액으로 작업 주식을 나눈다. 참고 : 다른 표준 곡선 시약으로 사용하기위한 준비 작업 바이러스의 주식과 플라스미드에 대한 지침은 보충 자료 프로토콜 단계 (S1)를 참조하십시오. </li><li> 작업 스톡 분취 량 중 하나 이상을 해동. 2.5 × 10 (7)의 농도를 제공, 2.5 × 10 (6), 2.5 × 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브를 이용하여 5 ~ 10 배 연속 희석을 준비105, 2.5 × 104, 2.5 × 103 GC / ㎖. <ol><li> TSM III 버퍼 225 μL에 2.5 × 10 8 GC / ㎖ 작업 주식의 25 μl를 추가하여 최초의 희석을 준비합니다. 볼텍스 혼합기를 사용하여 5 ~ 15 초 동안 혼합한다. </li><li> TSM III 완충액 225 μL 단계 1.2.1에서 제조 한 희석액 25 μl를 첨가하여 희석 다음을 준비한다. 다시 혼합하고, 다음 세 10 배 희석액을 조제 유사한 과정을 계속한다. </li></ol></li><li> 표준 곡선 작업 재고에서 RNA와 바로 제 3의 절차를 사용하여 다섯 희석의 압축을 풉니 다. </li></ol> 2. 고등 농도 <ol><li> 상부 샘플 챔버로 1X PBS 중 적어도 10 ㎖, 0.2 % 소 혈청 알부민 (BSA)을 첨가하여 각각의 샘플 채취 용 원심 농축기 (30,000 분자량 컷)을 준비한다. 이 솔루션은 얇은 채널 농도 챔버를 채운 확인하고 4 ℃에서 O / N을 누릅니다. <ol><li&gt; 유체를 폐기하십시오. 과량의 BSA를 제거하고 물을 폐기 멸균 시약 등급 이상의 물 10 mL로 농축 한 번 씻어. </li></ol></li><li> S, 원심 분리 농축기로 상기 분석 샘플 량과 동일한 각 시험 샘플로부터 이차 물 농축액의 양을 추가한다. <ol><li> 식 (1) 사용 (S)를 계산, <img alt="식 (1)" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq1.jpg" /> D는있는 분석 원래 물 샘플의 볼륨 인 경우, TSV는 전체 샘플 볼륨과 FCSV는 최종 농축 샘플 볼륨입니다. S.의 계산의 예를 들면 기업 재료 S2보기 </li></ol></li><li> 원심 분리기 (20)에 대한 스윙 버킷 회에서 4 ° C에서 3,000~6,000 XG에 각각의 테스트 샘플 - 30 분. 얇은 채널 농도 챔버에서 볼륨을 확인합니다. <ol><li> 볼륨이 20 분 이상 다시보다 400 μL, 원심 분리기 인 경우. 일의 샘플까지 원심 계속전자 얇은 채널 농도 실 미만 400 μL로 감소되었다. 상층 액을 제거하지 마십시오. </li></ol></li><li> 바이러스의 회수를 증가시키기 위해 멸균 0.15 M 인산 나트륨 1 ㎖, pH를 7-7.5로 원심 농축기의 측면을 세척한다. 원심 분리기는 다시 3,000~6,000 XG, 4 ° C에서 샘플 미만 400 μL로 감소 될 때까지. 이 세척 단계를 하나의 추가 시간을 반복합니다. </li><li> , 100-200 μL의 마이크로 피펫을 사용하여 조심스럽게 측정하여 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브 (즉, 마이크로 원심 튜브에 200 μL를 전송하고 나머지 유체가 완전히 인출 될 때까지 다음, 마이크로 피펫을 조정함으로써, 농축 잔액을 측정하기 위해 각각의 농축 시료를 전송할 ) 피펫 팁으로. 400 ± 2 μL에 최종 볼륨을 조정, 0.15 M 인산 나트륨, pH를 7-7.5을 추가합니다. </li><li> 즉시 3. processe 수없는 농축 샘플을 잡고 단계로 진행하여 핵산을 추출d를 즉시 이하 24 시간 동안 4 ° C에서. </li></ol> 3. 핵산 분리 <ol><li> 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브를 라벨 분리하는 단계 1.3 단계 2.5 표준 곡선 희석에서 각각의 시료에서 단계에 차 농축액 3.3 200 μl를 기술 된 바와 같이 제조 된 추출 버퍼 200 μl를 추가합니다. 또는 -70 ℃ 이하 차 농축 나머지 동결. 다음을 제외 혈액 샘플 스핀 프로토콜 핵산 추출 키트 제조자의 지시에 따라 각 시료로부터 핵산을 추출한다. </li><li> 물 샘플에 단백질 분해 효소를 추가하거나 핵산 추출 키트와 함께 제공되는 추출 버퍼를 사용하지 마십시오. </li><li> 캐리어 RNA로 추출 버퍼를 준비 <ol><li> 캐리어 RNA의 310 μg의 들어있는 유리 병에 캐리어 RNA 희석 버퍼의 310 μl를 추가합니다. 용해 후 50 μl를 포함하는 6 분취 량으로 나누어 섞는다. -20에서 보관기음. </li><li> 0.027 μg의 / μL의 캐리어 RNA 농도를 얻기 위해 추출 완충액 1 ㎖ 당 해동 캐리어 RNA의 28 μL를 추가한다. 추출 키트와 함께 제공하는 대신에, 캐리어 - 개정 RNA 추출 완충액을 사용한다. </li></ol></li><li> 리보 뉴 클레아 제를 첨가하여 용출 완충제 마스터 용액을 조제 (의 RNase) 억제제 추출 키트와 함께 공급 된 용출 버퍼 400 단위 / ml의 최종 농도. <ol><li> 컬럼으로의 RNase 억제제 용출 완충액 50 μl를 배치하여 스핀 컬럼 바인딩에서 용출 된 핵산 RNA. 1 분 동안 기다린 후 실온에서 1 분 동안 6,000 XG에 원심 분리기. </li><li> 단계를 반복 3.4.1 다음 제거하고 열을 버린다. </li></ol></li><li> 단계 3.4.2에서 RNA 추출물의 분취 량을 준비합니다. (6) 표준 곡선 작업 주식의 분취 적어도 15 μL를 각각 포함하는 각 표준 곡선의 희석을 준비합니다. 적어도 포함하는 모든 다른 RNA 샘플 4 분취 준비22 μL 각. 이들은 4 시간 이내에 역전사에 의해 처리 될 수있는 경우에 4 ° C에서 각각의 시료와 표준 곡선 분취 컨트롤 중 하나를 저장; 그렇지 않으면, 또는 -70 ℃ 이하 모든 분취를 저장합니다. </li></ol> 4. 역전사 (RT) <ol><li> 열 번 같음 (마이크로 리터 단위) 존재 올리고 뉴클레오티드 nanomoles (nmol의) 개수를 양을 사용하여 각 바이알 PCR 등급 물의 부피를 첨가하여 표 1에 나열된 각 올리고 뉴클레오티드 프라이머 및 프로브의 100 μM 스톡 용액을 제조 유리 병 라벨에 또는 예를 들어 제조업체의 사양서 (에서와 같이 바이알 (,) 363 μL에서 36.3 nmol의 포함하는 프라이머를 재현 탁. 용해 섞는다. <ol><li> 솔루션을 작업 10 μm의를 준비하는 PCR 등급 물 100 μm의 해결책 1:10 희석. </li></ol></li><li> 2. 피펫을 표 가이드를 사용하여 클린 룸에서 RT Maste의 16.5 μl를 RT 마스터 믹스 1과 2를 준비각 PCR 플레이트 R 믹스 1은 잘 멀티 채널 피펫을 사용하여. </li><li> 해동, 냉동 경우, 각 필드의 샘플 및 실험실 강화 샘플 매트릭스에서 핵산 추출물 (LFSM, 즉, 시드 물 매트릭스 샘플). <ol><li> RNA 분해 효소 억제제의 400 단위 / ㎖를 함유하는 용출 완충액으로 5 1시 25분 : 각 필드 LFSM 샘플 1 희석. </li><li> 실험실 시약 블랭크 (LRB; 즉, 시약 등급의 물을 사용하여 음의 품질 관리), 성능 평가 (PE, 해동, 냉동되었지만 랩 요새 빈 (즉, 시딩 된 시약 등급의 물을 사용하여 긍정적 인 품질 관리 LFB)를 희석하지 ; 즉, 시드 시약 등급의 물 샘플은 연구 시작에 앞서 실험 성능), 성능 시험 (PT를 평가하는 데, 즉, 연구 기간 동안 실험실 성능을 평가하는 데 사용되는 분석이 알려지지 역가 시드 시약 등급의 물 샘플 ), NA 배치 부정적인 추출 제어, 또는 표준 곡선 세트에서 추출 된 RNA. </li></ol&gt; </li><li> 별도의 PCR 판 우물에 모든 테스트 샘플, 제어 및 표준 곡선에서 RNA의 6.7 μl를 놓고 테스트 샘플과 컨트롤에 대한 세중의 우물을 사용하여 표준 곡선 (RT 플레이트, 예를 들어 그림 S1 참조) 우물을 복제. <ol><li> 아니 템플릿 컨트롤 (NTC)에 대해 별도의 PCR 판 우물에 용출 버퍼의 6.7 μl를 놓습니다. 첫 번째 샘플에 대한이 모든 네 번째 추가 샘플에 대한 다음 두 가지 이상을 사용하여 RT 접시 당 2-8 NTC를 포함합니다. </li><li> 판 전체에 부정적인 추출 및 NTC 컨트롤을 배포합니다. </li></ol></li><li> 내열 접시 실러와 PCR 플레이트를 밀봉합니다. 5 ~ 10 초 동안 샘플을 혼합 한 후 ≥ 500 XG 간단히 원심 분리기. </li><li> 99 ° C에서 4 분의 판을 품어 후 열 자전거 타는 4 ℃로 급속 냉각. 원심 분리기 다시 ≥ 500 XG 간단히에서. </li><li> 조심스럽게 플레이트 씰을 제거하고 각 웰에 RT 마스터 믹스 2의 16.8 μl를 추가합니다. 괜찮다알 혼합하여 내열성 플레이트 실러 다시 판 및 ≥ 500 X g에서 간단한 원심 분리. </li><li> 4 ° C 유지주기에 의해 다음 열 자전거 타는 사람에 접시를 놓고 99 ° C에서 42 ° C에서 60 분 다음 25 ℃에서 15 분, 5 분을 실행합니다. </li><li> 프로세스를 즉시 또는 qPCR에 (5 단계), 또는 저장 샘플 8 시간 내에서 이하는 -70 ° C 그들은 처리 할 수​​있을 때까지. 4 ° C에서 8 시간 내에 처리 할 수​​있는 저장 샘플. </li></ol> 5. 실시간 정량 PCR (qPCR에) <ol><li> 이전의 모든 테스트 샘플을 실행하기 간염 G 시약의 각 로트의 평균 간염 G 된 CQ 값을 결정합니다. <ol><li> NTC 제어한다 (단계 4.1.1)에서 기술 한 바와 같이 제조하여 10 회 반복을 RT 분석을 실행. (5.5.3 5.2 단계) 아래에 설명 된대로 간염 G qPCR에 분석을 실행합니다. 10 복제의 평균 된 CQ 값을 계산합니다. </li><li> RT 마스터 믹스 1 간염 G 시약의 양 (표 2를 조정), 필요한 경우, 32 대 (25)와 사이의 평균 된 CQ 값을 얻었다. 물의 양을 변화시킴으로써 승강 량을 보상하여 분석 당 16.5 μL에서 RT 마스터 믹스 한 최종 용적을 유지했다. </li><li> 조정 된 수량을 반영하기 위해 5.1.2 및 변경 테이블 2 단계 5.1.1를 반복하여 모든 조정을 확인합니다. </li></ol></li><li> 장내 표 3에서 가이드를 사용하여 클린 룸에서 qPCR에 마스터 믹스를 준비, 간염 표 4 쥐 노로 바이러스 (노로 바이러스의 유전자형의 V)에 대한 노로 바이러스의 유전자형 II, 표 7에 대한 노로 바이러스 유전자형 I, ​​표 6 표 5, 표 8 G. 믹스는 각 마스터 믹스 한 다음 ≥ 500 XG 간단히 원심 분리기. </li><li> 각 qPCR에 분석을 위해 잘 분리 판 당 14 μl를 사용하여 표시 광 반응 판의 해당 우물에 PCR 마스터 믹스를 추가 (그림 S2 </stronG&gt; 그림 (S1)에서 RT 레이아웃에 따라 qPCR에 분석)에 대한 가능한 레이아웃. </li><li> 냉동 경우, 실온에서 단계 4.8에서 RT 판을 녹여. 접시 믹서를 사용하여 혼합 한 후 ≥ 500 XG 간단히 원심 분리기. </li><li> 광 반응 판의 적당한 웰에 해당하는 cDNA 6 μL 분주. ≥ 500 XG 잠깐의 광 반응 플레이트와 원심 분리기에서 샘플을 섞는다. <ol><li> 다른 모든 qPCR에 분석을 실행하기 전에 원액 희석 필드와 LFSM 샘플에 간염 G qPCR에 분석을 실행합니다. 필드 또는이다 LFSM 샘플 &lt;장내 바이러스와 노로 바이러스 qPCR에 분석의 의미 간염 G 된 CQ 값보다 큰 1 된 CQ 값의 가장 낮은 희석을 사용합니다. </li><li> 제조업체의 지시에 따라 정량적 PCR 열 순환기 소프트웨어를 설정한다. 표준으로 표준 곡선 샘플을 확인하고 각각의 표준 곡선의 희석, 표 9의 게놈 복사 값을 입력합니다. </li><l난&gt; 95 ℃, 60 ℃에서 1 분 15 초로 45 사이클,이어서 95 ° C에서 10 분 동안 정량적 PCR 열 순환기 판을 실행. </li></ol></li><li> 각각의 표준 곡선은 표 10에 주어진 허용 값을 충족하는지 여부를 결정합니다. 예제 보충 자료 섹션 (S3)를 참조하십시오. <ol><li> 수학 식 2를 사용하여 표준 곡선에 대한 전체 표준 편차 (STDDEV)을 계산, <img alt="식 (2)" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq2.jpg" /> Cq와 각 표준 곡선 복제에 대해보고 된 값이고, Cq와는 복제의 각 세트에 대한 평균 값이 #Cq는 총 양의 값 (즉, 미결정 생략) 모두 표준 제어 복제 용 된 CQ 값의 개수, 및 #입니다 성병은 양의 값을 가지고 표준 컨트롤 수있다. </li><li> 정량적 PCR 열 순환기 소프트웨어는 각각의 표준 곡선에 대한 기울기를 산출하지 않는 경우, 수학 식 3을 이용하여 기울기 계산(60); <img alt="식 (3)" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq3.jpg" /> Cq와 사용 된 최고 및 최저 희석 평균값이며 로그 여기서 GC는 표 9에서 사용 된 최고 및 최저 희석을위한 게놈 사본의 로그 값이다. </li><li> 식 4를 사용하여 R 2 값을 계산합니다. <img alt="식 (4)" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq4.jpg" /> Cq와 모든 된 CQ 값의 평균이며 로그 GC 각 복제에 대한 평균 GC 로그 값이다. </li><li> 식 (5)를 사용하여 %의 효율을 계산한다 : <img alt="식 (5)" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq5.jpg" /></li></ol></li><li> 표 10에 명시된 기준 및 각 샘플에 대한 평균 값을 GC 충족 표준 곡선에 기초하여 모든 테스트 샘플에 대한 열 순환기 소프트웨어 GC에 의해 산출 된 값을 기록한다. 의 기준에 맞지 않는 표준 곡선과 어떤 샘플을 다시 실행 <strong&gt; 표 10 또는 부정적인 컨트롤 (LRB, NA 배치 부정적인 추출 제어, 또는 NTC)는 긍정적이다. 다시 실행 중 기준을 충족하지 못하는 거짓 양성 대조군을 가지고있는 샘플을 다시 처리합니다. </li><li> 수학 식 (6) 이용하여 각 시료에 대한 GC 리터당 (GC에 L)을 결정 : <img alt="식 (6)" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq6.jpg" /> GC는 단계 570에서 평균 게놈 카피 수이고, 요소 &#39;199&#39;급 농도 중에 발생하는 부피 감소를위한 총 희석 인자, RNA를 추출하고 RT-qPCR의 단계, DF는 억제 보상 희석 인자 , D는 리터에있는 분석 원래 물 샘플의 볼륨입니다. GC (L)의 계산의 예에 대한 보충 자료 부 S4 참조. </li><li> 단계 (199)에 의해 5.5에서 GC 평균 값을 0.3로 승산 나누어 총 LFB의 GC 및 LRB 샘플을 계산한다. </li></ol>

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소스 마시는 물의 바이러스 오염의 대규모 국가 연구는 여러 분석 실험실의 사용을 필요로한다. 이러한 조건 하에서 표준 방법은 여러 실험실에서 생성 된 데이터가 비교 될 수 있도록 요구된다. 바이러스 검출을위한 많은 출판 분자 방법,하지만 거의 표준화 된 분자 방법이 있습니다. EPA 방법 1615 구체적으로 RT-qPCR에 의한 물 행렬에 장내 바이러스와 노로 바이러스의 검출을 위해 설계된 표준화 된 방법이다. 표준화 된 분자 방법은 식품에서 바이러스 탐지에 사용할 수있는, 16, 17 (15216-2 CEN / ISO TS 15216-1 및 CEN / ISO TS 2013년 4월 7일) 및 간염의 검출 바이러스와 노로 바이러스 봄에 적용된 물 (16). 모든 표준 방법은 품질 성능 제어 및 기준 상호 최소화하고 내 실험실 변화 인해 실험실 오염 거짓 긍정적 인 데이터를 포함해야합니다. 또한, 전자를 거짓 데이터를 줄이기 위해PA 방법 1,615 처리 한 방법 워크 플로우 동안 작업의 분리를 규정 분자 방법에 대한 EPA의 지침, (18)을 따른다. 그것은 형 간염 G에게 1,19 내부 통제 인한 RT-qPCR에 (15)의 억제제 거짓 부정적인 결과를 최소화하기위한 절차를 포함한다. 이는 모든 필드 데이터의 필드 리터 또​​는 마시는 물 샘플 당 게놈 사본에서 발현되도록 ​​분석 모두 샘플링 물과의 표준화 된 볼륨과 함께 정량 분석​​법을 사용한다. 효율적인 단일 튜브 (원스텝) RT-PCR 분석은 시판되고 있지만, 본 방법은 의도적으로 분리 된 분석법을 사용한다. 이는 각 반응에서 분석 될 수있는 샘플들의 양을 최소화하는 단점이 있지만, 다중 프라이머 세트의 사용에 더 많은 유연성을 제공한다. 프라이머 및 프로브를 사용하고 가능성이 더 프라이머 세트는 그룹 내의 모든 바이러스 변종을 감지하지 않습니다으로 RT-qPCR의 분석에 의해 만 좋은 제한됩니다. 장내 프라이머 세트가 있기 때문에 선택되었다이는 (20, 21)이 장내 바이러스 혈청 형의 다양한 검출 보존 5&#39;- 비 코딩 영역을 표적으로하고, 그것에 의해 검출 된 바이러스는 미처리 한 지하수의 소비에서 건강에 미치는 영향과 관련된다. 두 프라이머 세트는 내가 22, 23을 noroviruses 유전자형의 검출에 사용된다. 첫 번째는 어린 아이들의 건강에 미치는 영향 사이의 강한 상관 관계로 인해 선택 및 바이러스 1 검출되었다. 그들은 균주 (24, 25)의 폭 넓은 다양성을 감지하기 때문에 설정 프라이머 두 번째 유전자형과 유전자형 II noroviruses에 사용되는 프라이머 세트가 선택되었다. 물에서 바이러스 성 RNA를 검출 qPCR에와 RT-qPCR에 절차의 주요 장점에도 불구하고, 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 제, 소독제 불 활성화를 포함하여 모두 감염성 및 비 감염성 바이러스 입자는, 이러한 절차에 의해 증폭 될 수있다. Borchardt의 결과는 이것이 미처리 지하수 f를위한 문제의 적은 것을 제안지역 사회에서 유사한 롬 대수층은 소독 지표수 1보다 공부했다. 배양 바이러스 예방 프로그램으로이 문제는 문화 (26, 27)와 함께 PCR을 이용하여 극복 될 수있다. 문제는 또한 핵산 가교제 28 내지 30의 이용을 통해 몇몇 바이러스 해결되었다. 이 후자의 방법은 바이러스 차아 염소산에 의해 불 활성화 및 자외선에 의해 불 활성화에게는 효과적이지 더 효과적입니다. 이들 분자 절차 번째 제한은 통상적으로 분석 할 수있다 농축 샘플의 부피는 배양 과정 6,31 위해 사용 된 것보다 훨씬 더 작다는 것이다. 이 문제는 종종 어느 샘플이 작은 부피에 재현 탁하고, 또는 삼차 시료 농도 단계 6,32,33을 첨가 할 수 있도록 유기 응집에 의한 표준 이차 농도에 대한 폴리에틸렌 글리콜 기반의 절차를 치환하여 취급 . 방법 1615 centrif를 사용ugal 한외 여과는 차의 농도를 제공합니다. 원심 한외 여과 물 및 시료의 모든 바이러스의 양 농도 및 분자 분석의 작은 분자량 억제제의 감소의 결과로 이하의 성분을 제거 30,000 달톤. 물에 존재했던 어떤 바이러스&gt; 10 (5)의 전체 집중 계수에이 차 농축 단계의 결과는 테스트되고. 세 번째 제한은 환경 시료에서 분자 절차의 억제제의 존재이다. 억제제를 제거하기 위해 다양한 방법이 개발되었지만, 어떠한 방식은 필수적 억제의 레벨을 추정하기위한 내부 제어의 활용, 모든 물 행렬 및 바이러스 유형 6,34,35 효과적 없다. 이 방법에 사용 간염 G는 모든 시약 및 반응 억제를 추정하기위한 RT-qPCR의 분석에서 바이러스 RNA의 일정한 레벨을 제공함으로써 이러한 요구를 만족시킨다. 때 T의 최고그 시료를 농축 한 바이러스 농도가 억제제 농도 14,15 이상만큼 희석 될 수 있고, 제거 접근법 억제가 제거되지 억제제. 본원에 기술 된 표준 곡선 절차 주요 장점과 한계를 모두 갖는다. 장점은 시약이 단일 제어가 모든 분석에 사용될 수 있도록, 하나의 시약의 공급 모든 필요한 부품을 사용한다는 것이다. 이 시약은 특히 노로 바이러스 시험 법에 대한 장점이다. 노로 바이러스 입자는 단지 매우 어려운 기준으로 사용하기 위해 바이러스 입자를 얻을 수있다 감염된 개체로부터 얻어 질 수있다. 더 중요한 장점은 RNA 표준 RNA (36)의 정확한 정량을 위해 필수적이다 갖는 것으로는, 하나의 시약의 모든 표적 RNA 바이러스에 대한 RNA 표준을 제공한다는 것이다. 그러나, 바이러스를 정확하게 계량하는 능력은 매트릭스 효과가 고려되지 않는다는 사실에 의해 제한된다. 이것은 그 게놈 사본을 의미합니다숫자 값은 절대 간주 될 수없고 단지 상대적인 관점에서 고려되어야한다. 그것은 표준 곡선 작업입니다 씩 충분한 수의가 (1.2 단계) 완료 연구를 충당하기 위해 준비하는 것이 좋습니다. 예를 들어, 각각의 250 μL 분취 6 RT 플레이트 충분한 시약을 제공한다. 이 연구는 500 샘플의 분석을 필요로하는 것이 공지되어있는 경우, 12 분취 량의 최소값 (500 샘플 RT 플레이트 당 / 7의 샘플 / RT 분취 량 당 6 판)을 필요로 할 것이다. EPA 방법 1615은 성능 기반 방법입니다. 많은 제조업 자들은 여기에 명시 동등한 시약을 이들 시약만큼 성능 기준을 충족으로 치환 될 수있다. 또한 긍정적 인 RT-qPCR의 제어 역할을 표준 곡선은 성능 문제를 해결 가치이다. 성능으로 인해 RNA의 분해, 시약의 유효 기간, 냉동고의 고장, 장비 교정 및 기술 오류로 거부 할 수 있습니다. 성능 문제가 의심해야그들은 표준 곡선에 대한 성능 규격을 만족하지 않는 경우는 ED 표준 곡선은도 4에 도시 된 것과 다를 경우 나. RT-qPCR의 분석은 매우 강력합니다; 완전한 실패로 인해 RNA 또는 기술적 오류 (예를 들어, 누락 된 시약)의 부적절한 취급에 가능성이있다. 세심 추출 및 리보 뉴 클레아로부터 RNA의 분해를 감소시키는 단계 사이 RT RNA 샘플을 처리에주의해야한다. 지상 및 시약 등급의 물과 지하수에서 쥐 노로 바이러스의 회복에서 소아마비 바이러스의 회복은 EPA 방법 1,615 성능 허용 기준 (표 11)를 만나 다른 33,37,38에 의해보고 된 것과 유사하다. LFB 샘플에서 쥐 노로 바이러스 회복은 소아마비 바이러스보다 훨씬 낮았다과 소아마비 바이러스 별 허용 기준을 충족하지 않을 것입니다. 시약 등급의 물에서 낮은 쥐 노로 바이러스 복구하는 이유는 알려져 있지 않다. 여기에 결과와 유사하게, 카림과 collea에는 동급 수돗물 39에서 4 %의 노로 바이러스의 GI.1에 대한 복구를보고했다. 리 등. 37 뮤린 노로 18 %의 인간의 GII.4 노로 각각 디스크 필터를 사용하여 증류수에 대한 평균 26 % 회수율을보고했다. 리와 동료에게 유사한 조건을 사용하여, 김과 코는 각각 38,이 바이러스를 46 %와 43 %의 회수율을 관찰했다. 기븐스 외. (40)는 해수로부터 인간 노로 바이러스의 GII.4 100 % 회수 주위 수득하지만 김과 코 (38)의 농도와 유사한 또는 쥐 바이러스 상당히 감소 회수율 해수 이상과 증류수로 염의 첨가를 초래한다는 발견 GII.4 복구 약 두 배 감소.

정량 PCR (qPCR에,이 논문에서 사용하는 용어의 정의에 대한 보충 자료 참조) 전사-qPCR에 (RT-qPCR에) 물을 검출하는 환경에서 인간의 장내 바이러스를 정량화 및 음주에 대한 가치있는 도구이며, 특히 이렇게 많은 바이러스에 대한 역 복제 또는 세포 배양 시스템에서 복제하지 저조한. 두 도구는 많은 바이러스 종류는 세계 1-6에 걸쳐 환경 마시는 물에 존재하는 것을 증명하고있다. 그들이 마시는 물에서 발견 된 바이러스가 발병 환자 7-10에 의한 창고 동일 것으로 나타났습니다로 질병 발생을 조사하는 동안 증폭 된 유전자 단편의 염기 서열과 결합 된 이들의 사용은 수 인성 바이러스 전송에 대한 증거를 제공하고 있습니다. qPCR에와 RT-qPCR에 모두 유용 공중 보건의 도구입니다. 예를 들어, 미국 환경 보호국 (EPA)에 의해 수행 연구의 데이터는 강한 관계가 될 수 있었다qPCR에 레크리에이션 바다에서 건강에 미치는 영향에 의해 트윈 지표 측정. 그 결과, EPA의 최종 2,012 레크리에이션 수질 기준 오락 해변 (11, 12)를 모니터링하기위한 qPCR의 방법을 포함한다. RT-qPCR에 1로 측정 Borchardt와 동료들은 또한 지하수에서 처리되지 않은 지하수 및 바이러스를 사용하여 지역 사회에서 급성 위장염 사이에 강한 관계를 발견했다. 이 논문의 목적은 EPA 방법 1615 13, 14의 분자 분석 구성 요소를 설명하는 것입니다. 이 분석은 전기 양성 필터를 통해 장내 바이러스와 전달 된 환경이나 식수의 원래 볼륨에 따라 리터당 노로 바이러스 게놈 사본 (GC)의 정량적 추정치를 제공하기 위해 RT-qPCR에 사용합니다. 분자 절차의 개요는 표준 곡선을 준비 1. 프로토콜 부분을 그림 1 세부 절차를 나타낸다. 이 기준은 RN이 포함 된 시약에서 준비모든 프라이머 / 프로브 세트의 표적 서열의 카피. 제 2 차 농도 절차를 설명합니다. 섹션 3은 농축 및 제어 샘플로부터 RNA를 추출하기위한 절차를 제공한다. 각각의 시료에서 RNA를 역 세중 분석 및 주요 전사 (4 절)에 임의의 프라이머를 사용하여 전사한다. (도 2 제 5 항) 각 역전사 반응에서 cDNA를 qPCR에 의해 중으로 분석 다섯 별도의 바이러스 별 분석으로 분할된다. 분석은 여러 엔테로 바이러스 및 noroviruses 및 RT-qPCR에 15 저해되어 시료를 식별 간염 G RNA를 함유하는 시약을 검출하도록 설계 과학 문헌 (표 1)에서의 프라이머 및 프로브를 사용한다.

<table><tbody><tr><td>1.5 ml 튜브 챔버</td><td>다양 화 생명 공학</td><td>CHAM-3000</td><td></td></tr><tr><td>1 &deg; C 쿨 브릭</td><td>다양화된 생명공학</td><td>BRIK-2501</td><td></td></tr><tr><td>10x PCR 버퍼 II 및 25-mM MgCl2</td><td>Life Technologies</td><td>N8080130-20</td><td></td></tr> <tr><td>&deg; C 냉동고</td><td>VWR</td><td>97043-346</td><td>수동 제상 냉동고</td></tr><tr><td>-70 &deg; C 또는 더 차가운 냉동고</td><td>Thermo Scientific</td><td>MBF700LSAO-E</td><td></td></tr><tr><td>96웰 챔버</td><td>Diversified Biotech</td><td>CHAM-1000</td><td></td></tr><tr><td>앱솔루트 에탄올</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-100</td><td></td></tr><tr><td>Armored RNA EPA-1615</td><td>Asuragen</td><td>RT-qPCR 분석 정량화에 사용되는</td><td>맞춤형 주문</td></tr><tr><td>Armored RNA G형 간염 바이러스</td><td>Asuragen</td><td>42024</td><td></td></tr><tr><td>오토 클레이브</td><td>Steris</td><td>Amsco Lab Series</td><td></td></tr><tr><td>Biosafety cabinet</td><td>NuAir 실험실 장비 공급</td><td>Labgard 437 ES</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td> <td>Affymetrix</td><td>10856</td><td>결정 등급 이상</td></tr><tr><td>버퍼 AVE</td><td>Qiagen</td><td>1026956</td><td>캐리어 RNA 희석 버퍼</td></tr><tr><td>AVL</td><td>Qiagen</td><td>19073</td><td>추출 완충</td></tr>액 <tr><td>캐리어 RNA</td><td>Qiagen</td><td>해당 없음</td><td>완충액 AVL 원심분리기 병과 함께 제공되는 캐리어 RNA 사용</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>05-562-23 또는 05-562-26</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 로터</td><td>Beckman Coulter</td><td>339080, 336380</td><td></td></tr><tr><td>Cool safe box</td><td>Diversified Biotech</td><td>CSF-BOX</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Promega</td><td>P1171</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler&reg; 480 프로브 마스터 키트</td><td>Roche Diagnostics</td><td>4707494001</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-682-550</td><td>스냅 캡이 있는 리보뉴클레아제 및 데옥시리보뉴클레아제가 없는 튜브 사용</td></tr><tr><td>Microcide III</td><td>Fitzgerald</td><td>99R-103</td><td></td></tr><tr><td>Microseal 'A' 필름</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>HSA5001</td><td>Heat 저항성</td></tr><tr><td>Microseal 'F' 필름</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>MSA1001</td><td>냉동고 저항성</td></tr><tr><td>미니 플레이트 스피너</td><td>Labnet International</td><td>MPS1000</td><td></td></tr><tr><td>멀티채널 피펫</td><td>Rainin</td><td>L8-20</td><td></td></tr><tr><td>멀티-튜브 챔버</td><td>Diversified Biotech</td><td>CHAM-5000</td><td></td></tr><tr><td>광학 반응 플레이트</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td>4314320</tr><tr><td>PCR 뉴클레오티드 믹스</td><td>Promega</td><td>U1515</td><td></td></tr><tr><td>PCR 플레이트</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>HSS9601</td><td></td></tr><tr><td>PCR 등급 물</td><td>Roche</td><td>3315932001</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>U.S. Biological</td><td>D9820</td><td></td></tr><tr><td>플레이트 믹서</td><td>과학 산업</td><td>MicroPlate Genie</td><td></td></tr><tr><td>Prionex 젤라틴</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G0411</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA 혈액 미니 키트</td><td>Qiagen</td><td>51104</td><td>버퍼 AW1(첫 번째 세척 버퍼), AW2(두 번째 세척 버퍼), AE(용출 버퍼)가 포함되어 있습니다.사용하기 전에 버퍼 AW1 및 AW2에 에탄올을 추가해야 합니다. 키트와 함께 제공된 Buffer AL을 사용하지 마십시오:</td></tr><tr><td>Quantitative PCR thermal cycler</td>, <td>Life Technologies</td><td>4351405</td><td></td></tr><tr><td>Random primer</td>, <td>Promega</td><td>C1181</td><td></td></tr>, <tr><td>Reagent Reservoir</td>, <td>Fisher Scientific</td><td>21-381-27E</td><td></td></tr>, <tr><td>냉장 원심분리기</td><td>, Beckman Coulter</td><td>367501</td><td></td></tr><tr><td>RNase Inhibitor</td><td>Promega</td><td>N2515 또는 N2615</td><td></td></tr><tr><td>ROX 참조 염료</td><td>Life Technologies</td><td>12223</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript II 또는 III 역전사 효소</td><td>Life Technologies</td><td>18064-022 또는 18080044</td><td></td></tr><tr><td>수술용 장갑</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-058-800</td><td></td></tr><tr><td>Thermal cycler</td><td>Life Technologies</td><td>4314879</td><td></td></tr><tr><td>Trisma base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 20 원심 농축기 장치</td><td>Sartorius-Stedim</td><td>VS2022</td><td></td></tr></tbody></table>

엔테로 바이러스 및 문화와 rt-qpcr에 의해 물에서 노로 바이러스의 발생의 epa 방법 1615 측정. 파트 iii. rt-qpcr에 의한 바이러스 검출

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

EPA Method 1615는 환경 및 음용수에 존재하는 엔테로바이러스와 노로바이러스를 측정합니다. 이 방법은 규제되지 않은 오염 물질 모니터링 규칙의 모니터링 기간 3 동안 여러 분석 실험실에서 사용할 수 있는 표준화된 방법을 갖추는 것을 목표로 개발되었습니다. 본 연구에서는 물 시료 농축액에서 바이러스 리보핵산(RNA)을 추출하고 역전사 정량 PCR(RT-qPCR)을 사용하여 엔테로바이러스 및 노로바이러스 농도를 정량적으로 측정하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 분자 분석을 위한 바이러스 농도는 표준 곡선을 기반으로 리터당 바이러스 RNA의 게놈 사본으로 계산됩니다. 이 방법은 여러 가지 품질 관리를 사용하여 데이터 품질을 높이고 실험실 간 및 실험실 내 변동을 줄입니다. 이 방법은 인간 노로바이러스의 대리물로 소아마비 바이러스 3형과 쥐 노로바이러스가 파종된 지하 및 시약 등급의 물에서 바이러스 회수를 조사하여 평가되었습니다. 소아마비 바이러스의 평균 회수율은 지하수에서 20%, 시약수에서 44%였다. RT-qPCR 분석을 통한 평균 쥐 노로바이러스 회수율은 지하수에서 30%, 시약 등급의 물에서 4%였습니다.

여기에서는 역전사-정량적 PCR을 사용하여 환경 및 음용수에서 엔테로바이러스와 노로바이러스를 정량화하는 절차를 제시합니다. EPA Method 1615의 표준화된 절차를 통해 지하수에서 바이러스가 회수되는 평균 비율은 소아마비 바이러스의 경우 20%, 쥐 노로바이러스의 경우 30%였다.

엔테로 바이러스 및 문화와 RT-qPCR에 의해 물에서 노로 바이러스의 발생의 EPA 방법 1615 측정. 파트 III. RT-qPCR에 의한 바이러스 검출

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

이 실험 절차의 전체적인 목적은 역전사 정량 중합효소 연쇄반응(RT-qPCR)을 이용하여 물속의 엔테로바이러스와 노로바이러스 농도를 측정하는 것입니다. 이는 원심분리 초미세여과를 통해 수중 시료로부터 바이러스 입자를 3차 농축함으로써 수행됩니다. 그 다음, 프로토콜에 기술된 대로 표준 곡선 시약들을 준비합니다. 이어서 바이러스 농축액과 표준 곡선 시료의 핵산을 추출합니다. 그런 다음, RNA를 1:5 및 1:25로 희석하여 랜덤 프라이머와 역전사 효소를 사용하여 바이러스 RNA를 역전사합니다. 마지막으로, 바이러스 특이적 프라이머와 프로브를 사용하여 실시간 열 순환기(real-time thermal cycler)에서 바이러스 cDNA를 증폭시킨 후, 표준 곡선을 기반으로 시료의 게놈 복제 수를 계산합니다.ISO 15216과 같은 다른 표준 방법과 비교했을 때 EPA method 1615의 주요 장점은 수질 시료를 위해 특별히 설계되었으며 엔테로바이러스(enterovirus) 분석법이 포함되어 있다는 점입니다. 이 방법은 환경 미생물학 분야의 위험 평가자에게 식수 및 레크리에이션 용수의 바이러스로 인한 위험을 결정하는 현재 상태에 대한 정보를 제공할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 사람들은 방법론에 내재된 표준화 과정에서 어려움을 겪을 수 있습니다. 이 방법은 매우 세부적이며 명시적으로 준수해야 합니다. 방법의 미세한 차이만으로도 부정적인 결과가 초래될 수 있으므로, 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 오늘 이 절차를 시연할 사람은 Nichole Brinkman, Jennifer Cashdollar, Shannon Griffin, 그리고 저 Shay Fout입니다. 저희는 모두 오하이오주 신시내티에 위치한 EPA 국립 노출 연구소(national exposure research laboratory)의 전문 직원들입니다.텍스트 프로토콜에 따라 표준 곡선을 작성한 후, 상단 샘플 챔버에 1X PBS 및 2% BSA를 최소 10 milliliters 추가하여 수집된 각 샘플을 위한 원심 농축기를 준비합니다. 하룻밤 동안 배양하고 세척한 다음, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 샘플을 추가한 후, 각 테스트 샘플을 스윙 버킷 로터(swinging bucket rotor)에서 3000 to 6000 times g, 4 °C 조건으로 20분에서 30분 동안 원심 분리합니다.시료를 적절히 농축하여 새로운 미세원심분리 튜브로 옮긴 후, 0.15 molar 인산나트륨 완충액을 첨가하여 최종 부피를 400 µL ± 2 µL로 맞춥니다. 핵산을 추출하기 위해, 음성 추출 대조군용으로는 추출 완충액 200 µL를, 각 테스트 시료 또는 표준 곡선 희석액용으로는 3차 농축액 200 µL를 각각 별도의 미세원심분리 튜브에 넣고, 추출 키트 제조사의 설명서에 기재된 텍스트 프로토콜의 수정 사항에 따라 RNA를 추출합니다. 프로토콜에 명시된 대로 프라이머와 프로브를 준비한 후, 여기에서 보여주는 것과 같이 클린룸에서 역전사 마스터 믹스 1과 2를 준비합니다.멀티채널 피펫을 사용하여 16.5 µL의 RT master mix 1을 각 PCR 플레이트의 웰에 분주합니다. 다음으로, 400 units/mL의 RNase inhibitor가 포함된 핵산 추출 키트의 용출 버퍼(elution buffer)를 사용하여, 해동된 야외 및 실험실 강화 시료 매트릭스 또는 LSFM 시료 1~5 및 1~25를 희석합니다. 모든 테스트 시료, 대조군 및 표준 곡선의 핵산 6.7 µL를 각각의 PCR 플레이트 웰로 옮기며, 테스트 시료와 대조군은 3반복(triplicate)으로, 표준 곡선은 2반복(duplicate)으로 분주합니다.용출 버퍼 6.7 µL를 템플릿 무첨가 대조군(no template control) 또는 NTC 웰에 추가합니다. RT 플레이트당 2~8개의 NTC를 포함시키며, 첫 번째 샘플에 2개를 사용하고 이후 매 4번째 추가 샘플마다 2개 이상을 사용하여 음성 대조군을 플레이트 전체에 분산 배치합니다. 내열 플레이트 실러를 사용하여 PCR 플레이트를 밀봉하고, 각 웰이 단단히 밀폐되었는지 확인합니다. 그런 다음 샘플을 5~10초 동안 혼합한 후 500 ×g 이상에서 짧게 원심 분리합니다.써모사이클러에서 플레이트를 99 °C로 4분 동안 배양합니다. 플레이트를 4 °C로 낮춘 후 짧게 다시 원심 분리합니다. 그런 다음, 플레이트 씰을 조심스럽게 제거하고 각 웰에 16.8 µL의 RT master mix two를 첨가합니다. 플레이트를 밀봉하고 짧게 섞은 후 원심 분리한 다음, 플레이트를 써모사이클러에 넣고 25 °C에서 15분, 이어서 42 °C에서 60분, 99 °C에서 5분 동안 가동하며, 마지막으로 4 °C에서 최대 8시간 동안 유지하거나 장기 보관이 필요한 경우 -70 °C에 샘플을 보관합니다.클린룸에서 엔테로바이러스, 노로바이러스 유전자군 1, 노로바이러스 유전자군 2 및 G형 간염 가이드를 사용하여 정량 PCR 마스터 믹스를 준비합니다. 각 마스터 믹스를 혼합하고 짧게 원심 분리합니다. 그다음, 이 예시에서와 같이 각 qPCR 분석당 별도의 플레이트를 사용하여 라벨이 부착된 광학 반응 플레이트의 해당 웰에 PCR 마스터 믹스 14 µL를 첨가합니다. 해당 웰에 적절한 cDNA 6 µL를 분주합니다. 이후 샘플을 혼합하고 짧게 원심 분리합니다.프로토콜에 설명된 대로 써모사이클러 소프트웨어를 설정하고, 다른 모든 qPCR 분석을 수행하기 전에 희석되지 않은 및 희석된 현장 및 실험실 강화 시료 매트릭스 또는 LFSM 시료에 대해 B형 간염 G qPCR 분석을 실행하십시오. 각 시료의 평균 Cq 값을 새로운 B형 간염 G 시약 로트별로 미리 결정된 평균 B형 간염 G Cq 값과 비교하십시오. 엔테로바이러스 및 노로바이러스 qPCR 분석의 경우, 평균 B형 간염 G Cq 값보다 Cq 값이 1 미만으로 높은 현장 또는 LDF 시료의 가장 낮은 희석 배수를 사용하십시오.제조업체의 지침에 따라 정량적 PCR 써모사이클러 소프트웨어를 설정하십시오. 표준 곡선 샘플을 표준물질로 지정하고, 각 표준 곡선 희석 단계에 대해 여기에 표시된 게놈 복제수 값을 입력하십시오. 플레이트를 95 °C에서 10분 동안 가열한 후, 90 °C에서 15초, 60 °C에서 1분 과정을 45회 반복하여 운용하십시오.각 표준 곡선이 이 표에 제시된 허용 값들을 충족하는지 확인하십시오. 텍스트 프로토콜의 방정식에 따라 표준 편차, 기울기, R 제곱 및 효율 백분율을 계산한 후, 이 표에 명시된 기준을 충족하는 표준 곡선을 바탕으로 써모사이클러 소프트웨어에서 계산된 모든 테스트 샘플의 게놈 복제수 또는 GC 값과 각 샘플의 평균 GC 값을 기록하십시오. 앞서 계산한 평균 게놈 복제수가 GC인 다음 방정식을 사용하여 각 테스트 샘플의 리터당 GC를 결정하십시오.계수 199는 3차 농축, RNA 추출 및 RT-qPCR 단계 동안 발생한 부피 반응의 총 희석 배수입니다. DF는 억제 작용을 보정하는 희석 배수이며, D는 리터 단위로 측정된 원래 시료수의 부피입니다.마지막으로, 앞서 결정한 평균 GC 값에 199를 곱하고 0.3으로 나누어 실험실 현장 강화 공백(LFB) 또는 실험실 시약 공백(LRB) 시료의 총 GC를 계산합니다. 전반적으로, 3곳의 공공 처리장과 1곳의 개인 우물에서 회수된 총 7개 시료 세트의 쌍을 이룬 현장 LSFM 지하수 시료를 사용하여 바이러스 회수율을 결정하였습니다. LSFM 시료의 시딩 수준은 7형 폴리오바이러스 3,000,000 MPN 및 마우스 노로바이러스 5,000,000 PFU였습니다.표준 곡선 시약이 당시 제공되지 않았기 때문에, EPA 방법 1615의 최초 단일 실험실 평가에는 마우스 노로바이러스가 사용되었습니다. 지하수 시료의 경우, 폴리오바이러스의 평균 회수율은 표준 오차 2%와 함께 20%였으며, 마우스 노로바이러스의 평균 회수율은 표준 오차 3%와 함께 30%였습니다. 각 LFSM의 일반 현장 지하수 시료에서는 엔테로바이러스 또는 노로바이러스가 검출되지 않았습니다. 실험실 강화 공시료(LFB) 및 실험실 시약 공시료(LRB) 시료는 바이러스가 접종된 시약 등급수와 접종되지 않은 시약 등급수를 사용하여 측정되었습니다.폴리오바이러스(Poliovirus) 회수율은 평균 44%(표준 오차 1%)였으며, 마우스 노로바이러스(murine norovirus) 회수율은 평균 4%(표준 오차 0.5%)였습니다. 이 그림은 엔테로바이러스(enterovirus)와 노로바이러스 제노그룹 2(norovirus genogroup two)의 전형적인 표준 곡선을 보여줍니다. 노로바이러스 제노그룹 2 곡선은 R 제곱 값 0.9987, 전체 표준 편차 0.14, 효율 101%로 표준 곡선 기준을 충족합니다. 엔테로바이러스 곡선은 R 제곱 값 0.9874, 전체 표준 편차 0.58, 효율 103%로 표준 곡선 성능 기준을 충족하지만, 노로바이러스 곡선보다 민감도가 약 100배 낮아 검출 한계가 더 높습니다.이 영상을 시청한 후에는 RT-qPCR을 사용하여 수인성 엔테로바이러스와 노로바이러스를 농축하고 검출하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 기술을 숙달하면 탁도가 낮은 시료의 경우 약 8시간 만에 완료할 수 있습니다. 탁도가 더 높은 시료는 특히 3차 농축 단계에서 추가 시간이 소요될 수 있습니다.이 절차를 수행하는 동안, 역전사 전 단계에서 샘플이 RNase에 오염되지 않도록 보호하는 것이 중요합니다. PCR은 매우 강력하고 유용한 기술임을 유념하십시오. 위양성 및 위음성 결과를 최소화하기 위해 작업 공간의 분리 및 적절한 대조군의 사용과 같은 예방 조치가 필요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Environment

환경

primers와 열린 독서 프레임 1 (ORF1) ORF2 접합 영역입니다 노로 바이러스의 게놈 중 가장 보존 지역에 대한 구체적인 TaqMan 프로브를 이용하여 아이들의 stools에서 탐지 및 노로 바이러스의 분리의 genogroup 식별을위한 원 - 스텝 RT-PCR 분석 설명했다. 비상업적인 비용 효율적인 RNA 추출 방법을 자세히 설명하고 있습니다.

Taqman함으로써 어린이 Stools에서 Noroviruses의 감지 및 Genogrouping 한 단계 RT-PCR

Source: Fout, G. S., Cashdollar, J. L. EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the use of a total culturable virus assay to quantify infectious viruses in water samples. It outlines host cell inoculation, observation of cytopathic effect, and statistical quantification of infectious virus concentration.

Quantifying Infectious Viruses in Water Samples Using an In Vitro Total Culturable Virus Assay

EPA Method 1615는 전기 양성 필터를 사용하여 엔테로바이러스와 노로바이러스를 환경 및 음용수에 농축합니다. 이 원고는 Method 1615 분석을 위한 샘플 수집 절차를 설명합니다.

엔테로 바이러스 및 문화 RT-qPCR에 의해 물에서 노로 바이러스의 발생의 EPA 방법 1615 측정. 바이러스 샘플의 I. 컬렉션

여기에서는 Buffalo Green Monkey 신장 세포주를 사용하여 총 배양 가능한 바이러스를 측정하는 절차를 제시합니다. 이 절차는 환경 및 음용수에서 감염성 바이러스의 발생을 측정하기 위한 표준화된 도구를 제공합니다.

엔테로 바이러스 및 문화 RT-qPCR에 의해 물에서 노로 바이러스의 발생의 EPA 방법 1615 측정. II. 총 배양 가능한 바이러스 분석

환경적으로 단단한 표면에서 노로바이러스를 검출하고 정량화하기 위해 매크로폼 기반 샘플링 방법론이 개발되고 평가되었습니다.

표면에 인간의 노로 바이러스의 검출을위한 면봉 표본 추출 방법

인간 아데노바이러스의 스파이크를 사용하여 소량의 물 샘플에 대한 최적의 바이러스 농도 조건을 식별하기 위한 접근 방식이 개발되었습니다. 여기에 설명된 기법은 다른 바이러스 표적에 대한 농도 매개변수를 식별하는 데 사용되며 대규모 바이러스 농도 실험에 적용됩니다.

물에서 바이러스 농도에 대한 작은 볼륨 절차

생산 블리드 워터 (PBW)는 산화 구리 나노 입자 (CuO-NPs)로 처리되고 배양 된 인간 세포에서 세포 독성을 평가했다. 이 프로토콜의 목표는 CuO-NP 처리로 인한 독성의 변화를 평가하는 세포 배양 형식으로 네이티브 환경 샘플을 통합하는 것이 었습니다.

우라늄에서 구리 산화물 나노 입자에 의한 미량 원소의 제거<em&gt; 현장에서</em&gt; 복구 블리드 물과 세포 생존에 미치는 영향

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VacuSIP, 개선 INEX 방법에 대한<em&gt; 현장에서</em&gt; 미립자의 측정 및 용존 화합물은 액티브 서스펜션 피더에 의해 처리

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Tilapia 호수 바이러스를 사용 하 여 기존의 RT-PCR 및 SYBR의 탐지 RT 정량 그린

15N 추적기 연구를 위한 마이크로플롯 설계는 여러 계절식물 및 토양 샘플링 이벤트를 수용하기 위해 설명된다. 15N분석을 위해 연삭 및 계량 프로토콜을 포함한 토양 및 식물 샘플 수집 및 처리 절차가 제시됩니다.

15개의질소 분석을 위한 마이크로플롯 설계 및 식물 및 토양 샘플 준비

학습하세요 RT-qPCR을 이용한 수중 엔테로바이러스 및 노로바이러스 정량 분석 방법입니다. 원심초여과를 통한 바이러스 농축과 역전사 정량 PCR 기법으로 지하수에서 폴리오바이러스 20%, 무는 노로바이러스 30%의 회수율을 달성할 수 있습니다.

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